文摘
Th17细胞都牵连到许多炎症和自身免疫性疾病。磷脂中介platelet-activating因子(PAF)参谋长在浓度增加炎症病变和已被证明诱导il - 6生产。我们调查是否拥堵会影响Th17细胞的发展。拥堵的Picomolar浓度诱导IL-23、il - 6和il - 1β表达monocyte-derived朗格汉斯细胞(LCs)和角化细胞。此外,当信用证使用拥堵然后cocultured anti-CD3 anti-CD28-activated T细胞,后者开发Th17表型,显著增加转录监管机构ROR的表达γt和增强表达IL-17 IL-21, il - 22生成。PAF-induced Th17发展预防PAF受体拮抗剂WEB2086参谋长和中和抗体IL-23 IL-6R。这可能构成一个前所未知的刺激炎症过程的发展和持久性,可以适合药理学干预。
1。介绍
一个独特的白介素(IL) 17-producing CD4的子集+T辅助(Th17)细胞,不同于著名的Th1、Th2细胞最近被确定。Th17细胞的分化和毅力是证明是依赖于选定的细胞因子,包括在场的情况下,在人类身上,il - 1β,il - 6 (1],IL-23 [2- - - - - -4),以及TGFβ(5]。Th17细胞分泌多种细胞因子,包括IL-17A IL-17F, IL-21, il - 22生成时,肿瘤坏死因子α,而il - 6都有重叠和不同的角色在宿主防御和炎症4,6]。视黄孤儿receptor-gamma T (RORγt)3在人类,其orthologue RORC2被确定为Th17细胞标记和显示主监管Th17发展所需的转录因子(7,8]。IL-17似乎发挥重要作用不仅在宿主防御各种病原体,而且在慢性炎症性疾病的发病机制和在许多自身免疫性疾病,包括多发性硬化症、炎症性肠病、哮喘、和银屑病(9- - - - - -15]。
牛皮癣是一种慢性炎症性皮肤病,其特征是表皮增生,浸润的白细胞进入真皮和表皮,以及血管扩张和增长。直到最近,牛皮癣被认为主要是Th1-driven自身免疫性炎症性疾病,但最近的调查结果清楚地显示IL-23和Th17细胞的作用。支持,Th17细胞已被确认的数量增加的真皮和表皮银屑病皮肤与正常皮肤(16),并根据IL-17A增加,这些细胞被激活IL-17C, IL-17F, il - 22生成表达式。此外,表达IL-17A IL-17F、IL-26 CCL20和RORγt, Th17标记,都证明是增强在银屑病皮肤2,17]。IL-23也报道高度表达lesional银屑病皮肤和角化细胞产生的,朗格汉斯细胞(LC),真皮树突状细胞和巨噬细胞18,19]。最后,解决银屑病病变取得使用几种免疫调节器阻止IL-23 / Th17 [20.]。
Platelet-activating因子(PAF)参谋长是一个强有力的磷脂炎性介质,在炎症早期发布的各种细胞类型。拥堵的行为主要由绑定到它的受体(PAFR) G-protein-coupled受体发现在大多数细胞,包括血小板,单核细胞,肥大细胞,粒细胞,B淋巴细胞、树突状细胞和角化细胞(21- - - - - -24]。拥堵是一个已知的转录监管机构和被证明移植的分泌多种细胞因子,包括il - 1、il - 6和TNF -α(25,26]。拥堵已经与哮喘和其他过敏性疾病的发病机理,在炎症性肠病、风湿性关节炎、多发性硬化症、内毒素休克,真皮炎症(23,27,28]。在牛皮癣的几个拥堵的观测暗示作用。因此,据报道,拥堵的牛皮癣患者的血浆水平升高,lesional银屑病皮肤包含大量的中介(29日,30.]。组织学分析显示大PAFR染色相比,牛皮癣患者的表皮控制(31日]。增厚的皮肤,增加表皮角化细胞的增殖,在牛皮癣,观察转基因小鼠中过表达PAFR [32]。
在当前的研究中,我们调查了拥堵的潜力诱导Th17开发通过激活LC和生产il - 6和IL-23 coculture LC-T细胞模型。
2。材料和方法
2.1。一代和隔离Monocyte-Derived朗格汉斯细胞
Monocyte-derived LC生成从人类外周血单核白细胞(PBML)从正常的捐赠者获得知情同意后按照内部审查委员会批准了协议,符合《赫尔辛基宣言》。血液单核细胞是由密度梯度离心法纯化Ficoll-Paque(美国通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西),其次是塑料的依从性,和在6-well组织培养板培养5 - 6天(实验室的器具,正欲富兰克林湖,新泽西,美国)在2×106/毫升RPMI 1640中补充了10% (v / v)的边后卫(PAA实验室),rhGM-CSF (20 ng / mL), rhIL-4 (20 ng / mL)和rh-TGF -β(10 ng / mL) (Peprotech落基山,新泽西,美国)在37°C湿润有限公司5%2孵化器。3天,新媒介与上述细胞因子添加补充。经过5天的文化输出人口是典型的不成熟的LC,半歇工上述细胞因子的浓度增加了。这些LC低水平的CD86表达,不利于CD83 (BD Pharmingen,米西索加、加拿大)。他们经常检测langerin(贝克曼库尔特,马赛,法国)和钙粘蛋白(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)表达式,分别超过80%和75%。
2.2。CD4的隔离+T细胞
CD4+T细胞是纯化从全血淋巴细胞耗竭的使用“人CD4细胞污染+T细胞浓缩设备”(公元前干细胞技术、温哥华,加拿大)后,制造商的指示。纯度大于98%。CD4+在0.5×10 T细胞6细胞/毫升RPMI 1640 10%的边后卫是培养5天anti-CD3(2的组合μg / mL),固定在微型板块和可溶性anti-CD28 (1μg / mL)抗体。在诱导T细胞胚芽生殖治疗是有效的。
2.3。的Coculture PAF-Stimulated MoLC与T细胞
在1×10 T细胞被镀5细胞/好,刺激单独与il - 1的结合β+ il - 6 + IL-23 (Peprotech落基山,新泽西和Alexis生化药剂,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)5天或cocultured 2.5×104自体分级的缺失或存在浓度的LC空军(10−12到10−7米)(octadecyl-PAF,开曼群岛,来自美国密歇根州安阿伯市,美国)。当表示,中和Ab IL-6R, IL-15或IL-23p19(研发系统)为0.4μ0.5 g / mL,μ和0.8克/毫升μ分别g / mL。文化是5天后用于血细胞计数和PCR分析。当表示,Jak2抑制剂(AG490)、表皮生长因子受体(EGFR抑制剂),NF -κB (NF -κB激活抑制剂)或STAT3 (STAT3抑制剂肽),所有从EMD生物科学,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国在10μ米,20μ米,20μ米和400μM,分别。
2.4。角化细胞培养
人类keratinocytic A431细胞鳞状细胞癌行,获得了来自美国文化类型收集和培养在37°C high-glucose DMEM (Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫)(PAA实验室、体态,加拿大)。
正常的人类新生儿包皮表皮角化细胞(这些细胞)获得Lonza (Walkersville,医学博士,美国)。这些细胞在无血清培养基生长,KGM-2 (Lonza),包含0.09 L CaCl更易2,0.5毫克/毫升氢化可的松,0.1 ng / mL重组人表皮生长因子(EGF)、5 ng / mL胰岛素,v / v牛脑垂体提取物0.4%,50毫克/毫升庆大霉素和0.05毫克/毫升两性霉素B,在95%的空气和5%的公司的氛围2在37°C。这些细胞在增殖阶段用于confluency 70% - -80%。
2.5。流式细胞术分析
过去的3 h coculture,细胞与25 ng / mL PMA刺激(Sigma-Aldrich,奥克维尔、加拿大)和1μg / mL ionomycin (EMD化学品,加州拉霍亚,美国)在2毫米莫能菌素(BD生物科学,米西索加、加拿大)细胞内IL-17A的评估。细胞被洗在修复/烫解决方案(eBioscience,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)根据制造商的指示和CD4 (BD生物科学)和细胞内染色IL-17A或RORγt (eBioscience) 30分钟。洗后,分析了细胞FACSCalibur流式细胞分析仪使用CellQuestPro软件。
2.6。RNA隔离和实时定量PCR
RNA是获得使用试剂盒试剂(表达载体,伯灵顿,加拿大)根据制造商的指示。总RNA净化后Rneasy工具包(试剂盒,米西索加、加拿大),1.0μg的RNA与低聚糖转化为cDNA dT (Fermentas,伯灵顿,加拿大)和逆转录酶(M-MLV;Promega,麦迪逊,美国WI)在20卷μl . GAPDH il - 6、IL-17A IL-21, il - 22生成时,IL-23p19, PAF受体(PAFR)和参谋长RORC2表达测量使用实时PCR进行Rotor-Gene 3000 (Corbett研究,柯克兰,QC,加拿大)。下面的寡核苷酸引物获得从IDT(美国印第安纳州珊瑚镇):人类GAPDH:向前,5-GAT广汽ATC亚美大陆煤层气有限公司亚美大陆煤层气有限公司GTG GTG AA-3和反向,5-GTC TTA CTC CTT GGA GGC猫GT-3;人类il - 6:向前,5-GTG TGA亚美大陆煤层气有限公司CAG CAA AGA GGC-3和反向,5-CTG GAG GTA CTC标签GTA TAC-3;人类IL-17A:向前,5-CTA CAA 20 ATC CAC CTC AC-3和反向,5-CCA CGG ACA CCA GTA TCT TC-3;人类IL-21:向前,5-GCA ACA TGG AGA GGA TTG TC-3和扭转,5-CTG AAA GCA GGA AAA AGC TG-3;人类il - 22生成:向前,5-CAC AGA CGT TCG TCT猫TG-3和扭转,5-AGC TTT TGC ACA TTC CTC TG-3;人类IL-23p19:向前,5-GAT GTT CCC猫ATC CAG TG-3和反向,5-ATC TGC TGA GTC太极拳CAG TG-3;人类PAFR:向前,5-CCT有条件现金转移支付标签CAC CAA CTG TGT颈扭转,5-CAA CCA CTT CAG TGA 20答CC-3;人类RORC2:向前,5-CAG柠檬酸TGA棉酚CAC AAA TTG亚美大陆煤层气有限公司TG-3和反向,5-CAG GTG ATA ACC 20标签TGG 3。每个样本的实时PCR包括:1μMgCl L cDNA、2.5毫米2,100年μM核苷酸,1μ2.5 M的引物μL 10 x PCR缓冲,0.5单元的聚合酶(Feldan生物实验室公司、魁北克、QC、加拿大)和0.8μL SYBR绿色(分子探针,尤金,或;反应体积的1/1000股票稀释)25μl .循环程序由一个初始变性在95°C 5分钟,45周期放大条件如下:95°C(30秒),58°C(30秒),72°C(30秒),和最后一个在72°C扩展6分钟。每个基因表达规范化与GAPDH mRNA的内容和褶皱的差异计算与δ(ΔΔ)Ct方法根据以下公式:(ΔΔCt = [(Ct G.O.I.Ctl−−(Ct G.O.I.STIM Ct HK.G.Ctl)。−Ct HK.G.STIM)]。比较每个基因的表达之间的控制和刺激状态由其ΔΔCt决定。然后结果转化成褶皱的变化测量:褶皱增加= 2ΔΔCt
2.7。统计分析
统计显著性计算使用棱镜5软件(美国加州圣地亚哥GraphPad软件)。实验群体之间的差异进行分析,学生的t以及和单向和双向方差分析Bonferroni测验后的被使用,是适当的。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。拥堵的诱发IL-23、il - 6和il - 1β生产
为了评估潜在的空军调节Th17细胞发展,我们最初接触monocyte-derived LC分级浓度的空军和测量他们的能力来表达IL-23p19, il - 6和il - 1β信使rna。如图1,picomolar IL-23拥堵的浓度的增加,il - 6和il - 1β4-hr文化基因表达,在拥堵的浓度显著影响10−11到10−9M。
(一)
(b)
(c)
因为拥堵的角化细胞也表达的受体(PAFR) (22拥堵的),我们测试是否也可以诱导细胞因子表达在这些细胞。如图2、IL-23p19拥堵的诱导表达il - 6和il - 1β信使rna在A431 keratinocytic细胞(数字2(一),2(b)2(c))和正常的人类表皮角化细胞(这些)(数据2(d),2(e)2(f))在拥堵的显著增加10−10到10−8M。
3.2。PAF-Activated LC诱导Th17细胞的发展
因为抗原递呈细胞,如信用证可以调节辅助T细胞极化,我们调查是否拥堵的激活信用证可能诱发的发展Th17 cocultured自体CD4细胞的表型+T细胞。在5天的单核细胞分化成信用证,我们激活自体T细胞anti-CD3和anti-CD28 Ab。Monocyte-derived LC PAFR mRNA和蛋白表达,并有能力应对空军与钙离子通量和趋化性。相比之下,CD4细胞激活+T细胞表达没有PAFR mRNA,未能应对空军钙熔剂或趋化作用。
5天分化后,拥堵的分级浓度的LC治疗,与自体T细胞激活coculture额外5天时间的比率1:5。T细胞通过流式细胞术进行分析转录监管机构ROR的表达式γt和IL-17。如数据所示3(一个)和3 (b),PAF-activated LC ROR显著增强γpreactivated和cocultured CD4 t和IL-17表达式+T细胞。诱导RORγt在t细胞表达PAF-pretreated LC是类似规模的激活t细胞培养中诱导il - 1的存在β没有信用证,il - 6, IL-23。正如所料,PAF-induced RORγt t细胞表达是通过预处理的LC PAFR拮抗剂WEB2086拥堵的接触之前,而细胞因子诱导的RORγt表达(图的影响2(c))。有趣的是,风险敞口的LC WEB2086降低ROR的基础水平γt感应,这表明基底RORγt表达依赖于PAFR激活,可能通过内生生产LC的拥堵或PAF-like化合物。
(一)
(b)
(c)
3.3。PAF-Induced Th17发展与增强生产IL-17A IL-21, il - 22生成,RORC2
Th17发展以下coculture PAF-treated LC伴随着表达Th17-associated CD4细胞因子+T细胞群,即IL-17A IL-21, il - 22生成时,以及RORC2最接近人类ROR同系物的老鼠γt。如图4,subnanomolar拥堵能够诱导浓度显著增加IL-17A, IL-21, il - 22生成,RORC2 mRNA的表达。有趣的是,PAF-induced LC-dependent水平类似直接引起T细胞活化和il - 1的结合β、il - 6和IL-23,除了il - 22生成时,这是直接激活T细胞表达更强烈。相比之下,纯化CD4+T细胞,新鲜孤立或激活与anti-CD3 5天/ anti-CD28 Ab,未能上调表达IL-17A或RORC2针对空军(数据未显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。PAF-Induced Th17发展是依赖于IL-23和il - 6
我们下一个调查是否PAF-induced Th17细胞分化的发展依赖于细胞因子产生的信用证。IL-15以来,促炎细胞因子,主要由合成LC和直流,还被认为是一种诱导物(Th17细胞发展的33,34),我们也使用中和anti-IL-15 Ab化验。我们因此增加了中和anti-IL-6R, anti-IL-23和/或anti-IL-15 Ab LC-T细胞cocultures和ROR测量γ在CD4 t表达式+T细胞后5天。如图5(一个),除了Ab针对IL-23或IL-6R导致显著降低ROR的感应γt表达式。相比之下,中和的IL-15没有效果。我们的数据表明,IL-23和il - 6,但不是IL-15 LC-dependent至关重要,PAF-induced Th17发展。
(一)
(b)
(c)
3.5。PAF-Induced Th17发展是依赖LC-T细胞接触
因为抗原递呈细胞需要身体与T细胞免疫反应的不同阶段,我们测试是否PAF-primed LC和TCR-activated T细胞之间的信息联系Th17发展至关重要。如图5 (b),RORγ在CD4 t表达式+T细胞是预防LC被Transwell膜分离T细胞,表明事实上PAF-induced Th17发展也依赖LC-T细胞接触。
3.6。PAF-Induced Th17发展是依赖Jak2、STAT3 NF -κB,表皮生长因子受体
我们曾表明PAFR信号可以诱导Jak2磷酸化STAT3易位在单核细胞(35]。此外,拥堵已经显示诱导生产heparin-binding表皮生长因子和生长因子(HB-EGF)通过一个NF -κB-dependent机制(36),transactivate表皮生长因子受体(EGFR) [37]。STAT3和NF -κB也发现所需IL-23介导IL-17生产(38]。信用证使用cell-permeable Jak2抑制剂时,表皮生长因子受体,NF -κB或STAT3 RORγ在CD4 t表达式+T细胞是完全阻止(图5 (c)),这表明Jak-STAT NF -κB和表皮生长因子受体信号通路参与PAF-induced Th17发展。
4所示。讨论
IL-23高度增强的表达在这Th17-inducing lesional银屑病皮肤和因素是由角质细胞,朗格汉斯细胞真皮树突状细胞和巨噬细胞19]。皮肤的免疫原性与大量的居民DCs包括表皮朗格汉斯细胞(LCs)和真皮DCs (ddc),这都是能够激活幼稚T细胞(39,40]。在慢性皮肤炎症和自身免疫性疾病的发展,如牛皮癣,Th17和Th1细胞渗入皮肤,居民DCs被证明有一个作用的启动和维护Th17免疫(41,42]。不同的观测表明可能与银屑病拥堵的炎症性脂质中介协会(29日- - - - - -32]。拥堵在浓度增加炎症病变和已知的转录监管机构的各种细胞因子(26包括il - 6]。此外,拥堵很早就出现在炎症和刺激,可以由各种各样的细胞如单核细胞、树突状细胞和角化细胞。在这种背景下,我们调查是否拥堵会影响发展的LC-T细胞coculture Th17细胞模型。
在目前的研究中我们提供的证据表明,空军可以有效地调节Th17细胞的发展。首先,我们发现空军诱导迅速il - 1的表达β、il - 6和IL-23人类LC和角化细胞,三对Th17细胞因子据报道至关重要的发展(1,2]。第二,我们观察到TCR-activated T细胞在coculture PAF-stimulated LC,开发了一种Th17表型与增加转录监管机构ROR的表达式γt(及其人类RORC2 mRNA当量)和相关的分子包括IL-17A IL-21和il - 22生成。第三,我们的研究结果表明,屏蔽PAFR LC-T细胞cocultures受损转录监管机构ROR的表达γt和使用anti-IL-6R anti-IL-23单独或结合,废除ROR的感应γt通过拥堵的表达式。最后,我们还发现,PAF-induced Th17发展依赖于拥堵的LC和T细胞之间的信息联系,增强通过刺激LC Th17-associated标记的表达而不是T细胞。综上所述,这些观察结果表明,代Th17 LC是依赖于T细胞与LC和生产、细胞因子il - 6等的后者,和IL-23拥堵的回应。
这种监管IL-17生产另一个G-protein-coupled受体也报道了。鞘氨醇1-phosphate (S1P)生物活性lysophospholipid S1P受体结合1,被证明有效果类似于IL-23增加Th17发展从老鼠脾脏CD4+T细胞(43]。此外,在最近的评论文章,爱德华兹和Constantinescu拥堵的建议/ PAFR通路可能直接影响T细胞反应和支持Th17表型,但没有提供实际数据(28]。有矛盾的观察是否人类T淋巴细胞表达PAFR与否。一些作者报道,PAFR也没有检测到休息(44]或激活T细胞(45),但其他人观察到低水平表达在静止T细胞刺激后增加(28,44]。然而,在我们的模型中,人类CD4 TCR-activated高纯度+T淋巴细胞缺乏PAFR拥堵的表达和功能都无法回应刺激。拥堵的另一方面,我们的研究结果证明人类可以刺激LC和角质化细胞一致的文献表明,直流和角化细胞表达功能PAFR [22,46和拥堵的信号激活LC迁移47]。见我们的结果,一个钟形量效曲线经常看到GPCR配体,在高浓度不引起中等浓度一样好的响应。人们认为自体脱敏和内化的受体,在应对高配体的浓度,可能对这种现象负责。
IL-17A和IL-17F诱导生产各种细胞因子和趋化因子,包括肿瘤坏死因子α,il - 1β、il - 6、引发CCL2 (MCP-1)、粒细胞集落刺激因子(g - csf),以及细胞间粘附分子(ICAM) 1的表达由单核细胞、气道上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。这些IL-17-induced表达谱通常可以增强TNFα和干扰素-γ(48]。皮肤的上下文中,IL-17据报道,调节细胞因子的生产和表皮角化细胞表面分子组成。IL-17增强il - 6的生产和引发角质细胞和诱导表达ICAM-1疲软HLA-DR [41),而干扰素-γ和肿瘤坏死因子α全身的咆哮被明显抑制IL-17 [49]。此外,IL-17报道调节成纤维细胞功能通过诱导il - 6,引发,IL-11, GROα,g - csf (48]。
除了IL-17A IL-17F, Th17细胞产生其他效应细胞因子,即IL-21和il - 22生成(6]。无论是IL-21还是Th17-exclusive细胞因子il - 22生成,但优先表达Th17细胞。主要是由CD4 IL-21产生的+T细胞(50)和NKT细胞(51]。最近,几组同时观察到IL-21 Th17细胞刺激后产生的il - 6和IL-21本身和对Th17细胞发展关键功能(52- - - - - -54]。IL-17 coexpression和il - 22生成Th17细胞表明通路调节这两个细胞因子可能是非常相似的(55]。尽管IL-23不足以诱导新创从天真的CD4 IL-17生产+T细胞,仅IL-23促进il - 22生成生产从许多不同的免疫细胞类型。il - 6单独是充分的从天真的CD4细胞il - 22生成的感应+T细胞。il - 22生成,因此,可能是一个明显的下游因子介导的IL-23浸润免疫细胞之间的串扰,特别是T细胞和角化细胞在银屑病皮肤。IL-23注入老鼠耳朵造成皮肤炎性表型,以白细胞浸润[54]。浸润的CD4+T细胞显示Th17细胞表型的表达IL-17和il - 22生成。除了IL-21和il - 22生成时,肿瘤坏死因子等细胞因子α和il - 1β没有被具体由Th17细胞产生,提出了额外的角色在Th17反应的放大56,57]。拥堵的,已知的il - 1活化剂β和肿瘤坏死因子α(58)也可以参与这样一个循环扩增。最近,TLR2-activated人类LC也表明促进Th细胞的极化成Th17细胞通过il - 1的生产β,TGFβ,IL-23 [59]。
因此,拥堵的/ PAF-R交互可能参与早期事件导致Th17细胞分化和引发self-amplification过程。拥堵可能导致创建一个环境促炎倾斜支持Th17细胞因子生产的发展。在本文的准备,辛格et al。60)报道,在活的有机体内拥堵的封锁抑制psoriasis-like疾病在转基因小鼠模型的发展和随之而来的Th17表型。
5。结论
在目前的工作中,我们表明,拥堵的刺激LC和角化细胞产生il - 6和IL-23。此外,激活T细胞在coculture PAF-stimulated LC开发Th17表型与增加转录监管机构ROR的表达式γt和增强生产IL-17 IL-21和il - 22生成。这些影响被PAF受体拮抗剂参谋长和il - 6和IL-23中和抗体。这些观察结果表明,拥堵有助于激活T细胞的分化成Th17诱导产生il - 6和IL-23 LC。这可能构成一个前所未知的刺激炎症过程的发展和持久性,可以适合药理学干预。
缩写
| LC: | 朗格汉斯细胞 |
| 改善: | Platelet-activating因素 |
| PAFR: | 拥堵的受体 |
| RORγ师: | 视黄孤儿receptor-gamma T |
| RORC2: | 视黄孤儿受体C2。 |
确认
作者要感谢他们的无私贡献的献血者。AMD被溺爱的奖学金支持魁北克de la矫揉造作的en桑特(FRSQ)和从Merck-Frosst奖学金。JS和表示:支持格兰特(拖把- 6822)从加拿大卫生研究院的研究。Stankova和m . Role-Pleszczynski de矫揉造作的倩碧Etienne-Lebel FRSQ-funded中心的成员。由加拿大研究主席m . Rola-Pleszczynski支持炎症。