文摘
目标。cd4阳性淋巴细胞迁移到血管壁硬化是一个至关重要的一步。最近的数据表明,ivabradine,选择性(f)声道输出的拦截器,减少动脉粥样硬化斑块形成的载脂蛋白E-deficient老鼠,迄今为止没有了解的机制ivabradine调节斑块的形成。因此,本研究调查是否ivabradine调节chemokine-induced淋巴细胞迁移。方法和结果。刺激与SDF-1导致cd4阳性淋巴细胞在细胞迁移(成倍增加;)。预处理的细胞与ivabradine降低这种影响最大褶皱归纳为0.1µmol / L ivabradine (SDF-1-treated细胞相比,)。ivabradine在cd4阳性淋巴细胞迁移的影响是通过早期抑制介导chemokine-induced PI-3激酶活性由PI-3激酶活性测定。下游,ivabradine抑制活化的小GTPase Rac和肌球蛋白轻链磷酸化(多层陶瓷)。此外,ivabradine治疗减少了f -肌动蛋白形成以及ICAM3易位的腹足细胞,因此干扰两个重要的步骤在T细胞迁移。结论。Ivabradine抑制chemokine-induced cd4阳性淋巴细胞的迁移。鉴于chemokine-induced t细胞迁移的重要性在动脉粥样化形成早期,ivabradine可能是一个有前途的工具来调节这种效果。
1。介绍
动脉粥样化形成是血管壁的炎症过程涉及炎症细胞如单核细胞、巨噬细胞、cd4阳性淋巴细胞(1,2]。在早期的动脉粥样化形成,cd4阳性淋巴细胞趋化蛋白如咆哮和SDF-1所吸引,进入血管壁天真TH0细胞。这些细胞内皮下膜,然后遇到抗原氧化低密度脂蛋白和分化成TH1细胞,随后释放促炎介质如TNF -α和干扰素-γ(干扰素γ)。这些细胞因子支配血管壁的炎症反应通过激活其他细胞,如内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞,从而促进动脉粥样化形成的炎症过程。此外,实验研究表明,cd4阳性淋巴细胞的减少招聘阻碍损伤发展和斑块形成3,4]。尽管如此,大多数的这些研究目标T-cell-specific趋化因子的影响,但迄今为止对调节对cd4阳性淋巴细胞迁移的影响。
流行病学研究表明,心率升高是心血管发病的危险因素患者在初级预防和高血压、冠状动脉疾病和心肌梗塞5- - - - - -8]。增加心率和心率变异性降低已被证明与冠状动脉斑块破裂和亚临床炎症在健康的中年人和老年人9,10]。
减少选择性心率(HR),我(f)声道输出的抑制是一个最近开发的药物在心血管治疗原则。在这些新发现的HR-lowering药物中,只有ivabradine现在已经成为批准临床使用。我(f)声道输出的抑制主要是减少了人力资源,从而提高心肌供氧,能量平衡和心脏功能。Ivabradine耐受性良好,显示出良好的安全性进行研究。
最近的数据表明,治疗ivabradine减少氧化应激、改善内皮功能,防止动脉粥样硬化在载脂蛋白E-deficient老鼠。在这项研究中,ivabradine治疗导致减少氧化应激和MCP-1的差别一个强有力的对这些基因的表达在动脉粥样硬化斑块,导致炎症和降低病变大小(11]。
没有什么是知道的直接影响ivabradine chemokine-induced迁移。
因此,当前的研究调查了影响ivabradine cd4阳性淋巴细胞迁移和细胞内信号分子参与。
2。方法
2.1。细胞培养
人类cd4阳性淋巴细胞分离得到新鲜健康的志愿者的抽血Ficoll-Histopaque (Sigma-Aldrich、德国)梯度离心法获取单核细胞(PBMCs)和随后的负选择cd4阳性T细胞的磁珠分离(Miltenyi研究,德国)所描述的制造商的协议。调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则和被授予大学伦理审查委员会。cd4阳性T细胞的纯度> 97%,由流式细胞术。
2.2。体外细胞迁移试验
隔离后,cd4阳性细胞无血清培养系统在媒体16 h。t细胞趋化性是化验无血清条件下在48-well microchemotaxis室(美国Neuroprobe)。井上下室相隔一个polyvinylpyrrolidone-free聚碳酸酯膜(孔隙大小5μm;配角,Cambridge, MA)。cd4阳性细胞的密度/毫升进行预处理与ivabradine前3小时15分钟的孵化与SDF-1或咆哮(Sigma-Aldrich,德国)。迁移细胞在底部的过滤器被染色,光学显微镜下计算。每口井的细胞数在5随机大功率领域(在控制着200 - 300细胞和SDF-1或RANTES-induced条件大约600 - 700细胞每5随机电源领域)。
2.3。免疫印迹分析
cd4阳性淋巴细胞不及时治疗或孵化与100 ng / mL咆哮37°C(σ)或100 ng / mL SDF-1α(美国纽约北部,普莱西德湖)*表示。细胞细胞溶解在裂解缓冲(50更易与L消息灵通的pH值7.4,150更易与L氯化钠,1% (w / v) NP40, 1% (w / v)甘油、1 L MgCl更易21 L MnCl更易2,10 L更易与氟化钠,1毫米Na3签证官4,10μ克/μl抑肽酶,10μ克/μ0.1 l亮抑酶肽,更易与l PMSF)。整除的细胞溶解产物被煮Laemmli缓冲区之前运行在sds - page。免疫印迹是由运行在硝化纤维膜样品与后续electrotransfer sds - page (Amersham淀粉微球的生物技术,英国Amersham),阻止5%脱脂牛奶在TBS缓冲0.1%渐变20 1 h,和孵化主要抗体anti-Rac1来自北部(美国纽约普莱西德湖),anti-phospho-MLC2, anti-phospho-AKT,从细胞信号和anti-GAPDH(美国贝弗利,MA),反α微管蛋白是σ1:2000稀释的二次抗体(antigoat、antirabbit或antimouse辣根过氧化物酶(DAKO、斯特鲁普、丹麦))。发展是通过使用增强化学发光试剂(美国皮尔斯,罗克福德,IL)根据制造商的规格。
2.4。磷脂酰肌醇激酶试验
隔离后,人类T细胞被孵化RPMI 16小时的介质无血清。细胞进行预处理,持续15分钟有或没有ivabradine与100 ng / mL SDF-1刺激。π3-kinase活性测定标准进行(12)使用山羊反人类的p85 (Santa Cruz)的抗体。
2.5。GTPase活性分析
检测GTP-bound Rac1、孤立cd4阳性淋巴细胞治疗在37°C和100 ng / mL SDF-1 ivabradine的存在与否。500年细胞细胞溶解Rac1-GTP下拉实验μl l Rac1-RIPA缓冲区(50更易与三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.2,150更易/ l氯化钠,10 l MgCl更易2,1% (v / v)特里同x - 100, 0.5% (w / v)钠deoxyholate, 10μ克/μl抑肽酶,10μ克/μ0.1 l亮抑酶肽,更易与l PMSF)。细胞溶解产物是通过在一个台式离心机离心15800 g×15分钟+ 4°C。溶菌产物被孵化20 - 40μg谷胱甘肽S-transferase——(销售税)融合蛋白固定于谷胱甘肽琼脂糖4 b珠子45分钟+ 4°C。的活跃GTP-bound形式Rac1决心通过GST-PAK融合蛋白。珠子与洗涤缓冲洗四次(50更易与L三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.2,150更易/ L氯化钠,10 L MgCL更易2,1% (v / v)特里同x - 100, 10μ克/μl抑肽酶,10μ克/μ0.1 l亮抑酶肽,更易与l PMSF)。沉淀蛋白质分离12% SDS-polyacrylamide凝胶,转移到膜上,并使用适当的抗体检测到。
2.6。ICAM3染色
免疫荧光染色法进行描述之前(13]。总之,1 - 2×106cd - 4阳性淋巴细胞在特殊的孵化4板(合演Corp .)、剑桥、MA)在500年的最后一卷μl完全培养基在盖玻片上涂有胶原蛋白。治疗前SDF-1 (100 ng / mL, 30分钟),细胞被孵化与ivabradine 15分钟。细胞被固定为3.7% (wt /卷)多聚甲醛在PBS, pH值为7.4,在室温和在TBS冲洗。细胞培养与特定抗体ICAM3(鼠标反人类的ICAM3, Caltag,英国)和PBS洗后,carboxymethylindocyanine 3-Cy3-coupled (Dianova,汉堡,德国)山羊antimouse添加免疫球蛋白作为第二抗体(稀释1:1000)45分钟。洗后,幻灯片与DAPI染色(细胞核染色)。与荧光显微镜图像记录(徕卡,位于德国)和细胞5随机选择的领域进行了分析。ICAM-3易位时被认为是目前明确集群ICAM3腹足是可见的。
2.7。f -肌动蛋白染色
cd4阳性淋巴细胞(2×106细胞/毫升)处理SDF-1 100 ng / ml的时候表示15分钟后与ivabradine预处理。刺激后,细胞被固定在3.7% (wt /卷)多聚甲醛在PBS, pH值7.4,然后在室温下洗在TBS(50更易/ L Tris-HCl, pH值7.6,150更易与L氯化钠,0.1% NaN3)。f -肌动蛋白的细胞内染色,细胞permeabilized 0.1% Triton x - 100 10分钟之前第一抗体的应用。细胞悬浊液孵化了30分钟在PBS FITC-conjugated phalloidin(σ。P5282)。流式细胞术分析在一个FACScan cytofluorometer(德国海德堡,正欲),和f -肌动蛋白测定的感应。
2.8。Transendothelial迁移分析
人类cd4阳性淋巴细胞在内皮细胞单层膜迁移进行了如前所述[14]。简而言之,人类内皮细胞培养在gelatin-coated transwell过滤器。cd4阳性淋巴细胞(0.5×105细胞每),经过30分钟有或没有ivabradine(0.05或0.1μmol / L),被添加到参议院transwells插入包含1500μ哈佛商学院。100 ng / mL SDF-1放置在室底部开始轮回。小时后迁移,细胞(众议院被收获,通过流式细胞仪计数。
2.9。统计分析
实验研究的结果报告为平均值±标准偏差(SD)。差异分析1路的方差分析之后,适当的因果检验。一个值<。05was regarded as significant.
3所示。结果
3.1。Ivabradine减少SDF-1-Induced cd4阳性淋巴细胞迁移
检查ivabradine对cd4阳性淋巴细胞迁移,细胞被刺激SDF-1没有或ivabradine面前,和淋巴细胞迁移评估修改Boyden室。SDF-1治疗显著诱导细胞迁移倍(;),15分钟与ivabradine预处理细胞浓度的方式降低这种影响最大在0.1倍感应μmol / L ivabradine (相比之下,SDF-1-treated细胞;)(图1(一))。
(一)
(b)
3.2。Ivabradine减少RANTES-Induced cd4阳性淋巴细胞迁移
接下来,我们检查在RANTES-induced ivabradine淋巴细胞迁移的影响。预处理与ivabradine 15分钟减少RANTES-induced迁移最大浓度的方式在0.1倍感应μ摩尔ivabradine (*相比之下,RANTES-treated细胞;)(图1 (b))。这些结果表明,ivabradine对淋巴细胞迁移的影响是独立于刺激就业。
此外,ivabradine并不影响细胞的生存能力和没有影响评估的趋化因子受体CXCR4的表达流式细胞术(数据没有显示)。
3.3。Ivabradine限制PI-3激酶活性和一种蛋白激酶磷酸化cd4阳性淋巴细胞
PI-3激酶的活化是一个关键的步骤,chemokine-induced t细胞迁移的下游各自的趋化因子受体(15]。因此,我们研究了ivabradine PI-3激酶活动的影响。作为显示在图2(一个)ivabradine有限SDF-1-induced PI-3激酶活性,表明ivabradine调节上游一步chemokine-activated信号级联。
(一)
(b)
PI-3下游激酶的磷酸化AKT在白细胞迁移中起着重要作用[16,17]。SDF-1治疗显著诱导一种蛋白激酶的磷酸化和预处理与ivabradine浓度的方式减少这种影响最大在0.1倍感应μ摩尔ivabradine (*相比之下,SDF-1-treated细胞;)(图2 (b))。
3.4。Ivabradine抑制激活Rac1和多层陶瓷的磷酸化
下游PI3K小ρgtpase是重要的信号分子参与白细胞游走(18- - - - - -20.]。因此,我们评估的影响ivabradine Rac1活动通过执行亲和力与GST-PAK降水实验,只有主动GTP-bound Rac1可以绑定的形式。刺激与ivabradine减少SDF-1-induced Rac1活动浓度的方式为0.1的影响最大μmol / L (*相比之下,SDF-1-treated细胞;)(图3(一个))。
(一)
(b)
在细胞的腹足,磷酸化的多层陶瓷是至关重要的对于actin-myosin收缩性(21]。预处理与ivabradine cd4阳性淋巴细胞显著减少SDF-1-induced磷酸化的多层陶瓷最大浓度的方式在0.1倍感应μmol / L ivabradine (*相比之下,SDF-1-treated细胞;)(图3 (b))。
3.5。Ivabradine减少f -肌动蛋白形成cd4阳性淋巴细胞
下游Rac1, f -肌动蛋白形成在迁移过程中是一个关键机制在细胞分化[22,23]。Ivabradine显著降低SDF-1-induced f -肌动蛋白形成通过流式细胞术(图4)。
3.6。Ivabradine cd4阳性淋巴细胞抑制ICAM3易位
接下来,我们检查的影响ivabradine ICAM3易位在淋巴细胞迁移的腹足,一个关键的步骤,细胞运动(24]。如图5,ivabradine显著减少SDF-1-induced ICAM3易位(图5)与最大减少0.1μmol / L。
3.7。Ivabradine减少SDF-1-Induced Transendothelial cd4阳性淋巴细胞的迁移
的抑制作用促进Ivabradine SDF-1-induced cd4阳性淋巴细胞迁移,我们检查的影响Ivabradine transendothelial迁移试验的T细胞。与ivabradine预处理浓度为0.05μ0.1 mol / L或μmol / L减少SDF-1-induced transendothelial cd4阳性淋巴细胞迁移(*与SDF-1-stimulated细胞相比,,图6)。
4所示。讨论
目前的研究表明ivabradine抑制chemokine-induced迁移cd4阳性淋巴细胞减少PI-3激酶活动,一种蛋白激酶的磷酸化,激活Rac-1和随后的抑制MLC-phosphorylation, f -肌动蛋白形成,ICAM3易位。
Ivabradine发挥防心绞痛的患者和anti-ischemic效果稳定的冠状动脉疾病。临床试验显示改善运动耐量,增加运动诱发缺血时间,和减少环境后心绞痛发作频率(f)声道输出的抑制(25,26]。Ivabradine口服老鼠可以减少他们的心率无影响左心室收缩功能,因此作为工具来研究心率降低脉管系统的影响。Ivabradine减少血管氧化应激的标记,通过降低血管NADPH氧化物活性和降低脂质过氧化作用的标志。此外,提高内皮功能和动脉粥样硬化斑块形成减少ivabradine-treated组(11]。炎症细胞的内容分析,特别是对chemokine-induced cd4阳性细胞迁移的影响。
Chemokine-induced t细胞迁移是由G-protein-coupled受体的激活导致增加PI-3激酶活性(15)和随后的细胞极化形成的前缘和所谓的腹足后(24]。在我们的研究中使用的受体激动剂干扰信号通路通过抑制PI-3 Rac的激酶活性和激活。有趣的是,15分钟预处理cd4阳性细胞ivabradine已经阻止了快速SDF-1对π3-kinase活化的影响,提高这些代理nontranscriptional效应的问题。这里描述这种快速的效果已经看到其他核受体,PPARα和PPARγ。我们自己组的先前的研究显示与PPAR相似的结果γ激活物质(13]。下游π3-kinase和Rac1 ivabradine导致减少f -肌动蛋白形成和ICAM3易位的腹足细胞,从而平衡关键步骤在细胞运动22- - - - - -24]。此外,ivabradine对细胞迁移的影响并不依赖于趋化现象的刺激,因为ivabradine减少SDF-1——以及RANTES-induced淋巴细胞迁移。进一步的研究应该显示如果这ivabradine体外效果也可以观察到体内,如何快速反应的ivabradine chemokine-induced迁移工作。
chemokine-induced迁移的重要性和所示的趋化因子受体表达的CCR5基因缺失小鼠模型。在这些ApoE−−老鼠,从食源性CCR5保护动脉粥样硬化的删除,关联到一个更稳定的斑块表型,减少单核细胞浸润,Th1-type免疫反应,增加白细胞介素- 10”表达式(27]。此外,MIF的封锁(巨噬细胞迁移抑制因子)但不规范CXCR2的配体或趋化因子受体CXCR4在老鼠晚期动脉粥样硬化导致斑块回归和斑块(减少单核细胞和t细胞含量28]。
这里显示淋巴细胞迁移的抑制可能影响动脉粥样化形成的关键步骤。cd4阳性细胞,一旦加入了皮下空间通过趋化因子如SDF-1或咆哮,th1细胞分化,从而释放促炎细胞因子从而促进血管壁的炎症激活其他细胞(1,2]。因此,调节t淋巴球的迁移到血管动脉粥样化形成的炎症过程可能目标节点,因此调节动脉粥样硬化病变发展的关键一步。
确认
这项工作是由德意志Forschungsgemeinschaft(没有的资助。WA 2145 1 - 1) d . Walcher以及由格兰特博士教授从Else-Kroner-Fresenius-Stiftung d . Walcher博士教授。t . Walcher和p .伯恩哈特同样这项工作。