文摘

背景。细菌鞭毛蛋白触发炎症在哺乳动物细胞通过toll样受体(TLR) 5。鞭毛蛋白释放趋化因子引发反应涉及NF - B, p38 MAP激酶和磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)。然而,PI3K据报道已经赞成或抗炎在不同的模型系统。我们推测,这可能是由于p110的不同的活动 和 PI3K的亚型。结果。PI3K和Akt被迅速激活Caco-2结肠癌癌鞭毛蛋白的细胞。使用plasmid-based成分输送系统和小说p110 isoform-specific抑制剂,我们发现flagellin-induced p110引发生产依赖 和p110 。然而在鼠标,抑制p110 但不是p110 降低血清il - 6水平的增加诱导鞭毛蛋白腹腔注射。结论。这些数据表明,p110 和 类IA PI3K的亚型都促炎反应所需的鞭毛蛋白。

1。背景

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白,具有能动性的细胞器种类繁多的细菌物种。鞭毛蛋白也是一个强有力的引发植物的真核细胞的先天免疫反应(1)和脊椎动物(综述(2])。大多数(如果不是全部的话)的反应鞭毛蛋白在脊椎动物上皮细胞由toll样受体(TLR) 53- - - - - -7]。一般来说,通常的激活微生物产品会导致炎症反应的诱导通过MyD88-dependent或独立通路,导致I -κB降解并最终NF -κB和/或IRF-3激活(8]。然而,散度和调制的TLR信号受体/配体对先天免疫反应的一个重要组成部分。这种分歧涉及参与的信号组件除了NF -κ我们和其他人之前报道,flagellin-induced生产中性粒细胞趋化因子白介素8 (IL)需要p38 MAP激酶的活性,并抑制NF -κ与I - BκB降解抑制剂bay11 - 7082结果只有轻微的抑制这种TLR5-mediated反应(9- - - - - -11]。因此,应对引发生产极大地取决于NF -鞭毛蛋白的挑战κB-independent通路。

磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)与NF -κB-dependent TLR结扎后和独立的炎症信号。类IA PI3K由p85调节亚基、p110催化亚基之一( , ,或 ),其主要活动是3 '添加磷酸phosphatidylinositol-4位置,5-diphosphate戒指。类IB PI3K, p101监管和p110组成的 催化亚基,也有类似的活动。由此产生的产品的酶,PI-3, 4、5便士3,通过几种激酶激活下游信号,尤其是一种蛋白激酶和3-phosphoinositide-dependent激酶(此后)1,导致细胞反应,随细胞类型和刺激研究[12]。角色TLR5 PI3K的信号显示在两个先前的研究。第一个,Yu et al。9),发现抑制PI3K的broadly-reactive PI3K抑制剂渥曼青霉素(WM)或LY294002 (LY29)增加il - 6和引发生产T84鞭毛蛋白的细胞,表明PI3K flagellin-mediated信号的抑制肠道上皮细胞(iec)。此外,他们发现从PI3K p85全身细胞因子释放 −−/老鼠在腹腔内注射鞭毛蛋白显著高于杂合的同窝出生的。WM MAPK激活但不是我——增加κ鞭毛蛋白B降解反应。第二个出版,由Rhee et al。13),展示了一种蛋白激酶激活小鼠结肠癌和是非人类结肠细胞(NCM460)鞭毛蛋白处理。相比于et al,他们发现抑制PI3K使用显性负p85或一种蛋白激酶,或LY29,减少引发生产鞭毛蛋白,这表明PI3K增强flagellin-mediated iec的炎症反应。

帮助协调这些矛盾的结果,我们首先确认鞭毛蛋白刺激PI3K Caco-2细胞酶活性,然后评估PI3K的影响抑制flagellin-mediated炎症信号通过直接抑制两类1 iec PI3K表达亚型,p110 和p110 (14),利用RNA干扰和小说,isoform-specific药理抑制剂。我们发现p110抑制 或 显著降低flagellin-induced引发释放,尽管这些亚型抑制MAPK激活产生不同的影响和引发信使rna浓度在人类iec以及在一个在活的有机体内小鼠模型的鞭毛蛋白炎症反应。研究结果表明,PI3K通路TLR5净促炎效应信号,并且在文献报道不一致的结果很可能是由于不同的p110同种型活动。

2。方法

2.1。试剂

文化媒体和补充剂买来σ(圣路易斯)除非另有指示。抗体包括鼠标anti-PK (Serotec;英国牛津大学);鼠标anti-PI3K p85,兔子anti-pSer473年一种蛋白激酶,和鼠标4 g10 antiphosphotyrosine(北部;弗吉尼亚州夏洛茨维尔);兔子antiphospho-p38 T180 /Y182年,总p38, phospho-p44/42 T202 /Y204年,总p44/42(细胞信号;贝弗利,MA);鼠标anti-GAPDH (RDI;弗兰德斯,新泽西州);兔子anti-I -κB C-15和山羊anti-actin(圣克鲁斯生物技术;圣克鲁斯,CA);合山羊anti-mouse(雪松巷;霍恩比,);合鼠标anti-rabbit免疫球蛋白(σ)。LY294002湾11 - 7085,LY303511从Calbiochem购买(圣地亚哥)。Isoform-specific PI3K的抑制剂在体外研究由Kevan gosper Shokat(加州大学旧金山分校)7,15]。tgx - 221和π- 103用于老鼠实验从Chemdea购买(Ridgewood新泽西)LPS-free重组大肠杆菌在[H18鞭毛蛋白是如前所述16]。人类的引发和鼠标白介素elisa来自研发系统(明尼阿波利斯、锰)。鞭毛蛋白是在饱和浓度(500 - 1000年使用 g / ml)近端信号事件Caco-2细胞,并在实验中100 ng / ml PI3K抑制剂或shRNA这个剂量是最大的阈剂量引发生产。

2.2。细胞培养

Caco-2细胞从美国获得类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,MD)和生长在DMEM和4.5 g / L d -葡萄糖,1 x不必要的氨基酸,谷氨酰胺2毫米,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100 与10%胎牛血清(g / ml)的边后卫;Hyclone,洛根,UT)。Caco-2细胞被播种密度 /毫升和用于实验为5 - 14天之后成为支流。从写明ATCC HEK 293 t细胞,生长在DMEM heat-inactivated 10%的边后卫,青霉素、链霉素和不必要的氨基酸。T84写明ATCC是细胞在DMEM / F12 15毫米消息灵通的,笔/喉炎的症状,5%的边后卫。他们被播种在 每口井,播种后用3 - 4天。

2.3。免疫印迹和免疫沉淀反应

鞭毛蛋白治疗的细胞培养6 -或12-well板块为各种时间点之后,两个洗冰冷的磷酸盐(PBS)。治疗细胞细胞溶解在250 - 500 l裂解缓冲(20毫米三pH值7.5,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA NP-40 1%, 2.5毫米焦磷酸钠,1毫米 甘油磷酸盐,1毫米Na3签证官4,1 g / ml亮抑酶肽,1毫米PMSF)和相同数量的蛋白质溶解产物从每个样本通过免疫印迹分析。PI3K的免疫沉淀反应,5 克anti-p85添加到500年 g细胞溶解产物和孵化 过夜。免疫复合物被绑定到蛋白质A-agarose 1小时,洗在裂解缓冲,并分析了通过免疫印迹使用4 g10 1: 1000。

2.4。引发剂/记者化验

Caco-2细胞electroporated pEGFP和引发promoter-luciferase记者质粒和播种在96孔板中描述(16]。6天后,细胞被刺激和细胞溶解Bright-Glo试剂(Promega,麦迪逊,WI)。发光的比率荧光在任意单位(纠正细胞数量和转染效率)计算每个样本,和褶皱增加这个值相比,控制在同一实验中被定义为表达式的成倍增加。

2.5。PI3K体外激酶试验

Caco-2细胞增长至少5天postconfluence 6-well盘子。他们一夜之间血清饥饿,然后用鞭毛蛋白治疗短暂的时间点(外墙面分钟)。细胞被冲洗冷PBS、细胞溶解和免疫沉淀反应与anti-p85琼脂糖和蛋白质。在第二清洗步骤,总容积的20%从每个管被珠子和分析通过免疫印迹p85总额(IP)的控制。剩余的免疫沉淀反应受到体外激酶试验中描述(17]。激酶放射能照像和p85西方印迹被微扫描和分析,和这两个值的比值计算每个样本。

2.6。电泳迁移率改变分析NF -κB

Caco-2细胞播种在6-well盘子镀后至少7天。细胞被美联储1毫升新鲜生长介质和孵化为60分钟后跟鞭毛蛋白信号传导抑制剂或il - 1 30 - 60分钟。核提取物孵化了 标签NF -κEMSA B-binding寡核苷酸和分析,描述在18]。

2.7。定量rt - pcr

Caco-2细胞生长分化在24-well盘子用药理抑制剂预处理30分钟,然后刺激60分钟。细胞是细胞溶解和细胞质RNA分离(Rneasy迷你,试剂盒;米西索加)。等量的RNA从每个样本相对地转录使用上标二世(表达载体),从每个反应进行实时PCR等卷使用Sybr绿色(应用生物系统公司;福斯特城,CA)荧光检测。褶皱的变化引发信使rna被标准化GAPDH标准为每个示例中描述和计算(18]。

2.8。建设和分析p110子单元的shRNA介导击倒

目标序列shRNA-mediated p110击倒 和p110 如下:PIK3CA (Acc。NM_006218), 224 - 244年,PIK3B (Acc)。NM_006219) 1140 - 1161。可拆卸的向量被克隆构建以下寡核苷酸的BglII和HindIII网站pSUPER (OligoEngine): p110 - 1-ATGTTTACTACCAAATGGA (226 - 244);p110 - 2-GGTGGAATGAATGGCTGAA (1302 - 1320);p110 - 1-TGGAATGAACCACTGGAAT (1141 - 1159);p110 - 2-CTGTCACTTGTGGGATTGT (481 - 499)。hek - 293 t细胞被播种在105/在24-well盘子和转染24小时后50 ng的TLR5和500 ng pSuper或派生击倒向量加上1.25 每口井的2000 l (Lipofectamine(表达载体),根据制造商的指示。在额外的24小时中被改变,细胞被刺激和500 ng / ml的鞭毛蛋白转染后48小时。浮在表面的收获6小时后引发的决心,和信使rna被QPCR如上所述量化使用以下寡核苷酸:p110 -ACGTGTGCCATTTGTTTTGAC和 -TTATGAAGAGATTGGCATGCTG;p110 : -AAAAAACTGGCCAGCTCT和 -TAATGCAAGAGAGTCCTT。降价比率被表示为一个褶皱减少mRNA表达相比,细胞表达空pSUPER向量,利用上述计算方法Caco-2细胞。

2.9。老鼠注射

6-12-week-old女性C57Bl / 6小鼠饲养在动物保健设施照顾按照指南的哥伦比亚大学动物保健和使用委员会按照加拿大的规定。小鼠腹腔注射抑制剂或DMSO车辆中描述结果,之后30分钟,10 100年克鞭毛蛋白 l(无菌磷酸盐(PBS)。血液是通过隐静脉注入和前90分钟,3小时后鞭毛蛋白注入。6.5注射7小时后,小鼠安乐死的有限公司2窒息和血液由心脏穿刺。血清是储存在 直到由ELISA检测il - 6 C。

2.10。统计分析

使用VassarStats统计原始数据进行统计计算网站(http://vassun.vassar.edu/ ~洛瑞/ VassarStats.htm)。除特殊说明外,通过方差分析来验证分析了多个组存在显著差异;其次是个人配对t检验或测试图基HSD。

3所示。结果

3.1。鞭毛蛋白导致Caco-2酶PI3K活化细胞

PI3K的活性在细胞溶解产物是通过体外激酶试验来衡量的。如图1(一)Caco-2细胞拥有可测量的基底PI3K活动,符合他们的改造自然和减少内在PTEN活动(19]。在5分钟内与鞭毛蛋白的刺激,增加快速瞬态测量PI3K活动。这个活动30分钟后回到基线(没有显示)。作为额外的测试PI3K激活,Caco-2溶解产物免疫沉淀反应了anti-PI3K p85随后使用antiphosphotyrosine免疫印迹(4 g10)。如图1 (b)flagellin-treated细胞增加了时间信号与控制,PI3K的指示酪氨酸磷酸化与PI3K酶激活(20.]。

(一)
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(b)
(b)
图1
PI3K Caco-2细胞的激活大肠杆菌鞭毛蛋白。(一)在体外激酶试验。Caco-2细胞治疗鞭毛蛋白(警察)1 μ g / ml表示时间的细胞溶解和anti-p85免疫沉淀反应。一个整除的免疫沉淀反应p85被免疫印迹分析,和其余的反应与磷脂酰肌醇 γ - - - - - - 32 P atp,薄层色谱法分离。PIP3乐队由箭头表示。测密度术进行放射自显影图从三个独立的实验如下所示。 * P < 。 05年 ,警察与控制(t以及)。(b) PI3K的酪氨酸磷酸化。Caco-2细胞治疗表示时报500 ng / ml鞭毛蛋白是细胞溶解和anti-p85免疫沉淀反应。沉淀分离的sds - page和西方的屁股g10 antiphosphotyrosine使用4执行。屁股被和reprobed anti-p85确认相同的免疫沉淀反应的效率。结果是代表两个不同的实验。
3.2。Flagellin-Induced NF -κB活动不是PI3K的依赖

我们下一个I -分析κ退化和NF - BκB本地化和DNA结合活性对鞭毛蛋白的反应。如图2(一个)I - flagellin-induced退化κB在LY29 Caco-2细胞没有明显影响,但降低了bay11 - 7082。我们下了NF -κEMSA B核本地化和DNA结合活性。如数据所示2 (b)和2 (c),鞭毛蛋白在NF -引起大量增加κB活动Caco-2细胞并不减少LY29。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
Flagellin-induced I -κ退化和NF - BκB在Caco-2细胞激活是PI3K无关的。(一)I -κB α 降解Caco-2细胞il - 1处理 β (10 ng / ml)或鞭毛蛋白(警察,1000 ng / ml或500 ng / ml)没有被LY29 (30 μ 米),但被湾11 - 7082 (20 μ 米)。Caco-2细胞溶解产物anti-I被免疫印迹分析κB α 和anti-GAPDH乐队密度测量。I -密度κB乐队除以GAPDH规范化对蛋白质加载和转让、和比例是与如果细胞在每个实验中计算I -的数量κB α 退化。从四个不同的实验结果集中。 P < 。 01 通过方差分析和DMSO, DMSO +警察与Bay11 +警察。(b) NF -κB在Caco-2激活细胞电泳迁移率改变分析,衡量了NF -κB带箭头所示。(c)微测量NF -κB-bound探针乐队,汇集从3独立实验。
3.3。PI3K抑制减少引发子活动,在Caco-2 mRNA生产和分泌细胞

Yu et al。9)表明,LY29增加引发生产人类colonocytes T84转换。这个鲜明的对比Rhee et al。13),他发现LY29抑制鞭毛蛋白反应NCM460人类colonocytes是非。为了调和这个矛盾,我们测量引发生产Caco-2细胞。如图3(一个),暂时Caco-2细胞转染引发启动子/荧光素酶记者构造,提高约4倍荧光素酶的表达与鞭毛蛋白治疗后。预处理的细胞与30 M LY29 flagellin-induced荧光素酶表达减少了约四分之一(0.76±0.29; )。LY29也抑制il - 1 全身的荧光素酶表达(0.54±0.023; ,t以及;没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
PI3K抑制减少flagellin-stimulated引发启动子的激活和mRNA生产。(一)Caco-2细胞electroporated和引发剂/荧光素酶报告质粒,转染pEGFP标记和成长中描述的方法。细胞进行预处理与抑制剂浓度显示(或DMSO溶液的体积相同的车辆)之后30分钟,鞭毛蛋白100 ng / ml。6小时后,细胞收获荧光素酶测定和荧光测定。RLU / RFU值计算为每个好,而这些数据归一化到井刺激DMSO +鞭毛蛋白在每个实验。数据显示编译为每个抑制剂至少3实验。 * P < 。 01 (t以及)。(b)引发mRNA测量由至少3编译定量rt - pcr实验。细胞质RNA分离细胞治疗如图所示是反向转录。互补脱氧核糖核酸是放大使用肌动蛋白和引发与实时荧光定量引物。褶皱增加mRNA计算中描述的方法。结果表示为比例相比,细胞治疗与鞭毛蛋白+ DMSO车辆。 P * * < 。 05年 与鞭毛蛋白+ DMSO (t以及)。

抑制PI3K引发mRNA生产的影响是通过实时定量rt - pcr来衡量的。如图3 (b)在引发mRNA,鞭毛蛋白导致显著增加1小时比未经处理的细胞。LY29减少flagellin-stimulated引发信使rna数量约三分之一相比DMSO车辆( )。LY29一直报道影响激酶PI3K以外,如哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)和酪蛋白激酶2 (CK2),我们测试了一个模拟,LY303511 (LY30),而缺乏但抑制mTOR PI3K的抑制活性,CK2 [21- - - - - -23]。不活跃的模拟、LY30没有显著减少引发mRNA表达(没有显示)。相比之下,两个isoform-specific PI3K抑制剂(在下面描述)显示不同的效果,tgx - 221 (p110 )导致引发mRNA的增加,π- 103 (p110 生产没有影响(图)3 (b))。

我们下一个测量PI3K抑制剂的影响引发释放flagellin-stimulated Caco-2细胞。对于这些实验我们使用LY29以及最近出现的,broadly-reactive PI3K抑制剂,GDC0941。预处理细胞与LY29或GDC0941显著抑制flagellin-induced引发释放(图4(一))。我们还测试了影响LY30,雷帕霉素(原型mTOR抑制剂),pp242(小说mTOR抑制剂)。这些抑制剂显著抑制flagellin-induced引发释放Caco-2细胞,这表明影响看到LY29和GDC0941实际上是由于PI3K抑制而不是mTOR或CK2脱靶效应。(图4(一))。绝对值的公布引发DMSO +鞭毛蛋白细胞治疗范围从400 - 800 pg / ml。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
鞭毛蛋白刺激后PI3K抑制减少引发生产Caco-2细胞。Caco-2细胞种子中描述的方法处理(在10所示的抑制剂 μ 米,除了30 μ M LY29 LY30)或同等剂量的DMSO车辆在完全培养基。三十分钟后,鞭毛蛋白添加到最后一个100 ng / ml,浓度和细胞上清液收获3小时后。引发由ELISA测定值在每个实验规范化的鞭毛蛋白+ DMSO井。(一)广泛活性PI3K抑制剂的影响。(b) isoform-specific抑制剂的影响。 * P < 。 001年 和DMSO溶液; P * * < 。 01 和DMSO (t以及)。结果编制每个抑制剂N至少10。
3.4。p110 和p110 都需要Flagellin-Induced Caco-2细胞信号

确定flagellin-induced炎症需要一个特定的类Ia PI3K的同种型,我们使用一组新的化学药剂与特异性不同p110催化亚基。这些列表和标准代理表中找到1。除了LY29, tgx - 221,和π- 103显著抑制引发释放,尽管他们对引发mRNA(图不同的影响4 (b))。两个化合物也抑制CCL20释放Caco-2细胞,LY29一样(见图 在网上补充材料(c) doi: 10.1155 / 2010/652098)。Caco-2细胞相比,T84细胞没有表现出显著改变flagellin-induced引发生产与LY29 tgx - 221,或π- 103,显著增加引发WM ( 倍增加; ,t以及,见图 在补充材料)。这些结果支持的Yu et al。9在iec),表明PI3K信号细胞类型之间的差异。

表1
活动在这项研究中使用的药物抑制剂(IC50在海里)。

作为药物的特异性抑制剂是不完美的,我们试图证实这些结果,利用RNA干扰。shRNA构造被克隆到pSuper向量,使用序列在文献中报道有效推倒类IA PI3K p110催化异型体 和p110 我们知道,这两个表达Caco-2细胞。因为Caco-2细胞转染率相对较低,我们看着引发HEK 293 t细胞分泌,这是高度transfectable并产生鞭毛蛋白转染时引发反应过度表现TLR5(否则他们就很少回应鞭毛蛋白)。与Caco-2细胞,LY29 flagellin-mediated下降引发释放HEK 293 t细胞(37.3±4.1%与LY29抑制;没有显示)。选择多个序列从每个p110同种型和克隆到pSuper生成一组shRNA-expressing质粒。击倒的特定p110信使rna被QPCR证实。不同的可拆卸的结构减少引发flagellin-stimulated分泌,TLR5转染HEK细胞与他们的程度的降价比例由QPCR(图5)。所有结构如图5显著降低引发分泌pSuper相比,转染细胞( 通过方差分析之后t以及)。作为额外的控制,我们发现对p110两个可拆卸的结构 未能抑制引发生产(没有显示)。生产的绝对浓度引发TLR5-expressing细胞带着空pSuper是182.3 + /−96 pg / ml ( )。


图5
p110效果 α - - - p110 β 有针对性的shRNA TLR5-transfected引发生产,flagellin-stimulated HEK293T细胞。细胞转染TLR5和pSuper导数或单独使用pSuper然后刺激与500 ng / ml鞭毛蛋白6小时。引发ELISA测定浓度。pSp110 - α 1,- α 2目标2单独的p110网站 α ,而pSp110 - β 1,- β 2目标p110两个单独的网站 β 。结果表明褶皱增加与基线(引发大量以鞭毛蛋白刺激细胞没有转染TLR5)。列上方的百分比表示的数量要么p110击倒 α 或p110 β 信使rna由定量rt - pcr;结果编制从至少7样本至少3个独立的实验。所有四个可拆卸的显著降低引发生产( P < 。 001年 方差分析)。
3.5。抑制PI3K鞭毛蛋白改变p38和ERK活化反应

确定PI3K的机制抑制减少鞭毛蛋白反应,我们看PI3K抑制MAPK和Akt激活的影响。之前报道,鞭毛蛋白引起一种蛋白激酶的磷酸化,p38,及Erk激酶;此外,余等报道,PI3K抑制导致T84长期激活这些激酶的细胞(9]。tgx - 221和π- 103抑制flagellin-induced Ser473一种蛋白激酶磷酸化,表明鞭毛蛋白的影响由p110 PI3K可以调解 和p110 (图6)。Flagellin-induced一种蛋白激酶磷酸化也抑制了LY29(没有显示)。有趣的是,这两个化合物还导致大幅提高p38磷酸化在1小时,用更少的明显upregulation刺激后只要4个小时。相比之下,ERK磷酸化后一个意想不到的动能,磷酸化抑制剂减少直接和2小时,虽然TGX221,但不是π- 103,造成后期显著提高磷酸化刺激后(4小时)。在一起,这些结果指向PI3K和MAPK通路之间的复杂交互TLR5激活后,和p110揭示不同的活动 和p110 后期监管途径。


图6
p110抑制剂对flagellin-induced Akt, p38和ERK激活。Caco-2细胞serum-starved一夜之间,然后给血清媒体10 μ Mπ- 103 (P)或tgx - 221 (T)或同等体积的DMSO车辆(D)。30分钟后,鞭毛蛋白添加到最后一个100 ng / ml,浓度和细胞后1、2或4小时。总细胞溶解产物分离为pSer473-Akt sds - page和测试,phospho-p38, phospho-ERK免疫印迹。屁股被探测和总Akt和总p38抗体作为加载控制。结果显示典型的三个独立的实验。
3.6。PI3K p110 鞭毛蛋白体内抑制减少炎症反应

测量在活的有机体内PI3K同种型激活的相关性,我们研究了鞭毛蛋白的血清il - 6对腹腔内注射到老鼠。il - 6是常用的作为flagellin-induced炎症反应在小鼠的血清标志物,不产生引发。余等进行类似的实验比较野生型p85 −−/老鼠,发现夸张的反应没有功能PI3K [9]。女性C57Bl / 6小鼠注射100 - 300 l tgx - 221或π- 103在DMSO,单独或同等体积的DMSO,之后30分钟,10 g PBS的鞭毛蛋白。血液是在90分钟,3小时,7小时后鞭毛蛋白注入,血清il - 6测量。一些老鼠也有血液注射前,来建立一个基线,在所有情况下小于或等于125 pg / ml。所有这些注射后小鼠表现出轻度体力活动减少,这可能是由于已知的抑制剂DMSO溶液的影响。没有老鼠死亡或任何其他展出的痛苦的迹象,如刻板动作,弯腰驼背的姿势,折边毛皮等,如图7,老鼠接受tgx - 221有一个显著降低血清il - 6 90分钟后鞭毛蛋白注入,而DMSO车辆。从π- 103治疗小鼠血清中il - 6的分泌增加,尽管这不是统计学意义。在3小时,不再明显的差异。应该注意,π- 103小鼠的血清半衰期据说短,虽然组织间隙是慢得多(29日]。血清就tgx - 221还没有报道,但在大鼠抗血栓形成的活动持续至少60 - 90分钟后静脉丸(16]。


图7
p110抑制剂对小鼠的影响对鞭毛蛋白的反应在活的有机体内。女性C57Bl / 6小鼠腹腔注射200(6 - 12周) μ tgx - 221 g或π- 103在PBS 75% DMSO,或同等体积的DMSO / PBS。三十分钟后,小鼠腹腔注射10 μ 克大肠杆菌100年H18鞭毛蛋白 μ PBS的l。隐血液除了90分钟后,3小时。分析了血清il - 6浓度的ELISA和结果表示为比例相比,鞭毛蛋白+ DMSO控制在每一个时间点。意味着血清中il - 6浓度鞭毛蛋白+ DMSO车辆组1567 pg / ml 90分钟,在3小时4915 pg / ml。 N = 4 每组。 * P < 。 05年 tgx - 221和DMSO溶液,t以及。

来验证我们的鞭毛蛋白的纯度准备、C57Bl / 6 TLR5−−/老鼠注射相同剂量和准备的鞭毛蛋白和il - 6测量。三个小时的il - 6生产最小与野生型小鼠相比,这些老鼠( 与 pg / ml, ,而不是如图所示)。血清il - 6低于试验检测极限(50 pg / ml)对小鼠前鞭毛蛋白治疗。

4所示。讨论

我们的结果表明,PI3K激活TLR5鞭毛蛋白的激活Caco-2净促炎效应细胞,这种影响并不是通过upregulation NF -介导的κB或p38 MAPK活性。此外,我们表明,p110 和p110 亚型导致这种效果,尽管通过不同的机制可能涉及ERK的磷酸化,并可能引发mRNA翻译,这可能会导致nonredundant效果在活的有机体内。

这些研究结果尤其相关,因为当前的争议PI3K在TLR信号的作用,支持和抗炎作用在各种上皮细胞和造血细胞从老鼠和人类。此外,TLR5差异活动牵涉到一些人类疾病,包括克罗恩病(30.,系统性红斑狼疮31日),而军团菌肺炎(32]。虽然TLR5表达上皮细胞和造血细胞,这些细胞的接触自然TLR5配体有极大不同,鞭毛蛋白。因此,毫不奇怪,信号以响应鞭毛蛋白将这些细胞类型之间的差异,和PI3K等下游激酶使者的参与是一种可以实现这种差异。

类IA PI3K的近端传感器广泛的细胞外信号。生长因子等刺激,g蛋白耦合受体配体,细胞因子,和维生素D3可以招募p85调节亚基质膜,p110催化亚基的转换(优先)PI-4 5便士2PI-3, 4、5便士3(10]。PI-3 4 5便士3结合和调节蛋白激酶通过pleckstrin-homology域和其他目标。这些目标的研究最多是phosphatidylinositol-dependent激酶1(基因),一种蛋白激酶(蛋白激酶B),酪氨酸激酶,鸟嘌呤核苷和核苷酸交换因素(12]。进一步的下游,I -等其他蛋白质κ激酶B亚型(IKK) mTOR,蛋白激酶C - 几个凋亡因素可以被激活,使PI3K许多信号转导途径的重要近端元素(33]。

有两种截然不同的p85亚型( 和 )和四个p110亚型( , , , )。这些不同的组织分布,所有四个p110亚型表达于造血细胞只有 , , 表示在正常上皮细胞。值得注意的是,p110 表达式是缺席在结肠细胞腺癌,包括Caco-2细胞(15]。虽然所有的子单元似乎催化相同的酶反应,有不同的细胞反应有关,其中一些可能是由于独特的定位,甚至非酶的活动。例如,p110 显示绑定到Akt在3 t3细胞的细胞核,促进DNA复制期间伸长(34]。相比之下,p110 在同一项研究细胞生存所需。

在TLR和il - 1 信号,PI3K被认为是招募p85的膜通过绑定到一个特定的YXXM MyD88主题,导致激活PI3K的13]。然而,在TLR4的情况下,结合PI3K可能导致磷酸肌醇PI3K的封存和随后的减少活动轴(35]。总的来说,PI3K活动的净效应可以赞成或抗炎根据系统研究。例如,抑制PI3K增加cox - 2 upregulation TNF -的反应 或者在结肠上皮细胞il - 1 (36),但降低cox - 2 upregulation月桂酸在原始巨噬细胞(37]。抑制PI3K LY29或WM减少引发表达式在某些实验模型,而不是其他人的(38- - - - - -41]。即使在相同的细胞类型,PI3K不同会影响炎症基因的表达。例如,LY29减少MIP-1表达式 和MIP-1 信使rna,但是增加引发mRNA在树突细胞孵化有限合伙人(42]。PI3K在NF -的影响κB也随系统研究,包括抑制或激活NF -κ在I - BκB-dependent或独立的方式43- - - - - -47]。

许多出版研究PI3K的影响的一个问题是,药理抑制剂的使用是不一致的,与渥曼青霉素(WM), LY29,或者两者都用在不同的报告。在WM浓度低于50 nM PI3K非常特殊,它确实有活动对平滑肌肌球蛋白轻链激酶(IC50260海里)(23]。虽然比WM更稳定,LY29不够有力,在类似的浓度和抑制CK2 mTOR它抑制PI3K [21,23]。这些活动可以解释不同甚至相反的药理效应的LY29和WM发表在各种细胞系统(48- - - - - -50]。

因为这些问题,几个最近的研究专注于特定的角色p110亚型TLR信号。尽管没有报告检查p110亚型在TLR5信号,他们研究了TLR4通路。Utsugi等人发现p110 ,但不 ,积极监管LPS-induced il - 12在人类生产DCs和巨噬细胞51]。相比之下,在小鼠巨噬细胞,冢本等人发现shRNA-mediated p110的抑制 增加一种蛋白激酶磷酸化和减少伊诺和il - 12的生产活动,而p110 在这些标记(抑制了相反的效果52]。他们得出的结论是,p110 或差别参与对这些负面反馈的TLR信号。虽然这些结果符合末增加活跃鞭毛蛋白刺激后,我们观察到在tgx - 221,在其他方面我们的发现是完全不同的。例如,我们发现tgx - 221和π- 103人同样有效减少flagellin-induced一种蛋白激酶磷酸化,tgx - 221,但不是π- 103,降低il - 6生产应对鞭毛蛋白注入老鼠体内。

PI3K的isoform-specific药理抑制剂用于这项研究开始证明非常有用的角色在决定个人p110亚型,特别是在模型成分是不切实际的(如主细胞或在活的有机体内)。例如,狡猾的et al。发现p110抑制 tgx - 221增加了TLR4 -或TLR9-mediated小鼠巨噬细胞il - 6生产而p110 , , 抑制剂有相反的效果53]。这些抑制剂的非常具体的性质产生了兴趣在不同临床使用的设置,包括血小板抑制和癌症治疗。然而,这些特工TLR5信号的影响,甚至在iec任何模型系统,之前没有检查。

我们的研究结果的相关性进一步增加了现有争议关于PI3K在TLR信号的作用,特别是在TLR5。正如上面提到的,玉等人和李等人发现相反的影响TLR5抑制PI3K的信号(前促炎和抗炎后者)。卡托等人额外的报纸中报道了抑制TLR5信号在WM TLR5-transfected HEK细胞,尽管这不是他们的工作的重点54]。我们假设p110微分的影响 和 亚型(表达的形式改变了iec)将会是一个可能的解释这些差异。

我们的研究结果清楚地使局面有利于或PI3K净Caco-2和HEK细胞促炎的活动,与原始细胞和T84细胞。我们发现p110抑制 或p110 使用成分或药理学封锁导致减少引发NF -独立的生产κB和p38通路。这是尽管没有影响或引发mRNA通过rt - pcr检测到的激活效应。事实上,我们发现,et al, PI3K抑制导致增加Caco-2 p38磷酸化细胞,和强大的促炎效应T84 WM(但不是LY)的细胞。鉴于封锁p38和NF -κB都被证明能减少flagellin-induced引发生产,这一发现有点奇怪,表明一个替代,PI3K-dependent通路参与TLR5-induced引发生产iec(也许是一个涉及转录后的调控)。未来的研究将需要调查蛋白可能参与这个途径。

增加额外的意想不到的观察是已故的ERK磷酸化后p110的封锁 ,但不是p110 。这一发现,伴随着我们在活的有机体内结果在老鼠中,确认有事实上不同的促炎途径利用p110 和p110 。我们所知,这是第一次报告的使用tgx - 221在活体动物模型,及其缺乏明显的毒性在进一步的研究表明,它可能是有用而特定的p110抑制 可能是有用的。一个有趣的观察是,抑制il - 6生产明显刺激后只在最早的时间点。血清半衰期以来tgx - 221是未知的,这可能是严格由于药代动力学的影响,但它是有趣的推测,后期增加的活跃在体外将反映p110的两相的影响 信号。

总之,从我们的研究显然PI3K的TLR5炎症通路包括激活,抑制要么p110 或p110 块的生产引发Caco-2 iec在体外而只有p110 似乎从小鼠il - 6生产所需在活的有机体内。此外,p110抑制减少引发生产,同时增加MAPK活性没有改变NF -κB活动,建议其他重要的分子靶点的PI3K的存在,最终促进趋化因子生产应对鞭毛蛋白。未来的研究这些新靶点可能导致flagellin-related疾病的新疗法的发展,包括克罗恩氏病和细菌性肠胃炎。

确认

作者希望感谢Kevan gosper Shokat Morri Feldman科学建议和提供这些实验中使用的试剂。他们愿意承认尼尔Reiner科学讨论和评论。本文由以下赠款支持t·s·施泰纳:Burroughs-Wellcome事业奖在生物医学科学992840.01中,加拿大卫生研究机构(CIHR)操作赠款,加拿大创新基金会新机会基金4453年,新的调查员CIHR的奖状和温哥华沿海健康研究所“为了生活”基金。n·r·格雷厄姆和洛杉矶朔吧通过CIHR培训拨款。l . m .狡猾的支持加拿大胃肠病学协会/克罗恩氏和结肠炎基金会加拿大/ CIHR新调查员工资奖。

补充材料

图4 c: PI3K抑制剂对flagellin-induced CCL20 Caco-2细胞分泌物。细胞治疗tgx - 221 (10 uM),π高103 (10 uM) LY294002(30嗯)或同等体积的DMSO车辆,其次是鞭毛蛋白100 ng / ml 3 h。上层清液被ELISA分析为CCL20浓度。结果显示平均+ / - SD为N = 6。* p < 0.002;* * p < 0.001和DMSO控制。

图4 d: PI3K对抑制剂的影响从T84鞭毛蛋白诱导引发应承担的分泌细胞。T84细胞生长在与镀5%胎牛血清的DMEM / F12 24-well菜肴和刺激2 d后鞭毛蛋白100 ng / ml有或没有PI3K抑制剂或DMSO车辆。上层清液进行了分析后引发3 h。结果表示为一个褶皱的变化引发分泌比鞭毛蛋白+ DMSO车辆从N = 4到6为每个复制抑制剂。* p < 0.01和DMSO溶液。

  1. 补充图4 c
  2. 补充图4 d