文摘

不同的单核细胞的子集是重要的炎症和组织改造,尽管心力衰竭(HF)与局部和全身炎症有关,他们的角色在高频还未知。我们招募了59慢性收缩性心力衰竭患者(年龄14年,45岁的男性和女性)和29岁年龄组的不透水心脏病。与对照组相比,我们发现没有CD14的分布的变化⁺CD16⁺单核细胞的子集,而古典CD14^{+ +}CD16⁻子集是下降了11% (非经典数理CD14),^昏暗的CD16⁺子集是增长4% ()和反向相关的心衰患者严重心力衰竭(),评估增加舒张维度(EDD)。与对照组相比,血清TNF,il - 1、il - 10和心力衰竭患者IL-13水平明显升高。具体来说,CD1CD14 IL-13水平呈正相关^昏暗的CD16⁺单核细胞的子集(,),细胞内染色IL-13证明这些单核细胞产生细胞因子在心衰患者中,但不是在控制。我们建议逆关联EDD价值观和CD1的扩张CD16⁺单核细胞可以产生IL-13可以解释为衡量平衡不良改造,这是一个高频的中心过程。

1。介绍

炎症中扮演一个重要的角色在心力衰竭(HF)的发病机制及其预后产生影响。参与炎症介质(如细胞因子),炎症标记物(1),和氧化应激2- - - - - -4在高频和与免疫/炎症激活有关,心肌肥大,心肌重塑,不良和死亡率上升5,6]。增加循环促炎和抗炎细胞因子的水平,如il - 6、TNFα,il - 10与心衰相关进展,严重程度,增加死亡率(6,7]。在白细胞中,激活单核细胞和巨噬细胞被认为是支持和抗炎细胞因子的主要来源。

虽然单核细胞只占5 - 10%的外周血白细胞在人类,他们在炎症过程中发挥重要作用,在组织改造。这是由于他们吞噬微生物的能力,他们的产品,或内源性危险分子模式(抑制)和过程和呈现给T细胞来启动一个自适应免疫反应。他们还产生活性氧和氮物种和分泌各种细胞因子和生长因子的刺激。事实上,单核细胞促炎和抗炎细胞因子的主要生产商,包括肿瘤坏死因子α、il - 6和il - 10 (8]。因为它不太可能,所以许多不同的功能是由相同的细胞,这是表明单核细胞是一个异构的细胞,每个都有不同的表型和功能(8,9]。

用来区分的主要标志人类单核细胞CD14是子集(脂多糖受体的一部分)和CD16 (FcγRIII)。这些标记定义三种不同的子集:经典单核细胞表达高水平的CD14和没有CD16 (CD14^{+ +}CD16⁻也称为CD14⁺CD16⁻),中间单核细胞CD14和CD16 (CD14中级水平表达的^{+ +}CD16⁺或CD14⁺CD16⁺),模单核细胞CD14表达极低水平和高水平的CD16 (CD14^昏暗的CD16⁺或CD14⁻CD16⁺)[8,10]。这两个CD16⁺子集被证明扩大在许多炎症条件(如癌症、脓毒症和中风),而CD14^{+ +}CD16⁻保持不变甚至下降[子集8,11- - - - - -13]。然而,所有这些子集作为细胞分泌的功能支持或抗炎细胞因子仍然是有争议的。例如,排序单核细胞刺激的子集体外有限合伙人或酵母聚糖,但不是金黄色葡萄球菌从CD14、il - 10分泌增加⁺CD16⁺细胞,而LPS-stimulated CD14^昏暗的CD16⁺细胞表明TNF分泌增加的α(11]。在不同的研究中,CD14^昏暗的CD16⁺为吞噬细胞显示巡逻能力弱的特点和低ROS和细胞因子的生产受到细菌的toll样受体配体但分泌大量的促炎TNFα和il - 1β细胞因子在刺激与病毒配体或核酸(14]。因此,似乎单核细胞的子集不能简单定义为职业或抗炎,和它们的功能可能依赖于刺激的性质。

参与不同的单核细胞和巨噬细胞子集已经描述在急性心肌梗死(AMI),在人类15,16),在一个小鼠模型(17,招聘到心脏的不同动力学以及他们不同的受体表达建议他们有不同的角色在心肌治疗和改造。因此,本研究的目的是描述可能分布的变化在慢性收缩性心力衰竭患者单核细胞的子集,并进一步探索这些子集的潜在影响在特定的关键炎性细胞因子以及心力衰竭的临床参数。

2。材料和方法

2.1。病人

我们招募了59收缩期心衰患者从病人诊所:45岁男性和14个女性。相比之下,我们还招募了一批29岁年龄组:15个男性和14个女性。

入选标准为C HF患者阶段,纽约心脏协会(NYHA)类2 - 4,慢性收缩性心力衰竭(左心室射血分数< 40%的超声心动图),年龄在18 - 90年。在招聘,心力衰竭患者在他们平常的临床稳定状态没有最近的心脏代谢失调。所有患者治疗根据美国心脏协会/ ACC指南,总结在表及其特征1。

排除标准为高频组最近(≤1个月)承认对急性心力衰竭或急性冠脉综合征,或血液透析治疗或已知的全身性炎性疾病或最近的(< 1个月)发热性疾病。

对照组由单独的志愿者由董事会评估认证的心脏病专家基于详细的病史、面试评估可用的医疗记录,和医学治疗。排除标准为这些志愿者之前冠状/结构性心肌疾病的历史,系统性炎性疾病,或最近的发热性疾病(< 1个月)。值得注意的是,历史和/或治疗糖尿病高血压没有考虑作为对照组的排除标准。

研究参与者,心力衰竭患者(59和29控制),一个血液样本是在早晨小时分析单核细胞的子集(全血)和细胞因子(血清样本)。

研究符合赫尔辛基宣言中概述的原则,并经当地赫尔辛基委员会批准戴维斯卡梅尔夫人的医学中心和所有参与者签署书面知情同意前加入这项研究。

2.2。单核细胞表现型

EDTA实际上从控制和心力衰竭患者全血收集。为了避免单核细胞的激活全血,和红血球细胞溶解与Uti-Lyse试剂(美国DAKO Carpinteria, CA)和PBS后跟两个洗。细胞resuspended RPMI 1640年1% FCS和彩色荧光标记的单克隆抗体(PerCP反CD16克隆3 g8, BioLegend,圣地亚哥,美国;Allophycocyanin (APC) alexa萤石750反CD14分子克隆61 d3, APC反HLA-DR克隆LN3,和适当的同形像控制,eBioscience,圣地亚哥,美国CA)在室温下15分钟额外用PBS紧随其后。在一些样品,单核细胞被染色的细胞内子集IL-13表达式使用透化作用缓冲和PE-anti-human IL-13克隆32007或其同形像控制(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。洗后,细胞被固定在PBS 0.1%甲醛和分析使用LSR-II流式细胞分析仪(BD,贝德福德,MA)。我们使用两种补偿珠子和同形像控制确定nonexpressing CD14和CD16细胞。我们第一次封闭的单核细胞和粒细胞的一侧向前散射,然后进一步HLA-DR封闭⁺单核细胞,如[18),以确保CD16的排斥⁺NK细胞。三种不同单核细胞亚群的定义根据他们表达CD14、CD16之前描述(9,11,14,18]。

2.3。细胞因子

来自患者血清细胞因子和控制测量与商业TNF的ELISA试剂盒α,il - 1βil - 10, IL-13, TGFβ美国圣地亚哥(eBioscience CA)根据制造商的指示。

2.4。统计分析

数据分析由GraphPad棱镜5程序和SPSS统计软件包版本(18)。比较两组实验进行了使用非参数Mann-Whitney测试。尽可能多的细胞因子显示非常低的水平,我们根据计算数据转换为分类变量控制和高频患者的中位值,然后采用皮尔逊卡方检验来确定不同的细胞因子和高频之间的关系。逻辑回归模型被用来评估高频和单核细胞子集之间的关系和特定的细胞因子,由年龄和性别控制。优势比和95%置信区间估计的模型。接受者操作特征曲线(ROC)被用来评估中的每个细胞因子分类性能的心衰患者。单核细胞和细胞因子子集之间的关系计算我们使用皮尔逊或斯皮尔曼相关分析。所有价值观是双面的,被定义为统计意义。

3所示。结果

3.1。单核细胞亚群

没有总单核细胞百分比显著差异之间的高频和对照组(图1 (b))。为了发现更多的具体变化,我们测量的差异具体的单核细胞的子集,利用流式细胞术分析基于最近接受CD14和CD16表达单核细胞(8,10]。单核细胞分离成三个子集(图1(一)):古典CD14^{+ +}CD16⁻(R1红色大门),中间CD14⁺CD16⁺绿色(R2),非经典数理CD14和^昏暗的CD16⁺蓝色(R3)的子集。大多数的循环单核细胞CD14^{+ +}CD16⁻(70%以上的单核细胞),但是这个子集是心力衰竭患者相对于健康对照组降低了11%,(中位数86.9和,平均77.5,,图1 (d))。相比之下,非经典数理CD14的^昏暗的CD16⁺子集在心力衰竭患者(平均显著扩大%,平均9.28和意思%,平均5.26,,图1 (e))。CD14的⁺CD16⁺然而子集,包括只有3 - 4%的循环单核细胞和显示控制和心力衰竭患者(没有区别中位数2.58和2.52、中值,图1 (c))。协会每个单核细胞的子集的存在高频疾病评估使用逻辑回归模型,发现重要的只有CD14的扩张^昏暗的CD16⁺CD14和减少^{+ +}CD16⁻子集(表2)。

观察心力衰竭组中,我们进一步研究了可能的扩大CD14之间的联系^昏暗的CD16⁺或减少CD14^{+ +}CD16⁻心力衰竭严重程度的子集和几个参数,包括维度(EDD)、左心室舒张末期左室射血分数(LVEF)和纽约心脏协会(NYHA)类招聘当天(表3)。因为明显的同质性心衰组(心力衰竭患者症状、收缩),我们把单核细胞的子集和临床参数根据他们的中位数。CD14的^昏暗的CD16⁺子集是只有逆EDD值显著相关,符合less-adverse心肌重塑,而CD14^{+ +}CD16⁻没有明显相关的任何子集的临床参数。CD14执行类似的分析^{+ +}CD16⁻与这些高频参数子集显示没有明显的联系。为了进一步调查是否CD14的存在^{+ +}CD16⁻影响CD14之间的关系^昏暗的CD16⁺心脏肥大,我们进行了卡方多个对比测试(一个重要的地方价值被认为是只有0.01),通过将病人分成四组,基于组合的低和高CD14的中间值^{+ +}CD16⁻和CD14^昏暗的CD16⁺。协会的唯一显著差异被发现在高CD14 EDD减少值^{+ +}CD16⁻CD14 /高^昏暗的CD16⁺高CD14集团相比^{+ +}CD16⁻/低CD14^昏暗的CD16⁺()。所有其他比较不重要,包括CD14比较低^{+ +}CD16⁻CD14 /高^昏暗的CD16⁺和高CD14^{+ +}CD16⁻CD14 /高^昏暗的CD16⁺(子集)。此外,我们进行了卡方拟合优度检验,我们比较高CD14的分布^{+ +}CD16⁻CD14 /高^昏暗的CD16⁺分布的低和高EDD CD14的高^昏暗的CD16⁺集团(没有CD14^{+ +}CD16⁻小组分工、表3),但是没有发现差异()。总的来说,这意味着唯一的重要参数,影响着CD14 EDD值^昏暗的CD16⁺子集,CD14^{+ +}CD16⁻值没有影响CD的关联的保护作用^昏暗的CD16⁺对心脏的大小。

3.2。细胞因子的表达

我们比较5关键细胞因子(TNF的含量α,il - 1βil - 10, IL-13, TGFβ在控制和心力衰竭患者的血清(表4)。这些细胞因子没有明确的截止值,我们决定每个细胞因子根据其截止值中值和-操作者特征(ROC)曲线分析。是显示在表4,除了TGFβ4,所有细胞因子在高频组显著增加,与对照组相比。

3.3。单核细胞和细胞因子子集之间的联系

由于单核细胞可能影响炎症反应通过分泌赞成和抗炎细胞因子,我们评估了可能的两个单核细胞的子集(CD14之间的相关性^昏暗的CD16⁺和CD14^{+ +}CD16⁻血清细胞因子(TNF)和调查α,il - 1βil - 10, TGFβ和IL-13)(表5)。肿瘤坏死因子α,il - 1β,IL-13 CD14显著但负面与经典激活^{+ +}CD16⁻。相比之下,只有IL-13呈正相关,CD14^昏暗的CD16⁺子集。非经典数理CD14进一步探索之间的关系^昏暗的CD16⁺IL-13,我们进行细胞内染色的单核细胞anti-IL-13和封闭的三种单核细胞子集定义在图1观察各自产生IL-13的能力。图2表明健康对照组没有产生IL-13(只有阳性细胞百分比),而一些CD14的心衰患者^昏暗的CD16⁺单核细胞(阳性细胞百分比,蓝色的直方图)转移到胞内IL-13表达的正确和清晰。

4所示。讨论

我们发现在我们当前的工作,比较非心血管志愿者,慢性收缩性心力衰竭患者表现出显著变化分布的单核细胞的子集。这些变化导致更高的血清IL-13水平和反向链接有增加心脏衰竭的大小。

炎症长期以来一直与高频,疾病进展和不良结果(7,19]。然而,细胞负责这些影响的作用尚未完全发现。因为CD14和CD16表达式首先用于识别不同的单核细胞(子集20.),一些报告描述了一个临床相关的特定子集炎症和修复的贡献,在非心脏(例如,哮喘21),感染人类免疫缺陷病毒(22]),和心血管疾病(例如,AMI和动脉粥样硬化)。具体的参与单核细胞子集在AMI后组织修复和正确的招聘时间心肌,发生在两个阶段,最近被证明是成功治疗的关键和恢复正常的功能,无论是在人类[16和老鼠17]。AMI后,促炎CD14^{+ +}CD16⁻单核细胞(或Ly6C^高鼠标等价物)被雇来的受损组织促炎细胞因子和趋化因子(如肿瘤坏死因子α,il - 1β和il - 6)在第一阶段持续4天。这个单核细胞负责子集的凋亡细胞,炎症细胞,吞噬作用和坏死细胞碎片,释放蛋白酶(如基质金属蛋白酶、组织蛋白酶和尿激酶纤溶酶原激活物),降解细胞外基质,促进细胞运动。第二阶段取决于CD16⁺单核细胞或其Ly6C^低鼠标等价物(人类CD14之间没有明确的区别⁺CD16⁺和CD14^昏暗的CD16⁺单核细胞),它通过VEGF的分泌促进血管生成和FGF,招聘myofibroblasts,存款胶原蛋白和其他ECM蛋白质形成肉芽和疤痕组织。因此,不足或夸大的单核细胞在心脏,在第一或第二阶段,可能导致受损治疗后心肌损伤,最终导致心肌重塑和高频(23]。

我们所知,只有两个先前的研究描述了分布的变化在心衰患者中,单核细胞的子集与冲突的结果。我们发现增加的非经典数理CD14的水平^昏暗的CD16⁺古典CD14和降低水平^{+ +}CD16⁻在心力衰竭患者的外周血单核细胞子集相对于健康对照组符合其中一项研究[18),但与其他[24证明CD14的扩张⁺CD16⁺在心衰患者中,而不是CD14^昏暗的CD16⁺子集。这表明在高频单核细胞发挥作用才刚刚开始探索和两个构成CD16子集⁺单核细胞的人口不是同质的,可能有不同的角色。CD16的可能角色⁺单核细胞是研究很少,只有少数研究显示这些单核细胞的促炎细胞因子的分泌,主要在脓毒症(25[]或病毒刺激14]。我们所知,CD14的角色^昏暗的CD16⁺在高频尚未评估子集。高频与炎症有关,内皮功能障碍和氧化应激26,27]。然而,CD16炎症和抗炎的作用⁺单核细胞(包括CD14^昏暗的CD16⁺细胞因子)和IL-13备受争议。我们观察到病人显著增加CD14的水平^昏暗的CD16⁺和减少CD14的水平^{+ +}CD16⁻。这些CD14^昏暗的CD16⁺细胞,CD16的一部分⁺人口(Ly6C^低老鼠),与有益的伤口愈合和减少不良改造过程在人类和动物模型(17,23]。此外,CD14相比^{+ +}CD16⁻,CD14^昏暗的CD16⁺被证明表达PSGL-1少和更高的残雪₃CR1 [18]。PSGL-1与炎症和内皮功能障碍在动脉粥样硬化(28],它可以预防的缺陷(29日]。CD14^昏暗的CD16⁺作为一个CD16的一部分⁺细胞,表达更高的残雪₃CR1比CD14^{+ +}CD16⁻细胞,与伤口愈合和限制相关的氧化应激和炎症(30.,31日]。因此,CD14扩大^昏暗的CD16⁺子集可以减少炎症和内皮功能障碍。我们已经进一步表明心力衰竭患者增加了水平IL-13这个子集可以产生细胞因子。IL-13本身有消炎的作用[32,33]。总的来说,看起来CD14的增加^昏暗的CD16⁺结合的能力产生IL-13子集可以作为一种平衡机制,旨在减缓积极改造的过程。这也许可以解释CD14的增加之间的负相关^昏暗的CD16⁺子集和左心扩大降低表现在小EDD测量。值得注意的是,CD14^{+ +}CD16⁻没有额外的子集对CD的保护效果的影响^昏暗的CD16⁺心脏细胞的大小。

有趣的是,之前的结果(24]显示CD14的扩张之间的负相关⁺CD16⁺子集和心力衰竭患者的左心室射血分数(LVEF)。这是我们认为两个CD16兼容⁺单核细胞的子集在高频可能参与改造过程,增强或限制它。缺乏CD14之间的相关性^昏暗的CD16⁺子集和LVEF NYHA在我们的研究中也可能被解释成相对均匀的患者人群,我们招募了我们的研究中,仅由症状,收缩期心衰病人定义为低LVEF (NYHA 2 - 4和LVEF < 40%,职责。)34]。

单核细胞发挥他们的作用部分是通过分泌赞成和抗炎细胞因子和趋化因子,以及高浓度的高频血清中描述这些之前(5,6]。其中一些细胞因子和趋化因子的角色发展的高频细节其他地区被描述(35- - - - - -37]。根据先前的研究,我们发现的肿瘤坏死因子水平升高α,il - 1β心力衰竭患者血清中il - 10, IL-13的(38- - - - - -41),而TGF水平β保持不变。我们CD14之间呈显著正相关^昏暗的CD16⁺IL-13,建议抗炎细胞因子和单核细胞之间的因果关系子集。进一步探索这个前提,我们染色IL-13单核细胞内表达的子集和直接证明模子集可以产生IL-13在心衰患者中,但不是在健康对照组。这一发现是在协议与最近的一项研究还显示增加等离子体水平的IL-13在心衰患者中,但没有链接IL-13水平扩张的一个特定的单核细胞的子集。IL-13在高频几乎是调查的作用,且只有一个研究IL-13水平和LVEF值之间呈负相关(39]。此外,IL-13基因敲除小鼠表现出严重的心肌病,心脏功能受损和高频42]。这些数据暗示尽管IL-13是一个已知的中介组织的纤维化和改造在几种疾病43,44),其在高频在改造过程中的作用可能是更复杂的,甚至保护。

我们所知,我们的研究首次表明,IL-13生产可能直接链接到特定的CD14^昏暗的CD16⁺心力衰竭患者单核细胞子集。我们建议这个细胞因子和模CD14^昏暗的CD16⁻单核细胞产生子集可能是重要的平衡系统旨在减缓改造过程,在心力衰竭的发病机制至关重要。然而,这个前提,需要进一步实验和进一步研究的支持。心力衰竭发病机理是装修过程的标志。因此,干扰重塑的过程可能影响心力衰竭疾病发生和发展。现在我们的研究确定了两个新的目标,CD14^昏暗的CD16⁺子集和IL-13细胞因子产生的操作可能会减缓重构过程及其不良临床后果。此外,这两个参数(即。,CD14^昏暗的CD16⁺水平和IL-13浓度)可能被用作生物标记对心力衰竭患者restratification根据疾病的严重程度。然而,所有这些潜在临床意义需要进一步调查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢夏甲巴斯夫人为她(RN)技术援助在这项研究和教授哈伊姆Bitterman关键论文的审查。