文摘

肝脏移植受到不可避免的伤害,由于缺血植入前和操纵。危险信号,如高机动组框1 (HMGB1)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)免疫反应中发挥关键作用。我们释放到污水的动力学特征在冷/热缺血和额外manipulation-induced机械损伤。此外,我们评估之间的关系HMGB1 / MIF释放和缺血性/机械损伤。肝酶和蛋白质的废水缺血时间的增加而增加。HMGB1 / MIF -释放与肝细胞损伤的程度。随着缺血时间和损害,HMGB1从细胞核转移到细胞质的弱核和强劲的胞质染色。增强肝损伤的机械损伤是由早先表示HMGB1易位到细胞质和早些时候释放危险信号进入废水。我们的研究结果表明,HMGB1的确定和MIF反映缺血性损伤的程度。此外,HMGB1and MIF更敏感比肝酶检测造成的额外的机械损伤在器官移植手术操作。

1。介绍

“移植损伤”一词描述的组合所有破坏性事件造成贪污在移植过程。移出损伤程度有关的机械应力在器官操作和在某种程度上是不可避免的在切除器官捐赠者。机械应力可能取决于个人的外科医生以及个别病人。缺血损伤诱导的缺血和冷缺血。再灌注损伤和主要机械植入损伤发生在器官移植。

损害的细胞会导致释放危险信号从垂死的细胞或激活免疫细胞1]。危险信号伤害转化为分子事件,触发先天和适应性免疫反应(1,2]。

无论造成损害对身体是有害的。这是免疫学的危险模型的基本思想,介绍了1994年由Matzinger [3]。根据免疫学中的危险模型,只有抗原呈递细胞激活细胞报警信号不良细胞能够启动免疫反应在一个生物体(4,5]。报警信号,如热休克蛋白70 (6]和高机动组盒蛋白1 (HMGB1)是内源性危险信号7,8]。危险信号形式有关分子模式(抑制)9]。由模式识别受体,抑制检测组织炎症和免疫反应(10,11]。危险信号的作用肝移植损伤评估尚不清楚。量化的危险信号,如HMGB1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)移植物植入前,可能会有帮助量化的胚胎植入前的器官损伤和器官质量可以作为一个指标,特别是在边际移植。

2。材料和方法

2.1。实验设计

实验旨在研究热缺血和冷缺血的影响以及机械损伤细胞内的位置和释放破坏markers-HMGB1 MIF-into生理盐水。温暖的缺血性损伤是引起肝脏储存在37°C。冷引起的缺血性损伤肝脏储存在4°C。额外的机械损伤是造成把重量放在肝脏移植。两个老鼠菌株被用来测试是否释放应变独立(表1)。

2.2。动物

男性天生的刘易斯和BN大鼠(中央大学医院埃森的动物设施),体重约300 - 350克,被用于这项研究。所有的动物都被安置在动物护理标准条件下,免费获取水和鼠粮随意。根据德国所有程序进行了动物福利立法。动物实验是批准的Bezirksregierung杜塞尔多夫。

2.3。外科手术

与异氟烷吸入麻醉下手术进行(美国圣路易斯Sigma-Aldrich),(异氟烷浓度3%,氧气流0 5 l / min)。与横向切口打开腹腔后,肝脏被释放的韧带和冷生理盐水冲洗。

机械应力组、肝脏受到机械应力反复通过将一个金属的重量100克(10次)1分钟前对肝脏原位移植。

Infrahepatic腔静脉和门静脉插管与12 G和14 G导管,分别。空心肝脏被安置在孵化器(37°C)或冰箱(4°C)。在确定的间隔时间(30分钟热缺血,1 h冷缺血),刷新了肝脏生理盐水(4°C)的恒压10厘米h₂O通过门静脉和1.5毫升污水收集从infrahepatic腔静脉。蛋白酶抑制剂(1 ug / ml抑肽酶,1 ug / ml亮抑酶肽,1 ug / ml抑肽素,1毫米PMSF 1毫米氟化钠1毫米Na3VO4)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)被添加到污水样品后立即集合。样本之后离心去除红细胞。

2.4。肝损伤评估

评估肝细胞损伤后冷或热缺血,天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)是使用一个自动化的测量在废水化学分析仪(拜耳;德国勒沃库森,)。

2.5。组织病理学

肝组织缓冲福尔马林固定在4.5%至少24小时。石蜡包埋了使用标准技术。部分(4μ米)与Hematoxylin-Eosin剪切和染色。组织学评价集中在细胞损伤的迹象,如液泡化,细胞分裂,细胞肿胀,坏死。

2.6。凝胶电泳和免疫印迹

废水样品中煮10分钟1 x加载缓冲区(0 06 M Tris-HCl 5% SDS, 0.3%溴酚蓝,10%的甘油,和0,1米二硫苏糖醇)和分离1,5毫米迷你凝胶12% SDS - page。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)使用坦克传输单元(美国旧金山Hoefer)。膜被封锁使用5%牛奶溶液(5%脱脂奶粉、0.1%渐变20在PBS)在室温下1 h。主要抗体(anti-HMGB1多克隆抗体,1:1000年,Abcam,剑桥,英国;Abcam anti-MIF多克隆抗体,1:3000年,英国剑桥)被添加到膜在室温下1 h。探讨了膜与二级山羊antirabbit或驴antigoat抗体结合辣根peroxidise (Abcam,剑桥,英国)。执行检测采用Lumi-Light免疫印迹基质(罗氏应用科学,曼海姆,德国)和高灵敏度的电影(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。数字化的电影进行了使用扫描仪(爱普生V750、长野、日本)。量化带密度进行了使用图像J 1.40克(美国贝塞斯达国立卫生研究院)。一个标准曲线覆盖范围从0到2000 ng / ml生成使用重组HMGB1(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)计算HMGB1在废水的浓度。 In contrast, the result of the quantification for MIF was expressed in arbitrary units, since no purified recombinant MIF was available.

2.7。银染色

电泳后,丙烯酰胺凝胶中孵化解决缓冲区1 h(40%乙醇、10%乙酸)。随后,凝胶被浸没在乙醇5% - 5%醋酸一夜之间解决方案。凝胶然后在蒸馏水冲洗5分钟,浸泡在10%戊二醛溶液(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)在室温下30分钟。戊二醛是被用去离子水洗涤。凝胶在刚做好的孵化0.1%硝酸银氨溶液(默克公司,达姆施塔特,德国)30分钟。孵化后,凝胶又短暂在蒸馏水洗,然后孵化在发展中解决缓冲区(0.01%甲醛和0.01%柠檬酸)5到10分钟。反应停在添加5%醋酸溶液凝胶。

2.8。免疫组织化学染色

HMGB1的免疫组织化学检测,在水浴抗原进行检索使用citrate-EDTA缓冲区(10毫米柠檬酸、2毫米EDTA,渐变20 0.05%,pH值6.2)为20分钟100°C。非特异性蛋白质绑定被使用100 ul血清阻断缓冲区(Dako、斯特鲁普、丹麦)。幻灯片和PBS洗3次。部分与稀释孵化(1/500)多克隆兔anti-HMGB1抗体(Abcam,剑桥,英国)在室温下1小时。幻灯片和PBS冲洗,执行和检测使用PowerVision goat-anti-Rabbit-AP(免疫、Duiven、荷兰)采用坚牢红(Dako、斯特鲁普、丹麦)作为衬底。部分与苏木精复染色5分钟。染色是使用数码相机记录(奥林巴斯、东京、日本)安装在显微镜(徕卡,位于德国)200倍的放大。从每个小叶区(三个照片12]分析HMGB1染色都是随机选择的。肝细胞的百分比只有核HMGB1染色,只有细胞质HMGB1染色肝细胞总数的三个拍照(800 - 1000细胞)计算。

2.9。统计分析

数据表示为平均数±标准差。组之间的差异被单向方差分析分析评估的意义。双变量的相关性和斯皮尔曼等级相关的测试。所有测试都使用SigmaStat v3.5执行(Systat-Software, Erkrath,德国)。一个下面的值。05was considered statistically significant.

3所示。结果

3.1。蛋白质在废水增加缺血时间和随后的机械应力

移植损伤导致一系列蛋白质的释放,如肝酶、危险信号,等等。总蛋白废水被作为一个参数反映出的蛋白质释放到缺血的解决方案,从而表明损坏贪污。的定性评估移植造成的废水中蛋白质组成的变化和局部缺血损伤,银染色进行凝胶电泳后废水样品。蛋白质释放到污水后开始1/0.5 h(冷/热缺血和缺血时间(数据的增加而增加1(一)和1 (c))。数组内的蛋白质释放到污水,我们确定了一种蛋白质分子量约28-kDa对应HMGB1的分子量和另一种蛋白质分子量约13-kDa对应MIF的分子量。我们经免疫印迹,乐队和相对应的分子量HMGB1 MIF显示相应的抗体的积极信号。额外的机械损伤增强蛋白质释放(数字1 (b)和1 (d))。废水从BN获得肝脏显示类似的动能和染色模式作为废水取自刘易斯肝脏(数据未显示)。

3.2。肝损伤和缺血时间和机械应力增加

确定肝细胞损伤的程度与移植缺血期,AST和ALT测定废水。AST中无法移出后,随着时间的推移逐渐增加在温暖或冷缺血(数字2(一个)和2 (b))。适度释放肝酶(平均> 10 U / L)观察0.5 h / 2 h后暖和/冷缺血。大量释放(平均> 100 U / L) h 1 h / 13小时后发生的热/冷缺血。AST释放发生前(0.5 - -1.5小时/ 1 - 12小时暖和/冷缺血),达成更高,尽管没有显著提高()水平当移植移植期间受到额外的机械应力。也获得了类似的结果ALT和不影响大鼠压力(数据没有显示)。

肝脏组织学证实肝损害与缺血时间增加。)染色显示正常肝形态学在早期时间点(0 h, 4 h冷缺血,0,0,5 h温暖的缺血,resp。)(图2 (c))。细胞质液泡化和碎片hepatocytcellular核以及肝细胞分离后发生1 8 h(热/冷缺血,分别与增加缺血时间,成为著名的。进步的细胞形态学的变化,如细胞肿胀,胞质空泡形成,和核分裂,观察1小时和6小时之间温暖的缺血,和类似的结果当延长冷缺血时间从12小时缩短到24 hr(图2 (d))。

3.3。HMGB1染色模式的转变在肝细胞延长冷/热缺血

进行免疫组织化学染色观察HMGB1的胞内分布在肝细胞经历寒冷和温暖的缺血(数据3(a1)和3(a3)),以及额外的机械损伤(数字3(a2)和3(a4))。肝细胞的百分比与核HMGB1染色,细胞质HMGB1染色,分别计算(图3(b))。免疫反应性HMGB1被发现在肝细胞的细胞核在正常肝脏(0人力资源)。单个肝细胞(大约1%)显示细胞质染色。延长热/冷缺血2/8小时时,细胞的比例,并有很强的细胞质暖和/冷缺血(> 85%)和弱或没有核染色大幅提升。当延长脑缺血时间进一步6/24小时热/冷缺血,几乎没有核染色暖和/冷缺血(< 5%),只有薄弱或未发现细胞质染色。

3.4。机械应力与HMGB1易位

肝细胞的百分比与细胞质HMGB1易位表示弱核和强烈的机械应力后立即细胞质染色显著增加大约10%。肝脏无机械应力相比,这种差异具有统计学意义()。Nonparenchymal肝细胞发挥重要作用在热/冷缺血的病理生理学。激活枯氏细胞已被确定为一个关键HMGB1和MIF的来源。枯氏细胞和正弦内皮细胞呈现弱核染色和强胞质染色后立即移出(图4)。在肝细胞的染色模式相比,在血管内皮细胞和胆管上皮细胞染色模式保持不变。血管内皮细胞为阴性HMGB1在所有时间点。胆道上皮细胞缺血过程中强烈HMGB1积极整个观察期(图4)。

3.5。HMGB1和MIF释放到污水取决于损伤的程度

确定HMGB1和MIF被释放,与肝细胞损伤,免疫印迹分析进行污水样品获得缺血期间在定义的时间点。HMGB1以及MIF释放检测早10.8小时(8 hr-12 hr)冷缺血或1.9小时(1.5人力资源- 2.5人力资源)热缺血和逐渐增加(图5(一个))。10分钟的体重压力引起的机械损伤在移植之后,温暖或冷缺血大大增加HMGB1的释放和MIF废水。带密度评估使用图像J和表达为ng / ml (HMGB1)或任意单位(MIF)(图5 (b))。机械应力组,HMGB1已经发现后0.96小时(0.75 - -1.5小时)温暖或6.50小时(5 - 8小时)冷缺血,分别,这明显早于团体只遭受缺血性损伤(,、职责)。

在这些时间点(0.75 - -1.5 h第5 - 11 / h在温暖/冷缺血缺血),HMGB1的相对浓度的废水也明显高于与群体相比只受到缺血()。MIF释放,也检测到免疫印迹,遵循了类似的动能释放HMGB1和也发布在机械应力明显高于缺血。相比之下,额外的机械应力不会导致明显高于肝酶释放到污水与组只受到缺血()。

类似的释放HMGB1的模式移植也观察到BN肝脏,这受到24小时冷缺血。这些数据表明,HMGB1 strain-independent的方式被释放在肝缺血(数据没有显示)。

3.6。AST和ALT HMGB1和MIF显示类似的释放模式

我们确定的相关性肝酶的释放和缺血时间的长度。确定这种相关性,数据从寒冷和温暖的缺血没有额外的机械损伤。AST与冷或热缺血时间呈正相关(,和,,分别地。,(Figures6(一)和6 (b))。评估危险信号的释放和缺血时间之间的相关性显示中度HMGB1的相关性和MIF释放到污水与冷的长度(,和,、职责)和温暖,和,,分别地。,Figures6 (c)和6 (d))缺血时间。

计算相关性HMGB1释放和肝酶,分别废水HMGB1适度与废水中AST (,)(图6 (e))。MIF, AST释放也适度相关(,)(图6 (f))。类似的结果ALT(数据没有显示)。HMGB1释放BN肝脏是适度与肝酶的释放(数据没有显示)。

4所示。讨论

在之前的大鼠肝移植研究中,我们表明,所有大鼠肝移植后48 h内死亡时盐的冷缺血时间延长至10 h。近50%死于一次冷缺血时间9小时的工作。贪污的冷缺血一段下9 h与100%存活(论文投稿)。在AST显著增加,ALT以及HMGB1 MIF 9至10 h后观察缺血,移植物缺血时间的长度相同,导致减少了动物的生存。

HMGB1释放后缺血性损伤的肝脏在临床和实验研究。HMGB1已经涉及到肝脏缺血/再灌注损伤(13)、肾(14,心15),和大脑16]。Ilmakunnas等人首先评估危险信号HMGB1作为肝细胞损伤的标志。在他们的研究中,HMGB1被察觉人类肝移植前的体循环,峰值出现10分钟后门静脉declamping和AST显示中度相关。他们得出结论,HMGB1释放人类的肝脏移植可以作为肝损伤的标志(17]。Tsung观察小鼠缺血/再灌注模型,HMGB1蛋白表达在肝脏增加随着时间24 h后60分钟的热缺血肝脏(18),建议积极生产HMGB1除了细胞释放有关。

炎症细胞外HMGB1中介(1,19- - - - - -21]。HMGB1之前从细胞,释放HMGB1转移离原子核到细胞质中。易位与乙酰化作用[22],磷酸化[23)和甲基化24HMGB1的]。一旦释放,HMGB1通过其受体发挥生物学效应。几个受体参与HMGB1信号,包括先进的糖化的受体最终产品(愤怒)和家庭toll样受体,如toll样受体4 (TLR4);toll样受体2 (TLR2), toll样受体(TLR9识别)[925,26]。这些受体的信号引起生产和释放炎性细胞因子的免疫细胞。在我们的研究中,我们发现,HMGB1被释放后肝细胞长期暖和/冷缺血。HMGB1释放到细胞外空间可能是由两种不同的机制(27]。一种机制是一个活跃的分泌过程。这种机制是受雇于免疫细胞;HMGB1可以主动分泌激活巨噬细胞,NK细胞,成熟骨髓DCs (22,28,29日]。第二个机制是一个被动释放的过程。HMGB1时释放细胞发生坏死(30.- - - - - -35]。在这项研究中,HMGB1转移的肝细胞的细胞质和细胞核细胞外空间。HMGB1的动能易位在平行的整体损伤器官移植,肝损伤标记物的释放(AST和ALT)以及废水中蛋白质的增加证明了在聚丙烯酰胺凝胶银染色。易位的细胞质被释放到污水前。损失的细胞质HMGB1平行检测废水;支持假说HMGB1确实发布了受损的肝细胞。

MIF释放后缺血性损伤的肝脏在临床和实验研究。MIF是另一个著名的免疫细胞释放细胞因子和炎性疾病中起着重要的作用36- - - - - -39]。据报道,MIF由肝细胞中表达[观察40]。与大多数细胞因子MIF存储在细胞内池和分泌立即通过非传统protein-secretion通路之前新创蛋白质合成(41]。MIF在刺激巨噬细胞释放的脂多糖(LPS),肿瘤坏死因子-α(TNF -α),或移行细胞(IFN -γ)[37,41]。MIF水平升高在组织和血清在小鼠脓毒症模型37),还增加了感染性休克患者的血清42]。据报道,等离子体MIF肝切除术后患者中显著升高,表明MIF在中介作用的手术后全身炎症反应损伤(43]。快速增长的证据支持MIF参与炎性反应和缺血/再灌注损伤(44,45]。据报道,肝脏I / R损伤导致MIF的表达(46变弱,anti-MIF抗体在小鼠肝脏损伤endotoxin-induced致命的肝衰竭模型。在这项研究中,大量的MIF长期热/冷缺血后显著增加。肝脏non-parenchymal细胞,包括正弦枯氏细胞和内皮细胞,对缺血很敏感。MIF mRNA增加立即在肝脏冷缺血(数据不包括)。似乎可能MIF主要是积极从肝脏释放non-parenchymal细胞。

HMGB1发布后续机械创伤中描述的几个临床和实验论文。Peltz等人报道,等离子体HMGB1显著增加1小时内钝挫伤或穿透性损伤患者和严重程度得分大于或等于15。峰值发生损伤后从2到6小时(47]。使用一个实验模型中,利维等人发现HMGB1被升高血清1 h组成的外围损伤后小鼠骨折(48]。

MIF可能也由创伤造成的损害的重要细胞因子。Jeschke等人报道,MIF在血清的量明显增加大鼠热损伤模型(49]。MIF基因表达和蛋白质水平显著增加小鼠和犬急性肺损伤的模型。MIF的血清水平也显著升高患者脓毒症诱导急性肺损伤(50]。等离子体MIF在儿科患者显著增加手术对先天性心脏病(51]。我们发现额外的机械应力进一步加强他们的释放,在寒冷和温暖的缺血组。

HMGB1以及MIF在早些时候发布的时间点相比,肝移植后移植物缺血肝酶。在这个时间间隔内,AST和ALT显著增加并没有观察到。

5。结论

AST和ALT水平以及HMGB1 MIF的废水可以用来评估损害的程度的热缺血和冷缺血肝脏移植。值得注意的是,在早期的时间点,额外的机械应力导致HMGB1的更高版本和MIF但不是只比缺血肝酶的废水。在这种情况下,一个显著增加核胞质易位HMGB1可视化在肝细胞的免疫组织化学。我们的研究结果表明,HMGB1的确定和MIF反映缺血性损伤的程度。额外的机械损伤,造成器官手术操作期间,额外的危险信号的决心似乎优于肝酶测定,损害早些时候表示。

确认

这项研究支持部分由格兰特”Klinische Forschergruppe 117 - Optimierung der Leberlebendspende”(批准号KFO117 Da251/5-3和5 - 3)。作者要感谢女士Karin Jandt语言修订。