文摘

OxLDL是被巨噬细胞清道夫受体,包括CD36;我们最近发现Platelet-Activating因子受体(PAFR)也参与其中。自从PAFR巨噬细胞与抑制作用有关,我们检查了oxLDL对巨噬细胞表型的影响。期间发现的存在oxLDL巨噬细胞分化诱导高mRNA水平il - 10,甘露糖受体,PPARγarginase-1和低水平的il - 12和进气阀打开。当人类THP-1巨噬细胞与oxLDL预处理然后用LPS刺激,il - 10和TGF -的生产β显著增加,而il - 6,引发降低。在小鼠TG-elicited巨噬细胞,这个协议没有显著降低,伊诺和COX2的表达。因此,oxLDL诱导巨噬细胞分化和激活或者M2-phenotype激活。在小鼠巨噬细胞,oxLDL诱导TGF -βarginase-1和il - 10 mRNA表达,显著降低了预处理与PAFR拮抗剂(WEB和CV)或CD36抗体。的mRNA表达il - 12、咆哮和CXCL2没有影响。我们显示,此概要的巨噬细胞激活依赖于CD36和PAFR的参与。我们得出这样的结论:oxLDL诱发涉及CD36和PAFR替代巨噬细胞激活的机制。

1。介绍

单核细胞/巨噬细胞的刺激改性低密度脂蛋白(LDL),如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是动脉粥样硬化的早期事件发展。这些巨噬细胞堆积在皮下空间和分化成泡沫细胞(1),导致慢性炎症反应在动脉壁和动脉粥样硬化斑块进展(2]。一些模式识别受体参与oxLDL识别巨噬细胞;CD36是研究最多的之一。

根据刺激巨噬细胞可以获得不同的表型的微环境。M1 Th1细胞因子引起的或经典激活巨噬细胞,表现出高杀微生物的活动和诱发炎症。相比之下,M2或者激活巨噬细胞由Th2细胞因子诱导,导致炎症和组织重构的决议3]。的动脉粥样硬化斑块为巨噬细胞提供了一个复杂的微环境,和这两个种群,M1和M2,被发现在人类病变(4]。它已经表明,M1巨噬细胞是主要地区容易破裂,而M2巨噬细胞主要是检测动脉外膜和稳定斑块区(5]。然而,尚不清楚哪一个角色这样反对功能的巨噬细胞在动脉粥样硬化的进展。M2巨噬细胞表达高水平的CD36和SR-A1,因此能够有效地吸收oxLDL和更容易区分成泡沫细胞(6]。巨噬细胞也表达的受体platelet-activating因子(PAFR),和我们以前的工作表明PAFR作品结合CD36最佳oxLDL吸收和细胞因子的基因表达7]。此外,优先生产观察il - 10的il - 12(提交文章)。

在目前的研究中,我们调查了oxLDL对巨噬细胞分化的影响,活化,表型和CD36和PAFR所扮演的角色。我们发现oxLDL增加替代激活标记,CD36的表达和PAFR参与。

2。方法

2.1。净化和低密度脂蛋白的氧化

伦理委员会批准的这项研究是生物医学科学研究所的圣保罗大学。等离子体是获得normolipidemic志愿者和治疗苯甲脒(2毫米),庆大霉素(0.5%)、氯霉素(0.25%)、phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF)(0.5毫米),和抑肽酶(0.1单位/毫升)。低密度脂蛋白(1.019 - -1.063 g / mL)被连续的超速离心法分离在100000 g在4°C,使用p90at - 0132转子(CP70MX离心器;日立引人入胜有限公司,日本东京)。低密度脂蛋白在4°C透析对PBS和1毫米EDTA (pH值7.4),过滤(0.22μ米),储存在4°C。蛋白质含量是由BCA试剂盒(皮尔斯,美国)。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是通过孵化的低密度脂蛋白(2毫克/毫升)20μM CuSO418 h在37°C。两个协议被终止的氧化的0.5毫米EDTA。

2.2。人类THP-1单核细胞的细胞

单核细胞的线THP-1 rpmi - 1640年培养中补充了5% (v / v)胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,2毫米谷酰胺,15毫米玫瑰,11毫米碳酸氢钠。细胞培养是保持在湿润的气氛中含5%股份有限公司2在37°C。THP-1单核细胞分化成巨噬细胞被150海里佛波醇诱导12-myristate-13-acetate (PMA) 24 h。不依从上层清液的细胞被愿望之后,更换新鲜培养基。实验根据协议进行24 h。

2.3。小鼠巨噬细胞的文化

雄性C57Bl / 6 7 - 10周大的老鼠获得大学免疫学动物设施microisolator圣保罗和被关在笼子里特定的无菌条件下。动物保健和研究协议是按照原则和指导方针通过巴西大学动物实验(COBEA)和批准的生物医学科学研究所/ USP-Ethical动物研究委员会(CEEA)。腹膜渗出物细胞获得由腹腔灌洗后4天注射1毫升3% thioglycolate媒介。液体灌洗是离心机(100×g 10分钟4°C)。细胞浓度调整为2×106细胞/毫升RPMI 1640中,补充了FCS 5%,链霉素(100μ60克/毫升)、青霉素(U /毫升),碳酸氢钠(11毫米)、谷酰胺(2毫米),和玫瑰(20 mM),以下称为RPMI /的边后卫。细胞被留给坚持对微型板块2 h在37°C公司5%2。不依从上层清液的细胞被愿望和更换新鲜培养基。实验根据协议进行。

骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)被戴维斯获得了如前所述,戈登(8),小的修改。总之,股骨刷新了DMEM培养基含有2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素G,和100毫克/毫升链霉素(所有从Gibco,长岛,纽约,美国),使用一个26 G×5′′针。细胞生长在含20% l - 929 cell-conditioned DMEM培养基(LCM)和15% heat-inactivated胎牛血清(FCS), 37°C 5%孵化有限公司2。3天,新鲜与LCM DMEM补充道。巨噬细胞的单层报废6天(96%的细胞阳性CD11b和F4/80)。巨噬细胞在DMEM培养5% FCS一天前进一步的实验。

2.4。量化的一氧化氮

没有生产评估文化上层清液使用亚硝酸盐生产格里斯反应。简单地说,文化上层的孵化与格里斯试剂(0.1% naphthylethylenediamine盐酸盐和1%磺胺在2.5%磷酸,v / v)在室温下10分钟。吸光度是决定使用Dinatech标在540海里。亚硝酸钠的标准曲线是用来确定浓度。

2.5。免疫印迹伊诺和cox - 2的表达

Thioglycolate-elicited巨噬细胞与不同浓度的低密度脂蛋白或治疗oxLDL 24 h,然后用LPS刺激(1μg / mL)。细胞被洗冷PBS和溶菌产物在裂解获得缓冲区(10%诺乃清洁剂p 40, 150毫米氯化钠,10毫米Tris-HCl, pH值7.6,和2毫米0.1% SDS)补充了一个蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和磷酸酶抑制剂(10毫米氟化钠和1毫米原钒酸钠)。蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA分析工具包(美国热科学,罗克福德,IL)。等量的蛋白质sds - page分离10%,转移到Hybond硝化纤维素膜(美国新泽西州通用电气医疗集团)和孵化rabbit-anti-COX-2或rabbit-anti-iNOS(开曼化学,安阿伯市,美国),和鼠标反β肌动蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。作为二级抗体,我们使用antirabbit IgG-HPR(1: 2000)和antimouse-HRP(1: 2000)(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。西方表达可视化使用SuperSignal Pico化学发光底物(美国热科学,罗克福德,IL)。由此产生的放射自显影图分析了AlphaEaseFC软件V3.2β(αInnotech,圣莱安德罗、钙、美国)。

2.6。MTT试验

mitochondrial-dependent减少methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium溴化(MTT)不溶性甲瓒晶体被用来评估细胞的可行性。简而言之,500毫克/毫升的MTT RPMI被添加到细胞治疗后。细胞被孵化3 h在37°C的5%的股份有限公司2的气氛。接下来,10% SDS在0.01 M盐酸溶液添加到细胞溶解晶体,和吸光度测定14 h后使用Dynatech标在570海里。

2.7。实时rt - pcr

在不同时间点细胞收获,总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸生成使用RevertAid首先从总RNA链cDNA合成装备(热科学Fermentas维尔纽斯,立陶宛)。执行实时PCR与Stratagene MxPro3005PTM QPCR系统(美国圣克拉拉的CA),使用SYBR绿色(SYBR绿色主结构,应用生物系统公司,沃灵顿,英国)和特定的引物il - 10,奥,Arg-1 PPAR -γ,进气阀打开,IL-12p40 TGF -β1,咆哮,和GAPDH(表1)。计算了相对基因表达 方法如前所述[9]。数据显示为褶皱的变化相对于内部控制目标基因的表达基因(GAPDH)。

表1
引物序列列表用于实时rt - pcr分析在这项研究。

2.8。检测细胞因子

人类il - 6,引发,il - 10, TGF -β,il - 1β和肿瘤坏死因子-α小鼠il - 10和IL-12p40生产ELISA测定(ELISA包、BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)根据制造商的规格。

3所示。结果与讨论

3.1。oxLDL优先增加LPS-Induced抗炎细胞因子

氧化低密度脂蛋白是根据以前的出版物和获得了高负电荷和TBARS值相比,非转基因的低密度脂蛋白(10]。人类单核细胞的THP-1细胞分化成巨噬细胞使用PMA,其次是oxLDL治疗(20μg / mL);24小时后,他们与LPS刺激(100 ng / mL)额外的24小时。我们发现预处理oxLDL引发的LPS-induced生产下降和il - 6(29%和34%抑制、职责),会使生产的il - 10(2倍增加)和TGF -β(三倍增加),没有明显影响TNF -α和il - 1β生产(图1)。尽管预处理oxLDL没有明显影响LPS-induced TNF的生产α和il - 1β,它降低il - 6和引发和il - 10和TGF -增加β生产表明,oxLDL刺激巨噬细胞向另一种活化表型。

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图1
oxLDL优先增加LPS-induced抗炎细胞因子。与PMA THP-1单核细胞分化成巨噬细胞,其次是oxLDL治疗(20μ24 h g / mL),然后用LPS刺激(100 ng / mL)额外的24小时。通过ELISA上层清液中细胞因子浓度测量。四个独立的数据提出了均值±SEM实验。* 与LPS-stimulated细胞。

众所周知,根据LDL氧化的程度不同,形成不同的产品,不同的生物效应已被归因于进行高、低氧化低密度脂蛋白准备(11- - - - - -13]。在这里,我们使用oxLDL氧化程度高。在这种情况下,磷脂、三酰甘油和胆固醇酯转化为氢过氧化物,与飞机观测反应- 100,导致修改和氨基酸侧链的碎片14,15]。

3.2。oxLDL抑制LPS-Induced不,进气阀打开,cox - 2

我们接下来检查oxLDL对thioglycolate-elicited小鼠巨噬细胞的影响已经表达炎性表型。巨噬细胞与不同浓度的oxLDL治疗24小时,然后用LPS刺激(1μ为额外的24 h g / mL)。图2(一个)表明oxLDL能抑制一氧化氮(NO)生产的LPS诱导剂量依赖性的方式。没有观察到的效应nonoxidized LDL时使用。治疗oxLDL也抑制LPS刺激引起的伊诺和cox - 2的表达(伊诺和cox - 2 52%和55%,分别地。)(数据2 (b)和2 (c))。oxLDL的抑制效应不相关的细胞活力,减少评估通过测量MTT测定线粒体活动,实际上增加了在oxLDL-treated巨噬细胞(图2 (d))。

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图2
oxLDL治疗抑制LPS-induced不,进气阀打开,cox - 2。Thioglycolate-elicited小鼠巨噬细胞与不同浓度的低密度脂蛋白或治疗oxLDL 24 h,然后用LPS刺激(1μ为额外的24 h g / mL)。(一)由格里斯测定一氧化氮产量进行了分析。(b)伊诺和cox - 2表达被免疫印迹分析和蛋白质表达被AlphaEase FC量化软件,V3.2β(αInnotech)。放射能照像显示一个有代表性的实验,* 与LPS刺激细胞。(c)细胞生存能力是衡量MTT测定,* 比较oxLDL-treated和参与细胞。数据提出了均值±SEM六个独立的实验。

虽然oxLDL粒子与促炎的相关机制与动脉粥样硬化的发展(2),我们的数据表明,oxLDL增加抗炎和降低LPS引起的炎性标记物,有利于对M2巨噬细胞分化表型。鞘氨醇等化合物存在于oxLDL粒子1-phosphate (S1P)和氧化1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (oxPAPC)抑制TLR2和TLR4激活,分别为(16,17]。复杂性参与这种机制可以解释为不同化合物之间的相互作用后形成的氧化过程与不同受体存在于巨噬细胞。

3.3。在巨噬细胞分化诱导oxLDL M2的存在表型

鼠骨骨髓来源的细胞分化为巨噬细胞(BMDM) L929上层清液的六天oxLDL的存在。细胞治疗oxLDL (20μg / mL)的第一天每两天文化和补充。我们发现巨噬细胞治疗oxLDL mRNA表达高水平的il - 10 M2巨噬细胞标记,arginase-1 (Arg-1)、甘露糖受体(MR)和PPARγ和减少白介素mRNA的表达对伊诺mRNA(图没有影响3)。这表明存在oxLDL在巨噬细胞表型分化转向M2概要文件。

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图3
对M2 oxLDL诱发巨噬细胞分化表型。鼠骨骨髓来源的细胞分化为巨噬细胞(BMDM) L929上层清液的六天oxLDL的存在。细胞治疗oxLDL (20μg / mL)的第一天每两天文化和补充。的mRNA表达il - 10, arginase-1 (Arg-1)、甘露糖受体(MR), PPARγ、IL-12p40伊诺被实时PCR进行评估。独立实验数据提出了均值±SEM和表达的褶皱变化。* 比较oxLDL-treated和参与细胞。
3.4。参与PAFR CD36 oxLDL-Induced M2所需表型

在先前的研究中,我们发现PAFR聚集有关,CD36需要最佳的巨噬细胞活化诱导oxLDL [7]。在这里,我们调查了如果两个受体参与M2表型的诱导。小鼠BMDM服用PAFR拮抗剂(WEB2086或CV3988)单独或结合抑制性抗体为30分钟,然后处理CD36 oxLDL (20μg / mL) 5 h。图4(一)表明oxLDL诱导的表达TGF -β和Arg-1信使rna,这是由PAFR拮抗剂(TGF -治疗逆转β:抑制36%和45%;__arg1: 57%和50%抑制网络和简历,职责)。堵塞CD36 TGF -的mRNA表达减少β(56%)。同时堵塞CD36和PAFR没有进一步减少Arg-1 TGF -β信使rna表达。oxLDL也诱导表达的咆哮和CXCL2,但这并不影响治疗PAFR拮抗剂或CD36抑制性抗体。接下来,我们检查PAFR和CD36 il - 10、il - 12的要求生产。确保生产检测这些细胞因子的水平,有限合伙人的细胞被激活。BMDM使用CD36的抑制性抗体,或结合PAFR拮抗剂与oxLDL隔夜刺激(20之前30分钟μg / mL)其次是与LPS激活(10 ng / mL)。图4 (b)表明oxLDL增加了LPS-induced il - 10,但并不影响il - 12的生产。此外,il - 10浓度强烈降低CD36的PAFR拮抗剂WEB和CV和抑制性抗体。

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图4
参与PAFR CD36 oxLDL-induced M2所需表型。小鼠BMDM使用PAFR拮抗剂WEB2086 (50μ米)或CV3988 (10μ米)单独或结合阻滞剂抗体CD36(1: 500)为30分钟,然后接受oxLDL (20μg / mL)。(a)的mRNA表达TGF -βArg-1咆哮和CXCL2 5 h后被实时PCR分析。(b) BMDM治疗与oxLDL一夜之间,然后用LPS刺激(10 ng / mL)。il - 10、il - 12在上层清液生产评估ELISA检测。* 比较oxLDL-treated参与细胞# 与oxLDL-treated细胞。

我们的结果表明,CD36和PAFR都参与生产il - 10。尽管一些受体可能参与oxLDL识别(18引起的),il - 10的upregulation oxLDL主要取决于CD36 PAFR以来,在目前的研究中,细胞因子的生产几乎完全被PAFR拮抗剂治疗和CD36抗体。它被描述oxLDL诱发精氨酸酶表达和活动在巨噬细胞和内皮细胞(19,20.]。我们这里显示PAFR拮抗剂减少Arg-1和TGF -β1 mRNA表达oxLDL引起的,表明PAFR激活诱导选择需要激活巨噬细胞的标记。动脉粥样硬化的特点是一种慢性炎症反应在动脉壁,激活巨噬细胞两种形式,古典和替代,被发现在动脉粥样硬化病变4]。M1巨噬细胞主要存在于区域容易破裂,而M2巨噬细胞在动脉外膜,M1和M2存在于纤维帽(5]。然而,真正的函数每个巨噬细胞的人口仍然需要阐明。在动脉粥样硬化斑块,低密度脂蛋白有不同形式的修改。在这里,我们发现,低密度脂蛋白氧化程度高的增加抗炎标记PAFR——CD36-dependent的方式。我们不排除这种想法,额外的机制可能导致oxLDL-induced M1和M2巨噬细胞分化到表现型。可以推测的是平方米斑块中巨噬细胞的存在的有机体企图控制炎症反应;在这种情况下,将参与atheroprotection PAFR。然而,M2巨噬细胞表达更多CD36 [4,6),更有可能成为泡沫细胞,造成动脉粥样硬化的病理生理学21]。此外,这些细胞在高脂质更敏感的环境,如脂质核心的动脉粥样硬化斑块6]。

4所示。结论

在目前的研究中,我们表明,oxLDL诱发巨噬细胞向另一种分化表型,这需要PAFR和CD36的参与。实函数的M2巨噬细胞在动脉粥样硬化的发展尚不清楚,在活的有机体内研究使用PAFR拮抗剂在暗示他们需要作为治疗动脉粥样硬化的治疗方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府(格兰特2006/03982-5)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)。