文摘

自闭症是一种神经发育障碍的特征问题沟通、社交技巧、和重复的行为。最近的研究表明,凋亡和炎症机制可能导致这种疾病的发病机制。核因子- B (NF - B)是一种重要的基因转录因子参与炎症和细胞凋亡的中介。本研究调查了NF -活动 B信号通路在自闭症患者的大脑对象和他们的年龄组。NF - B激活也决定BTBR老鼠的大脑,这是一个有前途的动物模型研究致病机制负责自闭症。我们的研究结果表明,IKK的水平 激酶的磷酸化的抑制亚基 B ,显著增加自闭症题材的小脑。然而,我的表达和磷酸化 B 不改变。此外,我们的研究结果表明,NF -的表达 B (p65)和磷酸化/激活NF - B (p65) Ser536不显著改变小脑皮层的自闭症题材和BTBR老鼠。我们的研究结果表明,NF - B信号通路在自闭症患者的大脑科目不听话,因此可能不会明显参与的过程异常炎症反应在自闭症患者的大脑。

1。介绍

自闭症是一种严重的神经发育障碍儿童在社会交往障碍,赤字在语言和非语言交流,和限制,重复,典型的行为模式和利益(DSMIV标准,美国精神病学协会,1994年)。很多自闭症的大脑区域显示异常,包括小脑浦肯野细胞数量减少半球和小脑蚓体1),颗粒细胞的损失(2),和浦肯野细胞萎缩3,4]。显然对自闭症是由于遗传因素(5,6),但是这种疾病的病因不明,没有生物标志物还没有被证明是自闭症的特征。

BTBR T +特遣部队BTBR)老鼠已经提出为自闭症是一个有用的动物模型研究,因为他们表现出低水平的社交能力与C57BL / 6 J小鼠(B6) (7- - - - - -10]。BTBR老鼠也表现出一种不寻常的模式的超声叫声和高水平的自我打扮9,11- - - - - -13)这可能是同源的通信赤字和重复性行为中观察到自闭症。因此,BTBR目前是一个有前途的老鼠模型理解的机制,可以负责自闭症的发病机制。

最近,新兴证据显示中枢神经系统(CNS)炎症和凋亡机制负责某些神经精神疾病包括孤独症。一些炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF) ,干扰素(IFN) ,il - 1 、il - 6和引发发现大脑中升高,血清、血浆和脑脊液(CSF)自闭症题材的14- - - - - -22]。此外,以往的研究,包括我们,发现凋亡Bcl2蛋白减少,而proapoptotic p53蛋白增加自闭症大脑(22,23]。我们还发现BDNF-Akt-Bcl2抗凋亡通路在额叶皮质受损自闭症题材的22]。BDNF-PI3K / Akt-Bcl2信号通路中起着重要的作用在抑制细胞凋亡、促进神经元存活。

核因子- B (NF - B)是一种重要的基因转录因子介导细胞在炎症反应,免疫,发展,细胞增殖和细胞凋亡24- - - - - -30.]。的活动形式NF - B是局部细胞质和由dna结合蛋白p50 p65子单元和一个抑制亚基,指定的我 B (31日]。我的激活是通过磷酸化 B 在Ser32 Ser36,导致ubiquitin-mediated的蛋白酶体依赖降解 B 释放和NF -核易位活跃 B调光器(31日]。监管的关键一步,这一途径包括激活的高分子量IKappaB激酶(IKK)复杂,组成三个IKK单元紧密相关。IKK 和IKK 作为激酶的催化亚基。大量的基因参与细胞增殖、凋亡和炎症,是规范NF -激活 b这些基因包括抗凋亡基因(Bcl2和Bcl-xl),细胞周期调节基因(细胞周期蛋白D1)粘附分子基因编码,趋化因子、炎性细胞因子和基因参与肿瘤转移(26- - - - - -28,30.,32]。

NF - B信号通路调节Bcl2基因转录。NF - B也是一个重要的细胞因子转录因子。激活NF - B可以刺激肿瘤坏死因子 (33]。肿瘤坏死因子 诱发NF - B p65 polyubiquitination和退化,以及终止肿瘤坏死因子 介导NF - B激活(34]。尽管先前的研究已经表明,BDNF-Akt-Bcl2凋亡通路表达下调和炎性细胞因子增加在自闭症患者的大脑22,35),是否NF - B信号通路改变自闭症大脑尚未研究。在最近的研究中,我们调查了整个NF - 7 B信号通路在小脑自闭症题材及其与正常对照组。我们也决定NF -的活性 B在额叶皮层的6自闭症题材和6 BTBR老鼠相比,控制。我们的结果表明,IKK的表达 、激酶磷酸化的抑制亚基 B 的小脑,显著增加自闭症年龄组相比。我们未能发现IKK 表达我们的样品通过免疫印迹分析和估计是因为IKK的表达水平 非常低。然而,我的表达和磷酸化水平 B ,这是下游IKK的目标 和IKK 在自闭症小脑不显著改变。此外,我们的研究结果表明,磷酸化/激活NF - B (p65) Ser536不显著改变小脑和额叶皮质自闭症题材和BTBR老鼠,相比与控制。这些结果表明NF - B信号通路不管制自闭症题材和BTBR老鼠的大脑。

2。对象和方法

2.1。研究对象

冷冻人脑组织七自闭症题材(平均年龄8.1±2.6年)和7的同龄正常人(平均年龄8.4±2.3年)获得国家儿童的大脑和组织银行发展障碍。捐助者自闭症符合诊断标准诊断与统计手册iv的自闭症诊断证实的采访修订。参与者被排除在研究如果他们脆性X综合征的诊断,癫痫发作,强迫症,情感性精神障碍,或任何其他精神或神经诊断。受试者的信息总结在表1。

表1
研究主题的信息。

六个女BTBR T + tfJ (BTBR)和六个B6小鼠获得杰克逊实验室(巴尔港,我)。老鼠住24小时与广告自由牺牲前食物和水来缓解压力。所有程序进行了符合国家卫生研究院实验室动物保健和使用指南。

2.2。脑组织匀浆的制备

冷冻小脑和额叶皮质组织免受人类和小鼠均质10% (W / V)在寒冷的缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),8.5%的蔗糖,2毫米EDTA, 10毫米 巯基乙醇,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。蛋白质浓度由BCA法[化验36,37]。

2.3。免疫印迹分析

抗体IKK 、IKK ,德国产业投资银行 NF - NF - B (p50/52) B (p65), phospho-NF-kB (p65)从商业来源获得(细胞信号技术,美国)。免疫印迹分析、脑匀浆样品在SDS示例缓冲区(20%的甘油,100毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,0.05% w / v溴酚蓝,SDS 2.5% (w / v),和250毫米德勤)被加热变性在100°C三分钟。40到八十毫克的蛋白质每车道主题是加载到12% acryl-bisacrylamide凝胶电泳在室温下为2 h 120 V (RT)。蛋白质被electroblotted到硝化纤维膜1 h在100 V在4°C。蛋白质印迹被封锁了5%的牛奶在磷酸缓冲盐(PBS)渐变(PBST)为1%。阻塞后,屁股被孵化主要抗体在一夜之间在4°C (anti-IKK 1:1000;anti-IKK 1:500;anti-I B 1:1000;anti-NF - B (p50/52) 1: 500;anti-NF - B p65 1: 500;anti-phospho-NF - B p65 1: 500)其次是二次抗体孵育1 h RT(山羊anti-mouse免疫球蛋白或山羊anti-rabbit免疫球蛋白,合共轭,1:5000年,σ)。在PBST洗涤三次(每次10分钟),这些墨迹使用ECL可视化检测系统(Amersham法玛西亚生物技术)和暴露于超级电影发射极耦合逻辑(Amersham法玛西亚生物技术)。样品密度进行了分析诊断盲,使用图像软件。IKK的密度 ,我 B 和NF - B p65表达乐队,以及 肌动蛋白表达乐队,与背景减法量化。使用未配对进行了统计分析 在测试与意义 。

2.4。免疫组织化学

进行了免疫组织化学研究小脑皮层,薄薄的灰色表层的小脑,组成的一个外分子层,单层的浦肯野细胞,内颗粒层。六个μm石蜡从10%部分formalin-fixed小脑标本的自闭症题材和年龄组deparaffinized二甲苯(2 x)和乙醇(2 x)的100%,80%,50%,和25%浓度和清洗在TBS,每次5分钟。我的部分被孵化 B 抗体(1:200)和NF - B p65抗体(1:150)在一夜之间的水分在4°C室。在0.1 PBS 5分钟,洗后的部分进一步孵化与二次抗体(生物素化的马anti-mouse免疫球蛋白或生物素化的马anti-rabbit免疫球蛋白,VectaStain精英ABC工具包,矢量实验室)30分钟在RT,其次是孵化Avidin-biotinylated中过氧化物酶(VectaStain精英ABC工具包)45分钟在RT和0.0125 g DAB / 25毫升0.05 H TBS / 1下降30%2O210分钟rt,所有部分都洗与TBS序列,25%,50%,80%,和100%乙醇(2 x)和二甲苯(2 x)之前安装在显微镜下查看(西德蔡司)。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

人类phospho-NF - 536 B p65 (Ser)夹心酶联免疫试剂盒和人类phospho-I B (Ser 32)夹心酶联免疫试剂盒(细胞信号技术,美国),根据公司的协议,来衡量phospho-NF -的浓度 B (p65)和phospho-I B 在小脑的匀浆。100年μL每个标准和样品的重复添加到适当的井在96孔酶标涂有反phospho-NF - B (p65)和反phospho-I B 一夜之间,分别和孵化在4°C。盘子都洗4次1 x清洗液(200μ与100年L)和孵化μL检测抗体为1小时37°C。之后,板块被洗4次1 x清洗液(200μ与100年L)和孵化μL (HRP-linked二级抗体30分钟37°C,后跟一个与100年进一步洗5倍和孵化μL(三甲衬底10分钟37°C在黑暗中。100年μL停止的解决方案是添加到每个好,和盘子读30分钟450海里内使用动力微型板块读者(分子设备)。重复的平均OD 450井是策划反对每个试样在相同的稀释系数图。

2.6。统计分析

我们分析了统计学意义组间未配对 以及使用StatView 5.0软件(SAS研究所,Inc .)。所示的样品在我们的研究中都是样品的分析。所有的数据都是意味着±SE。意义是接受 或更好。

3所示。结果

3.1。IKK 蛋白表达增加孤独症患者小脑中的主题

免疫印迹检查IKK进行研究 表达式的小脑自闭症对象和他们的年龄组。结果如图所示1。代表85 kDa的乐队IKK 蛋白表达在小脑孤独症组比对照组(图1(一))。定量分析表明,IKK的平均值 表达增加了35%的自闭症题材与对照组相比( ,图1 (b))。我们未能发现IKK 蛋白表达在相同的样本集,可能由于小脑非常低的表达式。

(一)
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(b)
(b)
图1
IKK 蛋白表达的小脑自闭症。(一)两个独立的免疫印迹研究小脑使用IKK匀浆 抗体(稀释1:1000)。通道1 - 4和9 - 11代表自闭症题材,车道5 - 8和12 - 14代表控制。较低的面板显示了肌动蛋白乐队(MW: 48 kd),和上面的面板显示了IKK 乐队(MW: 85 kd)。(b)所示的屁股(a)被肌动蛋白后量化规范化。数据显示为±SE。 与对照组。白色的酒吧代表控制,黑条代表自闭症题材。
3.2。我的蛋白表达和磷酸化 B 抑制亚基在自闭症题材的小脑

检查我的表达 B 蛋白质和下游IKK的目标 和IKK ,我们进行免疫印迹研究自闭症的小脑和年龄组。结果表明,在我没有显著差别 B 两组之间的蛋白表达(数字2(一个)和2 (b))。我确认这个结果,我们检查了 B 蛋白表达在自闭症小脑和控制采用免疫组织化学。一致,我们发现在我无显著差异 B 两组(图中蛋白表达2 (c))。进一步确定我的活动 B 然后,我们检验我的磷酸化 B 32 (Ser)在同一组样本使用ELISA方法和发现我 B 磷酸化是增加了8.1%±1.9%自闭症小脑样品,但不是重要的年龄组(相比 ,图2 (d))。

(一)
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(b)
(c)
(c)
(d)
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图2
我 B 抑制亚基表达孤独症患者小脑中的主题。(一)两个独立的免疫印迹研究小脑匀浆使用我 B 抗体(稀释1:1000)。通道1 - 4和9 - 11代表控制,通道5 - 8和12 - 14表示自闭症科目。上面板显示肌动蛋白乐队(MW: 48 kd),和较低的面板显示了我 B 乐队(MW: 35 kd)。(b)由肌动蛋白定量分析后规范化。数据显示为±SE。白色的酒吧代表控制,黑条代表自闭症题材。(c)小脑组织化学染色部分使用我 B 抗体(稀释1:200)。我的表达 B 显示为非常微弱的红色中检测出孤独症的神经细胞(箭头)小脑(右面板),以及匹配的控制(左面板)。在高倍显微镜下观察图像。phospho-I (d)测量 B 7自闭症小脑的主题和ELISA的年龄组。 。
3.3。NF - B (p65)蛋白表达的小脑自闭症

IKK的表达增加 激酶可能导致增加NF - B的活动。为了验证这个假设,我们检查了两个单元的NF - B (NF - p65和NF - B B p50/52)小脑的自闭症对象和他们的年龄组。我们没有检测NF -的表达 B p50/52单元,假定它是因为NF -的表达 B p50/52小脑太低被发现使用免疫印迹分析。我们成功地检测到的表达NF - B p65 (65 kDa),发现在自闭症小脑乐队略强于对照组(图3(一个))。然而,定量分析显示,NF -无显著差异 B p65孤独症患者和对照组之间的表达式( ,图3 (b))。这一结果进一步证实了使用NF -免疫组织化学研究 B p65抗体。积极的免疫反应是类似于自闭症小脑和控制(图3 (c))。

(一)
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(b)
(c)
(c)
图3
NF - B p65蛋白表达在自闭症题材的小脑。(一)两个独立的免疫印迹研究使用NF -小脑匀浆 B p65抗体(稀释1:500)。通道1 - 4和9 - 11代表控制,通道5 - 8和12 - 14表示自闭症科目。较低的面板显示了肌动蛋白乐队(MW: 48 kd),和上面的面板显示了NF - B p65蛋白乐队(MW: 65 kd)。(b)所示的屁股(a)被肌动蛋白后量化规范化。数据显示为±SE。白色的酒吧代表控制,黑条代表自闭症题材。(c)使用NF -小脑组织化学染色部分 B p65抗体(稀释1:150)。NF -非常微弱的表达式 B p65(红色)的神经细胞中检测(箭头所示)自闭症小脑(右面板),以及匹配的控制(左面板)。在高倍显微镜下观察图像。
3.4。NF - B (p65)小脑和额叶皮质的活动自闭症

进一步检查NF -的活动水平 B (p65)自闭症大脑的主题,我们检查了NF - 536 B (p65)磷酸化(Ser)自闭症题材的小脑和额叶皮质与ELISA检测和控制。我们的研究结果表明NF的平均值 B (p65)磷酸化在小脑没有显著改变( )和额叶皮质( 自闭症的主题,相比控件(数字4(一)和4 (b))。

(一)
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(b)
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图4
Phospho-NF - B p65浓度在小脑和大脑皮层的自闭症。测量phospho-NF - B p65小脑(() )和皮层((b) )的六个自闭症题材与ELISA和六个年龄组。
3.5。NF - B (p65)小脑和额叶皮质的活动BTBR老鼠

自从BTBR老鼠目前承诺模型理解的机制,可以负责自闭症的发病机制,我们还研究了NF -的活动水平 B (p65) BTBR小脑和额叶皮质的老鼠和B6小鼠(控制)通过确定NF - B (p65)磷酸化Ser 536 ELISA测定。我们的研究结果表明NF的平均值 B (p65)磷酸化在小脑没有显著改变( )和额叶皮质( )BTBR老鼠,而控制B6小鼠(数字5(一个)和5 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图5
Phospho-NF - B p65浓度BTBR小脑和大脑皮层的老鼠。测量phospho-NF - B p65小脑(() )和皮层((b) )的6个BTBR老鼠和6个年龄控制与ELISA B6小鼠。

4所示。讨论

新出现的证据表明,凋亡和炎症机制可能与孤独症的发病机制。大量的研究表明,apoptosis-related蛋白质(p53、Bcl2)和一些炎性细胞因子改变在自闭症患者的大脑3,4,18- - - - - -21]。NF - B是一个重要的转录因子在炎症和凋亡调节细胞反应。大量的基因包括apoptosis-related Bcl2 Bcl-xl,激活和炎症相关的细胞因子,可调节的NF - NF - B(见插图 B信号通路图6)。进一步调查背后机制凋亡和炎症自闭症大脑的变化,我们对转录因子的活动NF - B在小脑和额叶皮质自闭症题材的年龄组。我们还进一步确定NF - B活动在小脑和额叶皮质BTBR小鼠模型的自闭症。这是第一个研究调查如何NF - B信号通路调控的自闭症患者的大脑。我们的研究结果表明,IKK的表达 显著增加了自闭症小脑与正常对照组相比。IKK 的上游激酶NF - B信号通路和磷酸化丝氨酸残基位于两个抑制亚基 B 。这个磷酸化事件导致了我 B 释放的NF - 复合并释放NF - B 复合进入细胞核和激活NF - B B-dependent基因表达(33,38]。增加IKK 表达IKK自闭症大脑暗示可能增加 激酶活性和可能增加磷酸化的抑制 B 亚基。然而,通过检查我的表达 B 亚基,以及我的磷酸化 B 7自闭症题材和小脑的年龄组,我们在我没有发现显著差异 B 两组之间的表达和磷酸化。


图6
NF - B信号转导通路。NF - B p65和p50/52蛋白质之间的异质二聚体位于胞质包裹着我抑制蛋白 B 。通过积分的独到膜受体,各种细胞外的信号(如肿瘤坏死因子 或生长因子BDNF)可以激活酶 B激酶(IKK IKK组成 , , )通过TAK1或PI3K / Akt,分别。反过来,IKK磷酸化 B 蛋白质,从而导致离解的我 B NF - B和最终被蛋白酶体降解。激活NF - B是然后易位到细胞核,它绑定到特定的DNA序列称为响应元素和启动基因转录。

进一步确定NF -的活动水平 B,我们利用免疫印迹、免疫组织化学和ELISA方法检测蛋白的表达水平NF - B p65单元和NF - B p50/52单元,以及磷酸化/激活水平的自闭症患者的大脑中的两个子单元对象和他们的年龄组。我们的研究结果显示,NF -无显著差异 B p65孤独症患者和对照组之间的表达式。的磷酸化水平NF - B p65蛋白在小脑和大脑皮层Ser536自闭症题材的也不是明显不同于对照组。BTBR目前是一个有前途的老鼠模型为理解的机制,可以负责自闭症的发病机制,因为他们展示行为类似于自闭症。因此,我们还研究了NF -的磷酸化水平 B p65蛋白在Ser536 BTBR小脑和大脑皮层的老鼠。我们没有发现显著差异的磷酸化水平的NF - B p65蛋白在小脑和大脑皮层Ser536 BTBR老鼠与控制B6小鼠相比。所有这些结果指出,NF -的活性 B是不听话的自闭症患者的大脑。我们不能检测蛋白表达的NF - B p50/52亚基的小脑自闭症题材或对照组。这种蛋白质的表达水平很低的可能的原因是其不与免疫印迹法检测。

NF - B 536 Ser p65磷酸化调节激活,核本地化,蛋白质-蛋白质之间的关系,和转录活动39]。NF - B p65 NF -亚基 B转录因子NF -积极控制表达式 B-dependent基因参与细胞凋亡和炎症。凋亡Bcl2 Bcl-xl基因和细胞因子基因已被证明是通过激活NF -监管 B p65 [24,40- - - - - -42]。一方面,持续表达了NF - B已被证明导致抵抗细胞死亡的不同诱导的细胞凋亡和NF -增加 B活动最近与发展不同的癌症,尤其是乳腺癌、黑色素瘤、少年myelomonocytic白血病(43]。另一方面,研究表明NF - B是负面调控凋亡Bcl2蛋白质特别是激活血清诱导细胞凋亡过程中撤军。这种激活的NF - B被证明是必要的凋亡程序的执行(44]。这些发现表明NF -一个复杂的角色 B信号在细胞凋亡和炎症的规定。

最近,大量的研究表明,细胞凋亡和炎症在中枢神经系统可能与孤独症有关(3,4,18- - - - - -22]。我们和其他人发现凋亡因子Bcl2是减少在自闭症患者的大脑3,22,23)和BDNF-Akt-Bcl2抗凋亡通路在额叶皮层表达下调自闭症题材的35]。此外,许多研究包括我们的发现,细胞因子TNF 、il - 6、gm - csf干扰素- 中显著升高,引发自闭症受试者的大脑和脑脊液(CSF) (18,21,22]。NF - B所示是转录因子调节Bcl2基因转录和肿瘤坏死因子等炎性细胞因子 (24,29日,42,44]。去等。45)也报道,丙戊酸抑制NF -激活的神经祖细胞死亡 随后B信号通路,增强抗凋亡蛋白的表达Bcl-XL。我们预计NF - B信号改变自闭症大脑的活动。然而,我们的研究表明,NF - B信号不显著改变自闭症大脑与正常对照组相比。这些结果可以解释为(1)改变自闭症大脑的炎症细胞因子和apoptosis-related蛋白质可能不足以刺激或抑制NF - B活动和(2)的结果NF -的双重角色 B在炎性细胞因子和apoptosis-related Bcl2等蛋白质。大量的研究报道,NF - B可以激活转录激活和抑制形式(38,46]。这种双重角色的NF - B提供了相当大的复杂性的理解机制的NF - B行动。

5。结论

我们的研究表明,尽管IKK的表达 激酶,上游的NF - B信号通路,显著增加自闭症题材的小脑与年龄组相比,磷酸化/激活下游的我 B 抑制亚基无法显著改善孤独症患者小脑中的主题。我们的结果进一步表明,表达和磷酸化的NF - B p65不显著改变小脑和大脑皮层的孤独症与对照组相比。的磷酸化水平NF - B p65也不会显著改变小脑和大脑皮层BTBR小鼠模型的自闭症。这些发现暗示NF - B信号通路在自闭症不听话。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

确认

这项工作得到了NYS办公室发育障碍和印度农村慈善信任。