文摘

丝氨酸蛋白酶在炎症被认为是发挥重要作用通过蛋白酶激活受体(PARs)。然而,对丝氨酸蛋白酶的影响和帕尔斯在TNF分泌高纯度T细胞。我们挑战人类外周血T细胞与丝氨酸蛋白酶和肽受体激动剂的部分和测量的TNF水平文化上层清液通过ELISA。结果表明,凝血酶和胰蛋白酶,但不是类胰蛋白酶,刺激肿瘤坏死因子释放增加约2.5倍16 h孵化后T细胞。蛋白酶抑制剂和PAR-1拮抗剂原理图79797年几乎完全废除凝血酶和trypsin-induced TNF释放T细胞。受体激动剂PAR-1肽,但不是杆从T细胞诱导肿瘤坏死因子释放。此外,胰蛋白酶,thrombin-induced调节观察TNF的表达在CD4 + il - 4 +,或CD25 + T细胞,但不是在干扰素+或IL-17 + T细胞。信号通路MAPK / ERK和PI3K / Akt是参与凝血酶和trypsin-induced TNF释放T细胞。总之,凝血酶和胰蛋白酶能引起肿瘤坏死因子释放il - 4 + CD25 + T细胞通过激活PAR-1因此有助于调节身体的免疫反应和炎症。

1。介绍

Proteinase-activated受体(PARs)属于一个家庭与七个跨膜域G-protein-coupled受体激活通过蛋白水解乳沟的丝氨酸蛋白酶(1]。共有四部分已确定和克隆。其中,PAR-1 [2,3),三杆(4),4杆(5)目标凝血酶、胰蛋白酶和组织蛋白酶G,而杆对凝血酶,但可以通过胰蛋白酶激活,肥大细胞类胰蛋白酶(6,7),中性粒细胞弹性蛋白酶(8),昆虫蛋白酶(9]。

帕尔斯表达了各种细胞参与炎症和免疫反应,如血管内皮细胞、上皮细胞、肥大细胞、T细胞,单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(10,11]。在这些细胞,激活PARs影响他们的主要功能如扩散、脱粒、炎症介质的释放10,11]。在我们之前的研究12),显示PAR-1的表达,杆,和三杆T细胞,与凝血酶、胰蛋白酶和tryptase-induced白介素(il - 6)释放T细胞。它也被报道,细胞质免费钙和磷脂酶C和蛋白激酶C的激活增加T-leukemic细胞株与凝血酶刺激后或凝血酶受体激动剂肽(13]。凝血酶、凝血酶受体激动剂也增强CD69表达和产品通过交联- 2 T细胞受体Jurkat T细胞和外周血淋巴细胞(14]。因此,我们预期,凝血酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶可能引起肿瘤坏死因子从T细胞通过释放帕尔斯。

肿瘤坏死因子是一个重要的促炎细胞因子被认为是重要的在哮喘的发病机制15),食物过敏(16),眼部过敏(17),和过敏性皮炎(18]。据报道,肿瘤坏死因子表达的细胞数量的增加和TNF水平中观察支气管肺泡灌洗(BAL)和哮喘患者的气道(19]。吸入TNF增加气道反应在哮喘受试者醋甲胆碱与痰嗜中性(20.]。自从帕尔斯、TNF和T细胞在炎症中扮演角色,我们相信,他们之间一定有联系。本研究的目的是探讨凝血酶、类胰蛋白酶,胰蛋白酶、弹性蛋白酶,兴奋剂的PARs TNF分泌的多肽纯化人类T细胞和T细胞亚型。

2。材料和方法

2.1。试剂

人类凝血酶、胰蛋白酶(具体活动:~10000 BAEE U /毫克蛋白),大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)与牛血清白蛋白(BSA,分数V)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。重组水蛭素和人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(具体活动:20 MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA U /毫克蛋白)是获得Calbiochem(美国圣地亚哥,CA)。重组人类肺β类胰蛋白酶(具体活动:~1000牛αCBZ-L-Lysine Thiobenzyl酯U /毫克蛋白)是来自Promega (WI麦迪逊,美国)。原理图79797年从Tocris Cookson (Ellisville,密苏里州,美国)。兴奋剂肽支护结构,扭转形式,和杆拮抗剂肽FSLLRY-NH2合成在CL Bio-Scientific Inc .(西安,中国)。活跃的序列和反向肽PAR-1, SFLLR-NH2和RLLFS-NH2,TFLLRN-NH2和NRLLFT-NH2;杆,SLIGKV-NH2和VKGILS-NH2以及反式肉桂酰-LIGRLO-NH (tc)2和tc-OLRGIL-NH2;三杆,TFRGAP-NH2和PAGRFT-NH2。RPMI 1640和新生牛血清(nc)获得GIBCO(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Ficoll-Paque +来自Amersham生物科学(乌普萨拉,瑞典)。PE-conjugated鼠标反CD3单克隆抗体,PE-conjugated goat-anti兔免疫球蛋白,和TNF OptEIA ELISA试剂盒购自BD PharMingen(美国加利福尼亚州圣何塞)。我染色试剂盒试剂和SYBR绿色从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。细胞活化的细胞外信号包signal-regulated激酶(ERK), 2 - (2-diamino) 3-methoxyphenyl-4h-1-benzopyran-4-one (PD98059),一种蛋白激酶,PI3K和P38 2 - (4-morpholinyl) 8-phenyl-4h-1-benzopyran-4-one (LY294002)从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。ExScript RT试剂盒和SYBR预混料Taq交货(完美的实时)从豆类(中国大连)。兔子反PAR-1和兔anti-huamn杆多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。FITC-conjugated鼠标反CD4单克隆,PE-conjugated鼠标反CD8单克隆,Percp-cy5.5-conjugated鼠标反TNF单克隆,FITC-conjugated鼠标反干扰素单克隆,PE-conjugated鼠标反il - 4的单克隆,APC-conjugated鼠标反CD25单克隆,又APC-conjugated鼠标反IL-17单克隆抗体是从eBioscience购买的。淋巴细胞隔离设备我来自Miltenyi研究(Bergisch格拉德巴赫,德国)。所有其他试剂的分析品位和获得σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。隔离和T细胞的文化

人类T细胞分离外周血单核细胞(PBMCs)的mac系统T细胞隔离设备我根据制造商的协议。总之,PBMCs孤立从健康志愿者捐赠的新鲜血液,从每个每次100毫升。每个志愿者的知情同意,同意的伦理委员会南京医科大学第一附属医院。分开后红细胞Ficoll-Paque密度梯度,PBMCs收集和孵化microbead-linked anti-CD3单克隆抗体15分钟8°C。CD3 + T细胞与其他细胞分离,通过磁性细胞分离系统。纯度分析,细胞在PBS和孵化resuspended PE-conjugated对人类CD3单克隆抗体1 h。T细胞的纯度一直超过95%,细胞生存能力98%以上。纯化CD3 + T细胞被进一步用于单元测试的挑战。

2.3。纯化t细胞的挑战

T细胞培养在24-well文化板块5×10的密度5细胞/在RPMI 1640中含10% nc在37°C 2 h公司为5%2,分别。文化上层清液被移除和细胞被洗两次用新鲜血清RPMI 1640中300 g的10分钟。挑战实验,细胞暴露于各种剂量的凝血酶(0.01 - -3.0μ0.5克/毫升,1 U =μg, 1 U /毫升= 5.6 nM, U = NIH单位),胰蛋白酶(0.01 - -0.3μg / mL, 1μ克/毫升= 42海里),类胰蛋白酶(0.25 - -2.0μg / mL, 1μ克/毫升= 7.4 nM)和弹性蛋白酶(0.01 - -0.3μg / mL, 1μ克/毫升= 34海里,1 U /毫升= 1700海里)有或没有抑制剂;和受体激动剂PAR-1肽,杆和三杆(0.1 -100μM)和反向肽,分别为16 h文化之前,上层的收获和储存在−40°C到使用。细胞颗粒被用于流式细胞术分析。

2.4。实时PCR分析纯化肿瘤坏死因子基因表达的T细胞

量化在T细胞肿瘤坏死因子mrna的表达是由实时PCR后生产的协议。简单地说,从总RNA合成cDNA后通过使用ExScriptTM RT试剂盒,实时PCR是由使用SYBR预混料Taq交货7000年ABI棱镜序列检测系统(珀金埃尔默应用系统,促进城市,CA,美国)。每个反应包含12.5μL 2×SYBR绿色主结构,1μL (10μM的引物1μL的cDNA、25的总量μl .热循环条件包括初始变性步骤在50°C 2分钟,10分钟95°C;40周期为15秒95°C,退火温度在60°C 30年代和30年代在72°C扩展。

肿瘤坏死因子和PCR引物序列 肌动蛋白5′-CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3′(向前)和5′-GGTTTGCTACAACATGGGCTACA-3′(反向);5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′(向前),和5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′(反向),分别。

因此,PCR循环结束时,放大产品的特异性由解离曲线控制分析。mRNA的表达在每个样本终于修正后确定β肌动蛋白的表达。基因的特定阈值周期(Ct)为每个样本(ΔCt)纠正减去Ct看家基因β肌动蛋白。未经处理的控制被选为参考样本,减去了所有实验样品的ΔCtΔCt控制样品(ΔΔCt)。级测试基因mRNA表达的变化 。每个测量的一个示例是在重复进行。

2.5。免疫印迹分析纯化T细胞的信号转导途径

T细胞是preincubated 50μM PD98059, 20μM LY294002或介质仅30分钟前加入凝血酶3.0μ0.3 g / mL,胰蛋白酶μg / mL,或中等仅30分钟,2 h、6 h。细胞细胞溶解在一个缓冲区包含20毫米Tris-HCl (pH值7.4),137 mM的生理盐水、10%甘油、1% Triton x - 100, 2毫米的EDTA, 25毫米β甘油磷酸盐、焦磷酸钠的2毫米和0.5毫米的二硫苏糖醇在4°C 30分钟。细胞溶解产物的碎片被离心12000 g×10分钟。相同数量的上层的涨跌互现2 x钠十二烷基硫酸盐(SDS)样品缓冲和10分钟加热到100°C。同等体积的样品分离通过sds - page 10%丙烯酰胺凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜Bio-Rad传输系统中,根据制造商的指示。后阻断特异性的结合位点与5% BSA TBST(50毫米三、0.15 M的氯化钠,渐变20 0.1%,pH值7.6)1 h,膜与phospho-ERK1/2探测,phospho-Akt, phospho-p38,或在4°C phospho-PI3k抗体一夜之间,其次是孵化HRP-conjugated二级抗体。免疫反应性的乐队是由使用可视化增强化学发光试剂根据制造商的协议。微的免疫印迹分析进行了使用数量一个软件(美国Bio-Rad)。

2.6。细胞因子的测定

肿瘤坏死因子的水平在文化浮在表面的测量与OptEIA ELISA试剂盒根据制造商的指示。板块在一盘读者(分子装置,门洛帕克,CA)将Softmax数据分析程序。肿瘤坏死因子的最小检测浓度为2.2 pg / mL。

2.7。流式细胞术分析

测试PAR1和2表情胰蛋白酶和凝血酶治疗后,孤立的T细胞是颗粒状的离心10分钟450克3.0与凝血酶细胞被刺激后μ0.3 g / mL,胰蛋白酶μg / mL,或中等仅16 h。PAR1 PAR2染色,细胞被孵化与兔子反PAR1或PAR2抗体在37°C 1 h。洗后,细胞被孵化PE-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体37°C 45分钟。洗后,分析了细胞fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)与CellDevia arial流式细胞分析仪软件(美国BD生物科学)。

测试的分泌TNF亚型的T细胞,孤立的T细胞是颗粒状的离心10分钟,然后固定和450克permeabilized通过使用细胞固定/透化作用工具包(BD Pharmingen)。简单地说,在100年彻底resuspended细胞补充道μL (BD Cytofix / Cytoperm解决方案在4°C和孵化20分钟。细胞培养与荧光标记反CD4、CD8、CD25、肿瘤坏死因子、干扰素、il - 4,分别和IL-17单克隆抗体或同位素控制(在最后的浓度4μ在4°C g / mL) 30分钟。洗后,分析了细胞fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)与CellDevia Arial流式细胞分析仪软件(美国BD生物科学)。

2.8。统计分析

结果显示为±SEM。组之间的差异测试使用学生的意义 以及。 作为具有统计学意义。所有统计数据进行SPSS 13.0窗口(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。肿瘤坏死因子诱导释放丝氨酸蛋白酶的纯化T细胞

T细胞的纯度一直超过95%(日期补充材料所示,图S1)。它已经表明,凝血酶、胰蛋白酶和释放类胰蛋白酶能引起促炎细胞因子il - 6 T细胞(12),但所知甚少的丝氨酸proteinase-induced TNF释放T细胞。在这里,我们表明,凝血酶浓度的1.0和3.0μg / mL引起肿瘤坏死因子释放后T细胞16 h潜伏期剂量依赖性的方式。增加约2.5倍观察TNF释放当T细胞孵化与凝血酶16 h。6小时孵化后,数据(没有显示)基底和诱导肿瘤坏死因子释放T细胞是不一致的。这很可能是因为检测灵敏度的限制和相对较低的TNF分泌。SFLLR-NH PAR-1兴奋剂肽2在100年的浓度μM和TFLLRN-NH2在5的浓度μM,诱导显著释放肿瘤坏死因子在孵化后16 h。然而,RLLFS-NH2SFLLR-NH反向肽2,NRLLFT-NH2TFLLRN-NH反向肽2,几乎没有影响释放肿瘤坏死因子的T细胞(图1(一))。

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(b)
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图1
感应的TNF分泌人类净化T细胞由凝血酶和胰蛋白酶。细胞培养与各种浓度的凝血酶(a) (Th,μg / mL), SFLLR (μ米),TFLLRN (μ米),他们的反向肽RLLFS (μ米),NRLLFT (μ米),(b)胰蛋白酶(Ts,μg / mL)抑制剂的存在与否,分别为16 h 37°C。值显示为4到6个独立意味着±SEM实验从不同的捐赠者。* 相比之下,独自应对媒介控制。__ 相比之下,独自应对相应的蛋白酶。Hir =水蛭素(U /毫升),TI = SBTI (μg / mL),同步信道= 79797原理图(μ米)。

水蛭素,一个特定的凝血酶抑制剂,能抑制thrombin-induced肿瘤坏死因子的分泌。大约82.4%抑制thrombin-induced分泌TNF时观察到3.0μ凝血酶和10 U g / mL /毫升的水蛭素被添加为16 h T细胞。水蛭素单独在浓度测试从T细胞对肿瘤坏死因子分泌影响很小。原理图79797年PAR-1拮抗剂在1的浓度μ米,抑制89% thrombin-induced TNF释放T细胞(图1(一))。

同样,胰蛋白酶浓度的0.3μg / mL诱导T细胞的肿瘤坏死因子释放增加2.3倍(图16 h1 (b))。然而,类胰蛋白酶浓度高达2μg / mL和弹性蛋白酶6 U /毫升浓度没有影响TNF释放T细胞(数据没有显示)。浓度的胰蛋白酶抑制剂,SBTI 10和30μ0.3 g / mL,消除μg / mL trypsin-induced TNF释放值94.8和94.2%,分别。SBTI独自在浓度测试从T细胞对肿瘤坏死因子分泌影响很小。原理图79797年PAR-1拮抗剂在1的浓度μ米,抑制96.8% trypsin-induced TNF释放T细胞(图1 (b))。

受体激动剂肽杆和TFRGAP-NH SLIGKV2,一个兴奋剂肽浓度的三杆100μ米,没有任何影响TNF释放T细胞(数据没有显示)。

3.2。实时PCR分析肿瘤坏死因子mRNA的表达纯化T细胞

为了证实上述发现,我们调查了丝氨酸蛋白酶的影响在T细胞肿瘤坏死因子mRNA的表达。这是发现肿瘤坏死因子mRNA的表达与凝血酶调节T细胞孵化时1和3μ2和6 h g / mL。最大增强肿瘤坏死因子mRNA的表达在基线控制(图4.2倍2(一个))后6 h孵化。水蛭素,一个特定浓度的凝血酶抑制剂3 U / mL,完全废除thrombin-induced调节肿瘤坏死因子mRNA的表达后6 h孵化(图2 (b))。

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图2
诱导T细胞调节肿瘤坏死因子mRNA的表达纯化凝血酶和胰蛋白酶。(一)细胞培养与不同浓度的凝血酶(Th,μg / mL),胰蛋白酶(Ts,μSFLLR-NH g / mL)2(科幻小说,μ米),TFLLRN-NH2(TF,μ米)30分钟,2 h、6 h在37°C。(b)和Th细胞孵化(μg / mL)和Ts (μg / mL)抑制剂的存在与否,分别为6小时37°C。值显示为4到6个独立意味着±SEM实验从不同的捐赠者。* 相比之下,独自应对媒介控制。__ 相比之下,独自应对相应的蛋白酶。Hir =水蛭素(U /毫升),TI = SBTI (μg / mL),同步信道= 79797原理图(μ米)。

胰蛋白酶浓度的0.3μg / mL也诱导肿瘤坏死因子mRNA的表达增加了一个价值大约在T细胞(图4.0倍2(一个)),它完全被SBTI(图2 (b))。同样,原理图79797 1的浓度μM抑制凝血酶和trypsin-induced调节T细胞的肿瘤坏死因子mRNA的表达值72和72.5%,分别为(图2 (b))。

SFLLR-NH2在100年的浓度μM和TFLLRN-NH2在5的浓度μM显著提高肿瘤坏死因子mRNA的表达在2和6 h后孵化(图2(一个))。但RLLFS-NH2SFLLR-NH反向肽2,NRLLFT-NH2TFLLRN-NH反向肽2对肿瘤坏死因子mRNA的表达影响很小,T细胞(数据没有显示)。

同时,凝血酶和胰蛋白酶对PAR-1的表达显示明显的影响,杆(数据没有显示)。

3.3。调节T细胞的子类型中TNF的表达

著名的,有很多亚型的T细胞和他们每个人都有独特的功能。因此,我们调查亚型的T细胞流式细胞分析仪分析以确定的亚型移植肿瘤坏死因子胰蛋白酶或凝血酶的反应。结果表明,胰蛋白酶和凝血酶诱导调节CD4 + T细胞肿瘤坏死因子的表达式,但不是CD8 + T细胞,后16 h潜伏期。中CD4 + T细胞,胰蛋白酶和凝血酶增强TNF表达il - 4 +或CD25 + T细胞,但不是在干扰素+或IL-17 + T细胞。原理图79797能抑制胰蛋白酶和凝血酶引起的增强TNF表达(数字3(一个)和3 (b))。

(一)
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图3
感应子类型的调节TNF的表达纯化T细胞。孤立的T细胞是孵化与胰蛋白酶或凝血酶16 h在37°C被流式细胞分析仪分析。(a)大型封闭区域内的数字表明TNF表达细胞的百分比在不同亚型的T细胞。(b)均值±SEM数据代表TNF +细胞的比例在不同亚型的T细胞显示四个独立的实验。* 与媒介相比单独控制。__ 相比之下,应对相应的无拘束的控制。
3.4。PD98059和LY294002对释放的影响和TNF基因表达

为了研究信号转导途径的凝血酶和胰蛋白酶,T细胞与PD98059 preincubated, LY294002或中加入凝血酶前30分钟就达3.0μ0.3 g / mL,胰蛋白酶μg / mL,或中等仅16 h。16 h潜伏期后,PD98059 MAPK通路的抑制剂,和LY294002, PI3K的抑制剂,完全阻止凝血酶和trypsin-induced释放肿瘤坏死因子(图4(一))。

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图4
PD98059和LY294002对释放的影响和TNF基因表达纯化T细胞。PD98059 (PD, 50μ米)或LY294002 (LY, 20μ米)与T细胞在37°C preincubated 3.0前30分钟μ凝血酶和0.3 g / mLμ克/毫升的胰蛋白酶添加6或16 h。(一)细胞收集用于分析T细胞的肿瘤坏死因子释放孵化后16小时。(b)收集细胞肿瘤坏死因子基因表达分析的T细胞在孵化后6 h。值显示为4到6个独立意味着±SEM实验从不同的捐赠者。* 相比之下,独自应对媒介控制。__ 相比之下,独自应对相应的蛋白酶。Th =凝血酶(μg / mL), Ts =胰蛋白酶(μLY = LY294002 (g / mL),μ米),PD = PD98059 (μ米)。

此外,PD98059抑制凝血酶和trypsin-induced upregulation肿瘤坏死因子mRNA的表达值91.2和98.6%,和LY294002消除凝血酶,trypsin-induced肿瘤坏死因子mRNA的表达95.5和83.2% T细胞后6 h孵化(图4 (b))。

3.5。在纯化PD98059对ERK的磷酸化的影响T细胞

凝血酶(3μg / mL)和胰蛋白酶- (0。3μg / mL)诱导增强的磷酸化ERK1/2 0.5后T细胞,2,6 h潜伏期。然而,凝血酶和胰蛋白酶没有明显影响磷酸化P38的T细胞后0.5,2,6 h潜伏期(日期补充材料所示,图S2)。PD98059能够完全阻止凝血酶和trypsin-induced磷酸化ERK1/2 preincubated时30分钟的T细胞。PD98059也抑制基底的磷酸化ERK1/2在T细胞(图5)。

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图5
免疫印迹分析PD98059对凝血酶的影响,trypsin-induced磷酸化ERK的纯化T细胞。PD98059 (PD, 50μ米)与T细胞在37°C preincubated 3.0前30分钟μ凝血酶和0.3 g / mLμ克/毫升的胰蛋白酶添加30分钟和2和6 h。(一)细胞治疗与凝血酶和胰蛋白酶2 h。(b)的相对水平phospho-ERK1/2被表示成比例β肌动蛋白,一个内部控制(房子保持蛋白质)。显示值均值±SD为四个独立的实验。* 相比之下,反应介质。__ 相比之下,独自应对相应的蛋白酶。
3.6。LY294002对一种蛋白激酶磷酸化的影响在纯化T细胞

凝血酶的浓度3μg / mL和胰蛋白酶浓度为0.3μg / mL诱导T细胞显著增加一种蛋白激酶的磷酸化后0.5,2,6 h潜伏期。然而,凝血酶和胰蛋白酶没有明显影响的磷酸化PI3k在0.5后T细胞,2,6 h潜伏期(日期补充材料所示,图S3)。LY294002能够阻止凝血酶和trypsin-induced一种蛋白激酶的磷酸化与T细胞中培养时,它的30分钟。LY294002也减少基底在T细胞(图一种蛋白激酶的磷酸化6)。

(一)
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(b)
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图6
免疫印迹分析LY294002对凝血酶的影响,trypsin-induced磷酸化纯化AKT的T细胞。LY294002 (LY, 20μ米)与T细胞在37°C preincubated 3.0前30分钟μ凝血酶和0.3 g / mLμ0.5克/毫升的胰蛋白酶被添加,2,6 h。(一)细胞治疗与凝血酶和胰蛋白酶2 h。(b)的相对水平phospho-Akt被表示成比例β肌动蛋白,一个内部控制(管家蛋白)。显示值均值±SD为四个独立的实验。* 相比之下,反应介质。__ 相比之下,独自应对相应的蛋白酶。

4所示。讨论

我们发现在目前的研究中丝氨酸蛋白酶凝血酶和胰蛋白酶,但不是类胰蛋白酶人类T细胞诱导肿瘤坏死因子释放。由于肿瘤坏死因子是一个有效的促炎细胞因子,我们观察可能会添加一些新的信息,理解行为导致炎症的丝氨酸蛋白酶。

仅为1.0μ克/毫升的凝血酶能够诱发显著的肿瘤坏死因子释放T细胞,表明TNF的蛋白酶是一种有效的促分泌素。这血凝血酶的浓度应该很容易实现,特别是当血小板聚集和凝固过程的启动(21]。抑制thrombin-induced TNF释放特定的凝血酶抑制剂和水蛭素表明凝血酶的作用在T细胞是依赖于丝氨酸蛋白酶的酶活性。有3对凝血酶受体细胞,包括PAR-1、三杆,和4杆(2,3]。自从PAR-1兴奋剂肽SFLLR-NH2 TFLLRN-NH2,但不是三杆兴奋剂肽TFRGAP-NH2能够刺激肿瘤坏死因子释放,PAR-1拮抗剂原理图7979722)几乎完全废除thrombin-induced TNF从T细胞,释放和净化人类T细胞不表达4杆;凝血酶的作用在T细胞通过激活PAR-1最有可能。我们以前的报告发现thrombin-induced il - 6分泌从人类外周血T细胞可能支持我们当前的研究(16]。

虽然小的信息可以在TNF诱导释放T细胞通过胰蛋白酶,胰岛素刺激的能力从T细胞il - 6分泌16]可能支持胰蛋白酶的期望是能够诱导细胞因子释放T细胞。仅为0.3μ克/毫升的胰蛋白酶能引起肿瘤坏死因子T细胞分泌物证明它是一种潜在的刺激质肿瘤坏死因子释放。至于凝血酶、胰蛋白酶的抑制剂SBTI能够抑制trypsin-induced TNF释放T细胞,表明一个完整的催化部位需要刺激肿瘤坏死因子释放的丝氨酸蛋白酶。由于PAR-1三种受体的胰蛋白酶,PAR-1兴奋剂肽SFLLR-NH2和TFLLRN-NH2能够刺激T细胞肿瘤坏死因子释放,和原理图79797年几乎完全废除trypsin-induced TNF释放T细胞,T细胞胰蛋白酶的作用是通过激活PAR-1最有可能。胰蛋白酶的杆也是一个受体。因为杆SLIGKV-NH肽受体激动剂2和类胰蛋白酶并不能够刺激T细胞肿瘤坏死因子释放,胰蛋白酶的作用在T细胞不可能通过激活的杆。

胰蛋白酶和thrombin-induced调节观察TNF的表达在CD4 + il - 4 +或CD25 + T细胞,表明il - 4 + CD25 + T细胞是肿瘤坏死因子的主要来源。而小信息CD25 + T细胞和肿瘤坏死因子之间的关系,研究发现CD4(+)的百分比CD25 (+) T细胞明显高,但FoxP3(+)细胞的百分比低过敏性鼻炎患者,il - 4, IL-5,在鼻腔灌洗液体和TNF水平高表明TNF释放的增加可能是CD4 + CD25 (+), nonregulatory T细胞(23]。我们认为,当前的研究是第一个工作证明coexpression CD25和TNF的CD4 (+) T细胞的亚型。同样,我们明显发现il - 4 + T细胞表达增强TNF,虽然信息co-expression il - 4和肿瘤坏死因子的T细胞。这一发现引起胰蛋白酶和凝血酶可能参与炎症通过诱导肿瘤坏死因子释放il - 4 + CD25 + T细胞。这是证明nickel-specific CD4 + T细胞系(24)和Th17细胞(25]corelease IL-17和肿瘤坏死因子,但胰蛋白酶,thrombin-induced TNF释放似乎不是来自IL-17 + T细胞在IL-17 TNF表达+ T细胞不是由这两个调节蛋白酶。

MAPK / ERK通路是最有可能的信号通路参与凝血酶和trypsin-induced TNF释放高纯度T细胞,PD98059、MAPK / ERK通路的抑制剂,几乎完全阻止凝血酶和trypsin-provoked phophorylation ERK和肿瘤坏死因子的释放。而小信息信号通路与纯化PAR-1信号有关T细胞是可用的,前面的报道,PAR-1受体激动剂激活MAPK / ERK和p38 MAPK信号通路在真皮26和心脏成纤维细胞27可能支持我们目前的观察,MAPK / ERK通路是最有可能的信号通路参与凝血酶和trypsin-induced TNF释放。此外,PI3K / Akt信号通路似乎也参与凝血酶和胰蛋白酶诱导肿瘤坏死因子分泌,如LY294002 PI3K / Akt信号通路的抑制剂部分减少凝血酶和胰蛋白酶诱导肿瘤坏死因子分泌,完全废除了凝血酶和胰蛋白酶激起了一种蛋白激酶的磷酸化。这一发现是在同一个报告,这表明凝血酶刺激增强PI3K活动仓鼠胚胎成纤维细胞(28),但不同于我们以前的报告,这表明凝血酶没有增强的PI3K活动在人类皮肤成纤维细胞(29日]。这些研究之间的差异可能是由于不同的细胞起源和物种。

TNF是肽组成的介质越来越多家庭成员至少19细胞因子,包括淋巴毒素-α、Fas配体和CD40配体。家庭是现在认为是中央的广泛的生物活性介质保护性免疫反应对各种传染病的病原体。另一方面,TNF也施加host-damaging效应在脓毒症和自身免疫性疾病(30.,31日]。这些发现表明,肿瘤坏死因子是一种重要的炎症介质,因此,我们目前的研究是重要的理解TNF-related炎症和proteinase-induced机制在T细胞细胞因子生产。

5。结论

总之,目前的研究中发现,丝氨酸蛋白酶凝血酶和胰蛋白酶的有力刺激TNF分泌高纯度的T细胞。他们的行为在T细胞依赖酶的活动,可能通过激活PAR-1。从T细胞刺激TNF分泌丝氨酸蛋白酶进一步证明这些蛋白酶积极参与炎症的发病机制和调节免疫反应的人。

确认

这个项目是由中国国家自然科学基金的资助(30972714号,30972822,81001329,81172836,81030054,和81273274)和项目优先资助的学术程序开发江苏高等教育机构。