文摘

Cardioplegic-induced H / R损伤导致cardiomyocytic细胞凋亡。AMPK已被证明能减少ER的压力和展开的蛋白质反应(UPR)。AMPK活化能否减弱cardiomyocytic cardioplegia-induced H / R损伤后细胞凋亡是未知的。心肌细胞暴露在模拟缺血的孵化与间歇性低氧室冷心麻痹溶液注入每隔20分钟,随后reoxygenated在常氧环境中。不同剂量的AMPK激活物(爱卡或二甲双胍)有2天前H / R损伤。心肌细胞是收获后再氧化为后续检查。与AMPK活化剂,ER应激的凋亡基因和UPR proapoptotic蛋白质的后续生产减毒,凋亡蛋白升高。凋亡效应器ER应激的活动也减少了AMPK活化。此外,TUNEL染色显示,AMPK活化显著降低的百分比cardioplegia-induced H / R损伤后心肌细胞凋亡。我们的研究结果显示,AMPK活化在减弱cardiomyocytic cardioplegia-induced H / R损伤细胞凋亡,通过增强抗凋亡和减少proapoptotic反应,造成减少压力和UPR ER。 AMPK activation may serve as a future pharmacological target to reduce H/R injury in the clinical setting.

1。介绍

AMPK是一种酶,这种酶被激活细胞能量耗尽时(1,2]。AMPK活化增加骨骼肌细胞葡萄糖摄取和脂肪酸氧化增加ATP产量(3- - - - - -6]。AMPK级联来突出的传感器在真核生物(代谢压力似乎无处不在7,8]。激活AMPK在许多不同的代谢压力,包括热休克和代谢毒物在肝细胞(9),在骨骼肌运动10),和心脏缺血和缺氧11]。我们以前提出的激活mitochondria-mediated凋亡途径有重要作用在cardiomyocytic损伤和心肌功能障碍的发展cardioplegia-induced心脏骤停心肺旁路(下12- - - - - -14]。的发病机制之间的关系cardioplegia-induced缺氧/复氧(H / R)损伤及其并发症和内质网(ER)压力尚未完全阐明。AMPK活化已被证明能减少ER的压力和展开的蛋白质反应(UPR)。因为5-aminoimidazole-4-carboxamide核糖核苷(爱卡)据报道,施加一个可能的额外的好处在预防ER应激和UPR [15),我们调查的影响,爱卡ER应激和UPR在培养HL-1心肌细胞。

使用培养的心肌细胞的研究有助于阐明机制参与反应的H / R损伤引起的心麻痹,导致cardiomyocytic损伤通过多种机制,包括cardiomyocytic凋亡[12]。我们先前的研究显示,cardioplegia-induced H / R损伤可能导致cardiomyocytic损伤、细胞凋亡的特征标记,包括细胞色素 释放、激活半胱天冬酶和DNA碎片。尽管相对较少的研究集中在心肌细胞H / R-induced细胞死亡机制,使用培养的心肌细胞获得最近的证据表明,cardioplegia-induced H / R损伤导致cardiomyocytic细胞凋亡可能是通过几种机制启动,包括签名线粒体膜磷脂的合成减少,心磷脂(16和增加活性氧的代17,18]。然而,细胞凋亡的诱导氧化应激需要的钙离子通量的ER线粒体和消耗这些钙商店可以损害正常的蛋白质折叠功能,导致ER应激(17,18]。符合这个概念,我们目前的研究是设计用于显示心麻痹引起的H / R侮辱能否诱导心肌细胞ER应激。此外,我们的研究将阐明如果ER应激cardioplegia-induced H / R损伤后可以减毒,在某种程度上,通过激活AMPK途径爱卡或二甲双胍。

2。材料和方法

HL-1细胞系(19),获得Claycomb实验室(路易斯安那州立大学医学中心,没有),被用来作为实验模型。HL-1是一个不朽的细胞系,类似于成人心肌细胞的表型。HL-1细胞的特征包括以下:(a)一个超微结构类似于成人心房心肌细胞的主要文化;(b)细胞质改组和myofibrillogenesis;(c)的高度有序的肌原纤维和心脏连接;(d)的能力进行自发收缩;(e)几个压敏电阻器心脏电流的存在。这些属性使HL-1细胞特别有吸引力的研究需要adult-specific基因的表达和对心肌细胞功能的研究19]。

3所示。灌注系统

灌注系统被设置为Vanden隐谷等人先前描述(20.]。简而言之,盖玻片与同步收缩细胞被放置在一个Sykes-Moore室(1.2毫升;Bellco玻璃Inc .的宅邸,新泽西,美国)。室和油管流入水夹套,和氧气泄漏被最小化。温度、流量、pH值和阿宝2室里不断监测和保持不变。缺氧与腔内灌注系统验证了zinc-free氯化亚甲蓝,明显改变的碧蓝色PO2> 1.5托。标准的灌注介质由Claycomb介质。

4所示。组

组1:HL-1心肌细胞灌注了温暖的含氧培养基(37°C)。与缺氧组2 h: HL-1灌注心肌细胞是低温(4°C)心麻痹每20分钟120分钟。与缺氧组2 r: HL-1灌注心肌细胞是低温(4°C)心麻痹每20分钟120分钟然后reperfused温暖(37°C)含氧培养基为16小时。组3 - 6:0.01,0.1,0.5,2更易与L二甲双胍,分别添加到培养基2天然后受到相同的协议组2 r。组7 - 10:0.01,0.1,0.5,2更易与L爱卡,分别添加到培养基2天然后受到相同的协议组2 r。

5。免疫印迹分析

免疫印迹分析进行HL-1心肌细胞从不同的群体,如前所述[14]。细胞细胞溶解,离心,然后浮层被用作样品蛋白质。样本变性,然后通过SDS-polyacrylamide凝胶分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜清洗,然后阻塞1 h,孵化anti-AMPK一夜之间在4°Cα1抗体,anti-AMPKα2抗体(纽约北部,普莱西德湖),或anti-AMPK phosphothreonine 172 -特定的抗体(细胞信号技术,贝弗利,MA)。Immunodetection是通过孵化与山羊antirabbit膜免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)在TBS-Tween 1 h。可视化进行了BM化学发光印迹基质工具包(罗氏诊断,曼海姆,德国),根据制造商提供的说明。免疫反应性的乐队被量化的数字光密度成像(凝胶医生1000 gs - 700密度计和分子模型分析软件,BioRad)。细胞水平的磷酸化eIF-2α(细胞信号技术,贝弗利,MA)和GADD153(圣克鲁斯,CA), Grp78, bcl - 2、Bax比率,Caspase-3, -12年,裂解PARP (PharMingen,圣地亚哥,CA)蛋白质也由免疫印迹分析如上所述。信号强度的特定产品乐队免疫印迹是标准化的β肌动蛋白和微管蛋白为操纵和差异表达正确(褶皱)的蛋白表达增加与组1。

5.1。Caspase-3 AMPK活动

Caspase-3活动是由测量蛋白水解特定底物T的乳沟nT-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl香豆素(Ac-DEVD-AFC;Biomol,普利茅斯会议上,PA)在特定抑制剂的存在与否TnT-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Ac-DEVD-CHO;Biomol)如前所述14]。AMPK活性测定采用均质化HL-1心肌细胞按照生产的协议(CycLex有限公司、长野、日本)。短暂,cardiomyocytic溶解产物从不同的组添加预镀板与底物肽的小鼠胰岛素受体底物。的磷酸化胰岛素受体底物检测antimouse单克隆抗体和peroxidase-coupled antimouse免疫球蛋白抗体,可量化的吸光度测量。每个小组的活动表示为(褶皱)的活动而增加的组1。

6。ATF 6日定量实时PCR和分析VEGF, Grp78和拼接XBP-1

定量实时PCR反应进行的罗氏LightCycler工具2.0 LightCycler TaqMan大师(罗氏应用科学,印第安纳波利斯)。短暂,20毫升的反应的解决方案包含5毫升cDNA模板,生成4毫升大师混合,0.2毫升10毫米探针,正向引物0.4毫升10毫米,0.4毫升10毫米反向引物,和10毫升水。q-RT PCR程序在95°C进行了10分钟,45 95°C的周期10 s, 72°C 1 s, 30年代和40°C。的最后程序,融化曲线进行了分析。每个q-RT-PCR运行结束时,对数据进行自动分析,和一个放大图生成每个cDNA样本。从每一个情节,LightCycler4数据分析软件自动计算出交点(CP)的价值,这表明指数放大的开始。mRNA水平正常化,参照的看家基因转录(glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) mRNA)。反转录PCR进行如前所报道(12- - - - - -14引物。的引物序列拼接XBP-1, 229 -英国石油产品,如下:正向引物5′-GGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAG-3′和反向引物5′-GAATGCCCAAAAGGATATCAGACTC-3′。特定PCR产品乐队的信号强度归一化与GAPDH乐队为操纵和差异表达正确的增加(褶皱)的mRNA表达而在组1。

7所示。检测心肌细胞凋亡

总之,细胞被固定的幻灯片和冲洗末端转移酶(TdT)缓冲区。然后用TdT(2.5幻灯片被孵化μbiotin-dUTP (2.5 L)μL)和负缓冲区(45μL)在一个潮湿的室在37°C为60分钟。反应被终止传输缓冲区的幻灯片包含300更易与L / L氯化钠和30更易与柠檬酸钠在室温下15分钟。心肌细胞是沾末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂和anti-Myc抗体antimouse罗丹明免疫球蛋白紧随其后。盖玻片后安装90%甘油和10%磷酸盐,幻灯片被fluoromicroscopy检查。包含带切口的凋亡细胞核DNA染色绿色和在场所有的组。

8。数据分析

统计比较组间的差异是由正态分布数据的方差分析或由克鲁斯卡尔-沃利斯检验数据不服从正态分布。当方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯测试表明,一个重要的差异是存在的,一个学生的t分别使用以及或Mann-Whitney测试,比较不同组的。统计学意义是假定当 值 。

9。结果

9.1。效果的AMPK激活AMPK生产期间Cardioplegia-Induced H / R损伤

心肌细胞的蛋白质免疫印迹分析证实了存在和微分表达式AMPK的各种组织(图1)。改善任何混杂对蛋白表达的影响,我们归一化的表达AMPK在每组微管蛋白,分别。AMPK的显著增加α1表达与观察组1在所有组除了hypoxia-only组(2 h组)显示表达明显降低。AMPK的表达α2在所有组相似组1的表达水平。然而,海拔磷酸化AMPK在所有组明显不同,在组1。这些结果表明,缺氧,H / R, AMPK活化与二甲双胍或爱卡增加AMPK磷酸化,可用于估计的激酶活性α2ampk和α1AMPK基于AMPK刺172年磷酸化。的AMPK活动组3 - 6与第1组相比明显升高。AMPK活动提升更多的二甲双胍浓度较高的管理。类似的效果可以看到在爱卡管理组。


图1
免疫印迹分析,AMPK的结果α2,AMPKα2,p-AMPKαAMPK活动显示在不同的组。微管蛋白作为内部控制。(至少3的结果代表单独的实验。* < 。 0 5 相比之下,组1;H:缺氧;R:再氧化;遇见:二甲双胍)
9.2。效果的AMPK激活EIF-2的表情α磷酸化和下游蛋白质HL-1心肌细胞

真核翻译起始因子2 (eIF-2α)激酶磷酸化的蛋白质之一的最初反应细胞ER应激,这激活减弱翻译起始和蛋白质合成减少ER应激和随后的upr [21]。经过2小时的缺氧,eIF-2α磷酸化显著升高,如图2。然而,磷酸化eIF-2的高程α减少组织缺氧时紧随其后16小时的再氧化,除了组与二甲双胍的浓度更高,爱卡。磷酸化eIF-2的表达α一组5、6、9和10个显著高于组1和2 r。表达式的UPR诱发78 kda glucose-regulated蛋白质(Grp78),一个ER-resident分子伴侣蛋白,阻止展开或错误折叠蛋白质的聚合,这样他们可以适当的复合22]。Grp78的表达可以诱导UPR的三个分支包括eIF-2α磷酸化分支。Grp78可能形成一个复杂与caspase-7和-12 ER表面,防止他们的激活和释放。如图2,随后的蛋白质含量eIF-2α磷酸化,比如Grp78, GADD153 caspase-12 (ER应激的下游执行人)和免疫印迹分析进行评估。凋亡Grp78蛋白的水平明显升高组的价格相比3 - 10组1(图2),表示与二甲双胍或爱卡的AMPK激活。相比之下,GADD153 proapoptotic蛋白质的表达,再氧化后显著升高(组2 r和组1, ),显著降低了AMPK活化。随后激活caspase-12, Grp78和GADD153之间的平衡控制的表达式,H / R损伤后升高。然而,海拔下降了两AMPK活化剂,我们测试了。


图2
免疫印迹分析磷酸化eIF-2的结果α、GADD153 Grp78, caspase-12 (B)在不同的组织所示。β肌动蛋白是作为内部控制。(至少3的结果代表单独的实验。* < 。 0 5 相比之下,组1;H:缺氧;R:再氧化;遇见:二甲双胍)
9.3。AMPK活化对UPR目标基因表达的影响在Cardioplegia-Induced HL-1心肌细胞H / R

图3显示这些记录使用的表达式定量实时PCR和逆转录PCR。微密度分析表明,ATF6表达低于2 h组,在组1 ( ),而ATF6 2 r水平组,5、6组明显高于1。然而,ATF6 upregulation模式均与爱卡H / R损伤前补充。ER应激的下游基因,如VEGF与ATF6呈正相关,表达式(图3)。XBP-1表达的模式是类似于ATF6表达式。ATF6和XBP-1表达的不同模式之间的二甲双胍和爱卡的补充建议,他们可能在不同的AMPK激活途径。尽管ATF6受Grp78, ATF6也可以发起Grp78基因转录的激活(23]。如图3Grp78的表达模式,成绩单是ATF6相似。


图3
逆转录PCR分析表明ATF6老年病,VEGF, Grp78,拼接XBP-1 mrna HL-1心肌细胞的不同群体。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)担任加载控制。GAPDH的PCR产物,ATF6、VEGF、Grp78,拼接XBP-1被设计成200个基点左右。定量实时PCR显示比例升高的mrna在不同组。(至少3的结果代表单独的实验。* < 。 0 5 相比之下,组1;H:缺氧;R:再氧化;遇见:二甲双胍)
9.4。AMPK活化对bcl - 2、Bax的影响比,Caspase-3, PARP裂解,和细胞凋亡在心肌细胞HL-1通过免疫印迹分析和TUNEL染色

Cardiomyocytic核与带切口的DNA存在于所有组织(图4)。凋亡细胞计数被表示为一个百分比的cardiomyocytic核数的总数。cardiomyocytic细胞凋亡的程度(百分比凋亡细胞核)组2 h, 2 r组显著高于1 ( ;图4)。这个水平显著降低与AMPK活化剂量依赖性的方式(组3 - 10与组1)。


图4
效果的AMPK激活cardiomyocytic cardioplegia-induced H / R损伤后细胞凋亡。凋亡细胞核的百分比在不同群体是由与终端原位染色dUTP-biotin尼克结束标记(TUNEL)。蛋白质水平的bcl - 2、Bax比率,激活caspase-3和裂解聚(ADP-ribose)聚合酶测定在不同群体免疫印迹分析。Caspase-3活动也被评估。(至少3的结果代表单独的实验。* < 。 0 5 相比之下,组1;H:缺氧;R:再氧化;遇见:二甲双胍)

除了GADD153, bcl - 2家族成员也有一个重要的角色在调制的ER应激细胞死亡(21),这可能是通过ER和线粒体途径凋亡之间的串扰。图4表明bcl - 2 /伯灵顿的比率显著降低相比,组2 r和2 h,在组1 ( )。此外,与恢复要么AMPK活性降低的比例。的表达激活caspase-3、caspase-3活动和裂解PARP (caspase-3的产物)显示一个类似的模式的bcl - 2、Bax比率。

10。讨论

二甲双胍是一种广泛使用的抗糖尿病药。英国前瞻性糖尿病研究34显示,糖尿病引起的风险相关死亡和心肌梗死的发生率与二甲双胍可以降低糖尿病治疗(24]。佐佐木等。25)也表明,二甲双胍的长期政府直接保护作用抑制心脏重构和预防心力衰竭犬模型的进展。我们的研究结果表明,二甲双胍本身影响凋亡减少HL-1心肌细胞的内质网应激在cardioplegia-induced H / R侮辱通过激活腺苷酸激酶途径。

心肌,ER参与维护细胞钙稳态和合成的蛋白质(15]。ER是高度敏感的变化和扰动的环境;氧化应激、错误折叠蛋白质的积累和化学毒素都能破坏ER函数导致ER应激。为了生存压力,特定信号通路被激活在ER包括UPR ER超负荷响应,ER-associated退化(26]。因此,ER功能障碍可能导致H / R损伤的发病机制。

AMPK调节细胞新陈代谢以及应对各种各样的信号不能直接与新陈代谢有关,如缺血、缺氧、氧化应激(27]。AMPK也提供了心脏保护肿瘤坏死factor-alpha-triggered心肌细胞凋亡在bcl - 2相关死亡发起人同族体蛋白和炎症(28]。有两个已知α亚基AMPK的亚型;的α1同种型似乎表达了在所有的组织,而α2同种型主要表现在骨骼和心肌26]。的α2包含AMPK复合物是主要的贡献者AMPK活性,以应对各种类型的AMPK刺激器(29日]。然而,AMPK的增加蛋白质含量不与AMPK活性的增加,因为增加的蛋白质位于亚细胞车厢所无法激活AMPK激酶在刺激(29日]。针对H / R压力,ER应激诱导AMPK活化调节各种各样的蛋白质表达的调制各种真核起始因素(型)30.]。

最初的UPR的特点是多个蛋白质的协调激活抑制蛋白质合成,这将减少客户蛋白质ER必须处理的负荷。真核翻译eIF-2α激酶的蛋白质,被激活的起始步骤,通常被称为控制点的蛋白质合成(31日]。当eIF-2α磷酸化蛋白质合成受到抑制。eIF-2α磷酸化发生缺血期间,细胞凋亡,病毒感染,在Ca2 +涌入(31日]。因此,eIF2α磷酸化的过程中起着重要作用的细胞死亡后氧化应激。

另一种调节UPR和ER的压力是控制UPR-responsive基因的转录。ATF6 XBP-1可以绑定到UPR-responsive基因的启动子在ER应激(32]。UPR-responsive基因的转录是ATF6诱导裂解时的形式激活XBP-1启动子与货物一个内含子。拼接XBP-1然后把进入细胞核,结合其在监管目标序列的伴侣基因诱导转录区域。因此,信号通过ATF6合并诱导XBP1转录和信使rna剪接32]。

在相应的条件下,Grp78函数作为一个主调节器的UPR通过绑定和防止近端压力传感器的激活。错误折叠蛋白在细胞内积累时,绑定到Grp78,破坏其与压力传感器,如ATF6,导致他们的激活21]。两个传感器系统控制的UPR IRE1 / XBP-1和ATF6通路。XBP-1通路需要高效的蛋白质折叠,成熟,和退化的ER和暗示的子集UPR目标基因的存在所定义的依赖XBP-1 [33]。在2小时内缺氧的治疗在目前的研究中,有一个初始的内生ATF6蛋白质水平,与蛋白水解乳沟协议,先前报道(23]。16个小时的复氧缺氧应激后,和一个额外的faster-migrating形式被发现。与长期治疗ATF6的总量也增加。李等人建议faster-migrating ATF6形式可能产生预制ATF6通过可变剪接,因为拼接的短跨膜域ATF6可以把它从一个主要膜相关表格可溶形式(23]。

新合成肽的UPR确保有效易位在ER膜及其随后的折叠,成熟,和运输通过激活伴侣蛋白基因的表达(32]。第二步的UPR是增加易位和错误折叠蛋白质的降解通过触发ER伴护蛋白质的合成,如Grp78,救援的细胞(34]。ER应激期间,有保护intra-ER分子伴侣蛋白的表达增加,Grp78,旨在弥补损害(35]。否则,细胞凋亡的细胞死亡。

呃是一个存储库支持和凋亡分子。已知proapoptotic分子包括caspase-12和GADD153 [21迄今为止),而凋亡分子识别包括ER伴护蛋白Grp78和calreticulin [34]。ER应激诱发GADD153的表达,转录因子参与ER-mediated凋亡[21),促进细胞ER应激死亡的表达下调bcl - 2表达(36]。

此外,内生bcl - 2家族成员的一个重要部分包括bcl - 2, Bcl-xL,和伯灵顿已被证明是相关的,表明bcl - 2家族蛋白在ER调节钙稳态和凋亡细胞死亡(37]。bcl - 2家族蛋白质功能的维护2 +体内平衡和调节之间的串扰ER和线粒体。这些不同的bcl - 2家族成员之间的平衡作为“凋亡变阻器”,调节细胞的过渡从生存到死亡(21]。我们研究的局限性是寻找可能的凋亡途径和治疗期间cardioplegia-induced cardiomyocytic H / R的侮辱。然而我们的结果显示,AMPK活化与二甲双胍和爱卡可以减少cardiomyocytic细胞凋亡在cardioplegia-induced H / R的侮辱。然而,macroautophagy也可以与这些凋亡刺激疗法(38),在心肌有益和有害的作用。复杂的细胞凋亡和自噬(之间的串扰39超出了我们目前的研究范围,这提示进一步研究阐明“生存”的凋亡,受益的AMPK激活cardioplegia-induced心肌细胞H / R的侮辱。

11。结论

尽管限制使用HL-1心肌细胞的主要模型心肌细胞在这项研究中,这个研究的结果表明,二甲双胍,爱卡降低ER应激通过AMPK和增加凋亡蛋白和基因表达。此外,二甲双胍和爱卡防止caspase-12和3激活和发生cardiomyocytic cardioplegia-induced H / R损伤后细胞凋亡。我们的研究表明,阻止ER应激和UPR激活AMPK可能是有用的在设计新的药理方法防止cardiomyocytic损害后cardioplegia-induced H / R的侮辱。

承认

本文是250151年由格兰特CMRPG从长庚医院,台湾。