文摘

单核细胞表达许多细胞表面标记指示性的炎症和激活状态。这些标记是否受糖尿病及其并发症是未知的,在这个研究调查。血从22日获得非糖尿病患者和糖尿病患者43糖尿病》十年,期间包括25没有与临床上重要的并发症和18。CD45的数量⁺CD14⁺单核细胞和百分比表达促炎标记CD16通过流式细胞仪测定。其他标记的单核细胞趋化因子受体的激活和表达也检查了。单核CD16之间的关系和临床数据,选定的细胞因子和趋化因子也被调查。糖尿病对总白细胞数没有影响,但增加单核细胞数量。糖尿病也显著减少CD16的数量⁺单核细胞只有在那些与糖尿病并发症。其他标记的单核细胞活化状态和趋化因子受体并不影响糖尿病或并发症的地位。糖尿病引起的糖尿病患者血浆促炎细胞因子和他们较低的并发症比那些没有并发症。这些结果表明,循环单核细胞表型改变了糖尿病并发症的地位。这些变化可能是有因果联系,可能被用来预测对糖尿病并发症。

1。介绍

糖尿病的并发症负责相关的发病率和死亡率。具有里程碑意义的研究表明,糖尿病并发症的风险增加血糖控制较差和疾病持续时间(1- - - - - -3),尽管炎症等其他因素也可能是重要的(4- - - - - -7]。的水平循环促炎细胞因子和趋化因子如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)是常用的作为炎症的标志物,它们已经被证明在糖尿病(增加8- - - - - -10]。无论是单核细胞、炎症反应细胞类型的中央,是受糖尿病影响的环境和提供的补充信息是未知的。

循环单核细胞和CD45被流式细胞术⁺CD14⁺细胞。他们进一步根据特征表达CD16的存在与否,低亲和力Fc受体,FcγRIII [11]。的CD16⁻单核细胞构成的“经典激活”子集单核细胞占80 - 90%的循环单核细胞在正常健康的人。这个人口增加急性炎症感染和迅速招募网站(11- - - - - -13]。的CD16⁺激活单核细胞构成了“模”子集构成单核细胞的其余部分人口。这CD16⁺人口有巡逻功能组织损伤,并增加在衰老和慢性炎性疾病(11- - - - - -16]。在严重的情况下,这些子集表达不同的趋化因子受体,CD16⁻子集表示CCR2(趋化因子受体2),MCP-1的受体,CD16⁺子集CCR5表达(趋化因子受体5),结合巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)[11,17]。的CD16⁺子集通常对细菌内毒素促炎细胞因子的分泌,尤其是TNF -α和il - 111,15,18]。单核细胞也表达其他细胞表面蛋白质提供信息关于他们的炎症激活状态。例如,在炎症反应刺激27 e10表达在急性期同时25 f9增加后期(19- - - - - -21]。此外,CD68组织巨噬细胞的标志,CD11b是激活单核细胞表达的6,22,23]。

糖尿病被证明改变循环单核细胞的数量(24- - - - - -26),但这些变化之间的关系,还没有调查糖尿病并发症的存在。在目前的研究中,我们使用流式细胞仪检查循环单核细胞尤其是CD16⁺单核细胞活化的单核细胞和其他标记如27 e10, 25 f9, CD68, CD11b,两组的糖尿病患者糖尿病同样长时间但相差临床上重要的糖尿病并发症的存在与否。结果与非糖尿病患者相比对照组。这些标记物的表达之间的关系,循环促炎细胞因子和趋化因子也被调查。

2。材料和方法

2.1。研究参与者

患者没有微或macrovascular并发症(糖尿病),尽管持续时间超过十年,从临床数据库被确定糖尿病中心的皇家王子阿尔弗雷德医院和中央悉尼的眼科手术。同样长时间的糖尿病患者,糖尿病并发症(),也招募了来自同一个数据库。总的来说,43例(24男性和女性19;平均年龄为62.7±11.7岁)1型()和2型()糖尿病进行了研究。根据标准筛选,18例并发症和25没有临床意义上的微血管和/或macrovascular疾病被招募。视网膜病变的存在证实了宫检查和/或摄影。证实了糖尿病肾病的缺乏正常血清肌酐及尿白蛋白/肌酐比值(U铝青铜/ Cr) < 2.5毫克/更易与男性和< 3.5毫克/更易与女性。研究参与者认为macrovascular疾病如果他们有任何相关的血管疾病的症状或报告异常的调查或macrovascular事件之前的历史。此外,共有22名非糖尿病的参与者(6男性和16名女性;49.7±9.0岁)被招募为控制一般社区或工作人员的医院。的研究机构伦理审查委员会的批准和实施符合赫尔辛基宣言的原则就像2000年的修订。所有的研究参与者把他们的书面知情同意。

2.2。多色流式细胞术

多色流式细胞术被用于描述单核细胞的子集在接受调查,和下面的单克隆抗体共轭荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE), allophycocyanin (APC), peridinin叶绿素protein-cyanine5.5 (PerCP-Cy5.5)和allophycocyanin-cyanine7 (APC-Cy7)。他们是anti-CD45 (PerCP-Cy5.5和APC), anti-CD14 (FITC和PerCP-Cy5.5), anti-CD16 (PE), anti-CD68 (PE), anti-27E10 (PE), anti-25F9 (FITC) anti-CD11b (APC-Cy7和PE), anti-CCR2 (APC),和anti-CCR5 (APC)。适当的老鼠免疫球蛋白子类(FITC、PE、APC、PerCP-Cy5.5 APC-Cy7)被用作消极的控制。的抗体得到正欲(BD,圣何塞,CA),研发系统(明尼阿波利斯,美国),Abcam(英国剑桥),和圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国),分别。

进行分析,静脉血液被收集到EDTA-treated管。全血(100μL)然后孵化fluorescent-conjugated单克隆抗体CD45和CD14结合荧光共轭CD16抗体,27 e10, 25 f9, CD68、CD11b, CCR2,或者CCR5。60分钟后孵化在4°C,红血球细胞溶解,添加0.4%的皂苷(σ,澳大利亚)。这些细胞被洗立即用磷酸缓冲盐(PBS)和收集的300 g离心5分钟。上层清液被丢弃,细胞颗粒resuspended和清洗在流式细胞仪缓冲区(PBS w / v BSA含0.5%,0.1% w / v NaN₃和2毫米EDTA)。细胞表面标记表达式是由流式细胞术使用BD FACSCanto或BD FACSAria(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。最少30000事件数为每个CD标记集。并行所有样品进行了分析。共轭同形像控制、单antibody-stained控制和fluorescence-minus-one (FMO)控制也包括在内。

数据分析使用FlowJo版本8.1.1(美国或亚什兰)。白细胞最初识别和基于细胞分为子组大小(向前散射)和粒度(侧散射)和死细胞排除在外。顺序控制策略细节如图所示1。主控制集中在CD45⁺人口,CD14的二次浇注⁺细胞,最终的控制是基于CD⁺在CD45标记感兴趣的⁺CD14⁺细胞群。然后,结果被表示为CD的百分比⁺细胞内CD45⁺CD14⁺人口。

2.3。测量血浆细胞因子水平

循环促炎细胞因子和趋化因子il - 6的浓度,引发,TNF -α移行细胞(IFN -γ),射线诱发干扰素蛋白10 kDa (IP-10) MCP-1, MIP-1β测量在等离子体使用Bio-Plex职业分析(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。il - 10的浓度是量化使用商用酶联免疫试剂盒研发系统(明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。

2.4。统计方法

数据分析使用摘要2004统计软件包。提出了连续数据检查正常,平均值±标准偏差或中位数和四分位范围。分组比较的数据以及。线性回归和相关分析是用于验证单核子集之间的关系的意义和促炎细胞因子的浓度,趋化因子,分别和临床变量。统计学意义是接受。

3所示。结果

3.1。临床资料

研究参与者的人口学和临床参数如表所示1(个人网上病人数据补充表1所示http://dx.doi.org/10.1155/2012/649083)。对照组的年龄介于34.6和65.4之间年而糖尿病组介于30.7和78.8之间。糖尿病患者的组织为糖尿病类型匹配(:T1DM与:T1DM)、年龄(:63.3±8.6 vs:61.8±15.2),糖尿病(持续时间:17.8±6.7 vs:21.8±8.1)。集团与微血管并发症由受试者疾病仅)或微和macrovascular疾病(),血糖控制较差和差肾参数。组之间没有明显的差异与他汀类药物治疗(:21/25,:14/18)、降压药(:19/25,:15/18),或阿司匹林(:11/25,:12/18)。

3.2。糖尿病对单核细胞数量和形态的影响

没有糖尿病对循环白细胞(CD45的数量⁺细胞),但(CD45的单核细胞组件⁺CD14⁺)是显著增加(糖尿病:8.3±2.6%控制:7.2±1.6%,)(数据2(一)和2(B),职责)。这种增长是不受糖尿病影响类型(T1DM: 7.2±2.4%和2型糖尿病:8.5±2.6%,)或并发症状态(:8.2±2.7%:8.5±2.5%,)。所示的代表流式细胞术散点图里,从控制和糖尿病受试者(图2(C))、单核细胞形态不同,显示广泛分散的规模(向前散射)和粒度(散射)。基于这些特点,三个数量被确定为一个较小的规模和较细粒度的人口(a),一个中间人口(b)和单核细胞的人口规模更大的、更细粒度的组(c)。这些更大更细粒度的单核细胞(集团(c))负责单核细胞数量增加1%在糖尿病(糖尿病:3.8±2.3%控制:2.7±1.4%,)。

3.3。糖尿病及并发症的影响地位在单核细胞CD16表达式

流式细胞术块CD45代表⁺CD14⁺CD16⁺单核细胞从非糖尿病患者和糖尿病主题图所示3(一个)。总的来说,CD16比例没有显著差异⁺单核细胞之间的非糖尿病患者控制和糖尿病受试者(控制:8.53.4%糖尿病:11.48.8%)。然而,在糖尿病人群中,CD16的百分比⁺单核细胞与糖尿病并发症低这些学科相比,那些没有并发症(图3(B))。这个结果也发生在只有2型糖尿病进行了分析(:14.99.4%:8.27.5%,)。CD16的比例会增加⁺细胞中观察到糖尿病队列没有并发症大大增加更大的规模和更细粒度的单核细胞(人口(c)在图3(C))。回归分析显示,胆固醇和CD16之间的关系表达式()占大约9.3%的方差。没有这样的关系是观察糖化血红蛋白。

3.4。糖尿病的影响在其他单核细胞炎症和分化的标志

糖尿病及其并发症状态没有影响单核细胞的趋化因子受体CCR2和CCR5的表达,或任何分化标记27 e10, 25 f9, CD68、CD11b。如图4之间有显著相关性,CD16的百分比⁺单核细胞和单核细胞表达分化标记CD68的百分比⁺27 e10汽油⁺。

3.5。等离子体水平的炎性细胞因子和趋化因子

细胞因子和趋化因子的血浆浓度控制和糖尿病受试者如表所示2。糖尿病并发症患者的促炎细胞因子il - 6水平较低,引发,TNF -α和干扰素-γ但是一个更高级别的抗炎细胞因子il - 10与同行相比,没有并发症。相比之下并发症组与MIP-1趋化因子水平较高β达到统计学意义。CD16比例之间没有相关性⁺单核细胞和循环观察炎性细胞因子和趋化因子。

4所示。讨论

炎症过程中扮演着重要的角色在糖尿病并发症的发展,和巨噬细胞在组织在这方面是一个重要的细胞类型(5,27,28]。然而,研究巨噬细胞受阻的困难获取适当的组织样本。在这方面,循环单核细胞可以提供一个有价值的替代来源的材料测试各种假设。单核细胞是来源于myelomonocytic干细胞在骨髓单核细胞成熟。一旦在血液里,他们进一步发展和迁移趋化因子到分化成组织功能和表型不同的巨噬细胞类型。组织巨噬细胞的异质性。他们的表型和功能,改变以应对多个因素,包括木糖醇、组织损伤和炎症信号(11,29日]。另一方面,对单核细胞异质性糖尿病所知甚少。此外,任何更改是否反映临床和并发症,这种疾病还没有被研究过。在这项研究中,我们使用流式细胞仪可以识别和检查多种细胞表面标记物的表达从外周血单核细胞获得。

类似的研究Corrales et al .,我们观察到的增加循环单核细胞与非糖尿病患者相比,糖尿病患者控制(30.]。感兴趣的,可以大大增加归因于细胞大小和更高的粒度较大的人口(子集(c)),更像是巨噬细胞的表型特征。当分析作为一个群体,几乎没有区别CD16的正常和糖尿病患者单核细胞表达。然而,这掩盖了这些标记的高表达在糖尿病人群没有糖尿病的并发症虽然很长一段时间。这些结果显示Mysliwska等人发表的类似CD16增加⁺单核细胞年轻T1DM学科相比无视网膜病变和视网膜病变(31日]。与我们的研究不同,本研究显示增加CD16⁺单核细胞在糖尿病组与非糖尿病患者相比,控制。这种差异发生的原因是不确定的,但因素如年龄、BMI队列研究可能是重要的(24]。有趣的是,在我们的研究中,主要的区别在单核细胞形态似乎是由于单核细胞的形状和最大的变化是更大、更细粒度的单核细胞。或许是由于相关机制,CD16表达和CD68之间有着很强的相关性⁺27 e10汽油⁺,两个单核细胞激活和分化的标志。

血浆细胞因子和趋化因子的结果显示一些有趣的相似之处与单核细胞表面标记研究。没有并发症的糖尿病受试者又不同于那些并发症在更高的促炎细胞因子水平。然而,il - 10在行动,更抗炎并不遵循这一趋势。虽然不可能区分单核细胞子集导致循环细胞因子的水平,这可能增加由于il - 10分泌CD16比例的增加⁻单核细胞与并发症(糖尿病受试者25]。这一发现促炎细胞因子水平较高的那些没有并发症有点出乎意料。有变量报告关于促炎细胞因子水平及其与糖尿病并发症(32- - - - - -34]。大多数研究都集中在是否存在心血管疾病或糖尿病肾病(32- - - - - -34]。糖尿病受试者有长时间的疾病,大多是通络绝大多数在早期糖尿病视网膜病变与增生性疾病(只有一个)。受试者的数据关于促炎细胞因子水平与视网膜病变尚不明朗。很少有研究,描述了增加和减少的水平(31日,35- - - - - -37]。例如,在T1DM受试者nonproliferative糖尿病性视网膜病变,肿瘤坏死因子-α据报道的水平要高于无糖尿病视网膜病变者(31日]。相比之下,在2型糖尿病人群,TNF -α水平变化取决于阶段的疾病。在他们的研究中,降低TNF -α和il - 6水平在受试者观察nonproliferative糖尿病性视网膜病变,而增生性糖尿病性视网膜病变的存在与TNF -增加有关α和il - 6水平(35]。多因素如疾病并发症类型和严重程度,持续时间、年龄和类型的糖尿病影响促炎细胞因子水平还有待系统研究。

这些研究单核细胞和等离子体显示,赞成和抗炎标记改变糖尿病的方式反映了不同状态的糖尿病并发症。如前所述有点相反,相比那些并发症,这些并发症糖尿病受试者没有循环促炎的标记(CD16更高⁺、il - 6、引发、TNF -α和干扰素-γ)。尽管这种模式,我们不能直接得出结论,单核细胞整体更抗炎,因为函数和表面标记表达式之间的关系可能不是一个比例。它还有待在动物实验证明循环单核细胞在糖尿病的剖面的变化观察到本研究有关系的那些发生在组织巨噬细胞。此外,还有其他单核细胞子集和表面标记不同的炎症状态,仍有待研究。例如,最近的一份报告冈萨雷斯等人表明,高葡萄糖浓度可以下调CD33,膜受体,但是增加单核细胞分泌促炎细胞因子(26]。然而,这种受体的表达与并发症糖尿病受试者没有检查。另外,评估的单核细胞百分比之间的关系表达单核细胞的表面标记和净炎症状态,功能性的研究需要进行纯化单核细胞和不同的子集。观察到的细胞大小和粒度不同的显示模式改变了单核细胞的激活状态,增加了另一个层次的复杂性,可能需要单独研究。此外,众所周知,在活的有机体内大量的单核细胞坚持内皮细胞表面(38]。我们的研究结果表明,糖尿病患者并发症可能有更高的趋化因子水平。因此,他们坚持的单核细胞可能更大,不同的构成。这可能也会影响实验的结果。

我们观察到的改变是如何介导的机械化与进一步的调查需要回答。单核细胞表面标志物的变化是否与糖尿病并发症是一个因果从这项研究不能确定。轻微的差异在血糖控制和糖尿病患者肾功能的两组之间似乎并不扮演重要角色。在动物实验中,可以回答这些问题通过观察抑制个人的单核细胞亚型的影响。在人类研究中,进一步了解可以通过监测获得纵向单核细胞和血浆标志物早期糖尿病的自然历史在糖尿病并发症的发展。形式的治疗被证明传授在微血管中获益或macrovascular并发症(例如,用他汀类药物治疗)也可以评估在此设置。我们的糖尿病人群的背景选择长期糖尿病并发症的存在与否使用复合标准综合评估和在我们的糖尿病并发症评估服务39]。虽然队列研究是异构的,在我们的研究中使用的分组代表模式临床常见但不能容易解释了。未来的研究可能会进一步检查每个单独的并发症。然而,临床并发症往往共存,很难招人只受一种并发症。虽然仍然有很多悬而未决的问题,我们的研究打开了可能性,外周血单核细胞可以用来调查糖尿病并发症的病理生理学。

缩写

CCR:	碳碳趋化因子受体
IP-10:	射线诱发干扰素蛋白10 kDa
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
MIP-1β:	巨噬细胞炎性蛋白1β
U铝青铜:	尿白蛋白
U铝青铜/ Cr:	尿白蛋白/肌酐比值。

利益冲突

没有利益冲突与本文相关的报道。

作者的贡献

d . Min研究、分析解读数据,写论文。布鲁克斯和b Harrisberg收集临床样本和临床数据和修改。r·所罗门和w·包提供技术援助。Twigg和j . Wong导致讨论和审查。美国诉McLennan和d . k .曰导致讨论和辅助分析,解读数据,论文写作和审查。

确认

这个项目是在内分泌和糖尿病研究基金会的支持下,悉尼大学。作者也要感谢病理部门的成员,悉尼大学的援助与流式细胞术分析。

补充材料