文摘

炎症损伤起着重要的作用在脑缺血发病机理和治疗可能代表一个目标。toll样receptor-4 (TLR4), toll样受体2 (TLR2),骨髓分化因子88 (MyD88)和核因子kappa-B (NF - B)与炎症反应。我们先前的研究已经证明,氧化苦参碱(OMT)保护缺血性脑损伤,这种作用可能是通过降低NF - B的表达。然而,鲜为人知的机制OMT缺血性中风急性期的。因此,我们调查了OMT的潜在的神经保护作用和潜在机制。男,Sprague-Dawley老鼠被随机分为骗局,生理盐水和OMT治疗组。我们使用大脑中动脉阻塞(MCAO)模型和管理OMT脑缺血后立刻腹腔内,每天一次第二天。在MCAO后时间点,脑含水量和梗塞尺寸测量。免疫组织化学和rt - pcr分析TLR4的表达,TLR2 MyD88, NF - B在缺血性脑组织基因和蛋白质水平。结果表明,OMT MCAO保护大脑免受损害;TLR4的差别这一效应可能是通过对这些TLR2 MyD88, NF - B。

1。介绍

过度坏死和炎症免疫反应通常驻留在地区缺血性脑梗死后组织,导致炎症损伤。toll样receptor-4之间的关系(TLR4), toll样受体2 (TLR2)和非生物炎性损伤证明(1- - - - - -3]。相信受伤组织和坏死细胞释放内源性活化剂(佐剂)。这些催化剂可以结合TLR4在细胞膜。的协助下群differentiation-14 (CD14)和骨髓差异蛋白2 (MD2),他们激活核转录因子kappa-B (NF -κB)和发布的一系列细胞因子来对抗炎症。潜在的配体也激活TLR2。他们还可以诱导特异性免疫增强有机体的自我保护能力。过度炎症反应也可以破坏靶细胞和组织(4,5]。减少炎症损伤因此被认为是治疗急性脑梗死的主要方法之一。

通路由TLR4包括髓样分化蛋白- 88 (MyD88)依赖和MyD88-independent通路(6]。通过TLR4内在活化剂,前者可以在细胞表面结合CD14和锚定。通过MD2的影响,固有的组合活化剂和TLR4可能引起一系列的细胞内信号转导。NF -κB是激活导致炎性因子的释放。MyD88-independent途径属于TLR4-TRIF (TIR-domain-containing适配器蛋白质诱导干扰素 )途径7,8与TLR4)也有密切的关系。路径诱导的TLR2仅限于MyD88-dependent通路。

氧化苦参碱(OMT)有一个四环的quinolizine结构。它的分子式是 o . OMT的结构如图1。它是一个生物碱提取摘要近年来(中国传统医学(中医)属于脉冲家族)。抗炎、抗氧化和防病毒OMT的影响,以及它在免疫调节中的作用,已报告(9,10]。近年来,OMT的研究主要集中在其对肝炎和某些类型的肿瘤治疗效果。很少有报道OMT对脑血管疾病的影响。


图1
OMT的化学结构。

2。材料和方法

OMT购买从山西慧科植物开发有限公司(山西、中国)。它的纯度为98%。OMT的细粉制备的悬架(40毫克/毫升)蒸馏水和存储 C。

动物资源和模型建立。男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(240 - 260 g)提供的实验动物中心,河北医科大学临床医学院(河北,中国)。他们住在多层层流架。他们可以自由移动,并有了一个标准的饮食和纯净水。房间温度维持在20-2 c .据报道的方法隆(11)和莱恩et al。12),一个动物的大脑中动脉阻塞(MCAO)模型建立了缝合插子的方法。

2.1。实验设计

观察OMT对梗死的影响大小、含水量、和浸润的炎症细胞基因表达和蛋白质的TLR4的表达,TLR2 MyD88, NF -κB在缺血性脑组织,老鼠被分为三组,即OMT治疗组(120毫克/公斤),生理盐水组和虚假的操作组。每组分为三个子组在不同时间点(6小时、24小时和48小时后操作)。OMT悬挂(40毫克/毫升)是OMT治疗组通过给大鼠腹腔内注射MCAO后(120毫克/公斤),然后一天一次。生理盐水组大鼠MCAO后收到1毫升的盐水取代OMT使用相同的方法。

2.2。检测脑组织的含水量

脑组织的含水量检测使用干湿重技术。每组五个老鼠被杀,脑组织收获迅速,额极(厚度、4毫米)移除。背后的脑组织额极(厚度2毫米)被选为水分含量的检测。在确定湿重(WW)电子天平,脑组织被放入烤箱在恒定温度下(100±5°C)为24小时。干重(DW)获得。水分含量是根据公式计算:(WW−DW) / WW×100%。

2.3。测定梗死大小

2、3、去除污渍(TTC)使用了大脑组织。每组的三只老鼠被杀,脑组织收获迅速,额极和小脑移除。冠状切片厚度2毫米的准备。脑组织被划分为五部分,沉浸在2% TTC膦缓冲区,和孵化 C 30分钟。可行的脑组织被TTC染色红,而坏死脑组织是苍白的。片被保存在10%的甲醛。每一片的顶端是成像。每个片两侧梗塞的面积是由一个图像分析仪。

2.4。检测TLR4的表达,TLR2 MyD88, NF -κ通过免疫组织化学方法B在脑组织

部分是由一个标准deparaffinized方法。然后他们被孵化的3% /甲醇消除内源性过氧化物酶活性。冲洗后磷酸盐(PBS;0.01米,pH值7.4)为抗原检索,部分被放置在柠檬酸缓冲(0.01 mol / L, pH值6.0)30分钟。部分是在室温下冷却和孵化与正常山羊血清。部分是孵化先后主要抗体(TLR4和NF -κB, 1: 400年,圣克鲁斯生物技术;TLR2, 1: 400年,寿命生物科学;MyD88 1:10 0,圣克鲁斯生物技术)在一夜之间 c .他们冲洗PBS和孵化与生物素酰化二级抗体流体 C 45分钟。他们再次冲洗PBS和孵化与辣根peroxidase-labeled streptoavidin c片与diaminobenzidene发达(DAB)与苏木精复染色。他们是脱水和安装。TLR4的表达,TLR2、MyD88和NF -κB在脑组织进行了计算。三个部分的大脑选择每100 米间隔。六个范围选择随机的梗塞的皮层和immunopositive细胞数。计算平均数和代表immunopositive细胞的老鼠,和三个老鼠在每组使用。

2.5。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

很快缺血性脑组织是收获。总RNA提取试剂盒(表达载体)和密度和纯度检测。RNA (2 g)每个样本用于合成cDNA通过反转录;1 L (cDNA是用来进行PCR扩增。引物由上海Sangon合成生物工程技术有限公司。基因顺序的正确性证明在基因库(表1)。PCR条件初始变性为2分钟 C, 35周期放大与变性 C 30秒,退火 C 30秒,和扩展 C为40秒。35个循环后,扩展 C 5分钟完成。rt - pcr产品(5 分析了L) 2%琼脂糖凝胶电泳。电泳带的灰度扫描了紫外分光光度法(UVP)凝胶成像系统。产品的相对表达TLR4 /表示 肌动蛋白、TLR2 / 肌动蛋白,MyD88 / 肌动蛋白和NF -κB / 肌动蛋白;数据与图像分析系统进行了分析。

表1
总结的rt - pcr引物序列。
2.6。数据分析

数据分析使用软件SAS 6.8。结果意味着±SD。使用单因素方差分析比较组之间的区别,以及问测试是用来比较两组之间的差异。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。OMT减少梗死缺血脑组织的大小

在缺血性脑组织梗死大小降低了32%的OMT治疗组与生理盐水组24小时后操作(数据2(一),2(b)2(c))。


图2
相对大脑梗死体积和含水量。(a)和(b) TTC染色:梗塞大小的比较生理盐水组和OMT治疗组之间的24小时。白色区域梗死和红色区域是正常脑组织。(c)相对梗塞体积,计算和比较脑组织梗死区域的比例占据整个地区一个部分显示下降了32%在OMT治疗组与生理盐水组相比在24小时。 与生理盐水组相比。(d)脑组织含水量:没有测试组在6小时的区别。它增加24小时盐水组和持续48小时盐水组在相同时间点。含水量在OMT治疗组降低手术后24小时和48小时的价格相比生理盐水组在同一时间点。每组的结果意味着±SD。 和 而虚假的。
3.2。OMT减少脑组织的含水量

对脑含水量,下面的结果。没有测试组在6小时的区别。没有改变被发现在所有时间点虚假的组。脑含水量增加在24小时盐水组和持续48小时盐水组。这是OMT治疗组明显降低,差异显著(图2(d))。

3.3。OMT TLR4的表达减少,TLR2 MyD88, NF -κB mRNA

TLR4的表达,TLR2、MyD88和NF -κB mRNA在每组的脑组织被rt - pcr检测手术后24小时。TLR4 mRNA表达水平更高的比虚假的操作组,生理盐水组和低OMT比生理盐水组治疗组。差异有统计学意义(图3(一个))。表达式的NF -κB mRNA手术后24小时盐水组高于OMT在虚假的小组,并降低治疗组比生理盐水组。差异有统计学意义(图3 (b))。结果表示为每组意味着±SD ( 和 而虚假的(数据3 (c)和3 (d)))。

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图3
TLR4和NF - rt - pcr的结果κb (a) rt - pcr的TLR4在手术后24小时内每组:TLR4 mRNA的表达明显高于生理盐水组与OMT治疗组相比,差异显著( )。(b)的NF - rt - pcrκB在每组手术后24小时:NF -的表情κB信使rna是TLR4 mRNA的相似。(c)在所有时间点检测TLR4的rt - pcr: TLR4 mRNA的表达显示所有测试组在6小时之间没有区别。这是明显高于生理盐水组12小时持续了48小时。与生理盐水组相比在相同的时间点,TLR4 mRNA的表达较低的OMT治疗组,差异显著 和 而虚假的。(d) rt - pcr的NF -κNF - B在所有时间点:表达式κB信使rna是TLR4 mRNA的相似 和 而虚假的。

TLR2信使rna表达水平高于生理盐水组比虚假的操作组和低OMT比生理盐水组治疗组。差异有统计学意义(图4(一))。MyD88 mRNA的表达48小时手术后生理盐水组高于OMT在虚假的小组,并降低治疗组比生理盐水组。差异有统计学意义(图4部分(b))。结果表示为每组意味着±SD ( 而虚假的, 与生理盐水组(数字4 (c)和4 (d)))。

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图4
rt - pcr结果TLR2和MyD88。(一)rt - pcr TLR2在手术后24小时内每组:TLR2 mRNA的表达明显高于生理盐水组与OMT的治疗组相比,差异显著( )。(b)的rt - pcr MyD88在手术后48小时内每组:MyD88 mRNA的表达是TLR2 mRNA的相似。(c)在所有时间点检测TLR2的rt - pcr: TLR2 mRNA的表达明显高于生理盐水组在6小时持续了48小时。没有区别生理盐水和OMT集团在6小时。与生理盐水组相比在24小时和48小时,TLR2 mRNA的表达OMT治疗组低,差异显著 而虚假的, 与生理盐水组相比。(d) rt - pcr MyD88的时间点:mRNA的表达是TLR2 mRNA的相似。 而虚假的, 与生理盐水组相比。
3.4。OMT TLR4的表达减少,TLR2 MyD88, NF -κB蛋白

TLR4的表达蛋白在大脑组织的免疫组织化学技术检测在每组手术后24小时。TLR4表达虚假的组如图5(一个)。高水平的TLR4表达生理盐水组(图5 (b))。TLR4表达较低的OMT比生理盐水组治疗组;有统计学意义的差异。阳性细胞被定义为有巴菲颗粒在细胞质中(图5 (c))。结果表示为每组意味着±SD ( 和 而虚假的(图5 (d)))。

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图5
TLR4表达通过免疫组织化学方法检测到。(一)TLR4表达虚假的组:TLR4表达无法观察到虚假的小组24小时。生理盐水组(b) TLR4表达:TLR4表达明显增加盐水组在24小时。阳性细胞被定义为有巴菲颗粒在细胞质中。(c) TLR4表达OMT治疗组:TLR4表达下降相对OMT治疗组在24小时。(d) TLR4表达每组各时间点:TLR4表达显示所有测试组在6小时之间没有区别。这是明显高于生理盐水组24小时持续了48小时。与生理盐水组相比在相同的时间点,TLR4表达OMT治疗组低,差异显著 和 而虚假的。

表达式的NF -κB蛋白手术后24小时内每组中指出使用免疫组织化学技术。NF -κB表达虚假的组如图6(一)。高水平的NF -κB表达观察生理盐水组(图6 (b))。NF -κB表达OMT组低于生理盐水组,差异有统计学意义。阳性细胞被定义为有巴菲谷物在细胞核和细胞质(图6 (c))。结果表示为每组意味着±SD ( 和 而虚假的(图6 (d)))。

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图6
NF -κB表达通过免疫组织化学方法检测到。(一)NF -κB表达虚假的组:NF -κB表达虚假的小组可以定期观察24小时。(b) NF -κ生理盐水组B表达:NF -κ在生理盐水组B表达明显增加24小时。阳性细胞被定义为汉巴菲颗粒细胞的细胞核和细胞质。(c) NF -κB表达OMT治疗组:NF -κB表达下降相对OMT治疗组在24小时。(d) NF -κB表达每组各时间点:在所有测试组没有区别在6小时。这是明显高于生理盐水组24小时持续了48小时。与生理盐水组相比在相同的时间点,NF -κB表达OMT治疗组低,差异显著 和 而虚假的。

TLR2的表达蛋白质在每组手术后24小时指出使用免疫组织化学技术。TLR2表达虚假的组如图7(一)。高水平的TLR2表达观察生理盐水组(图7 (b))。TLR2 OMT组的表达低于生理盐水组,差异有统计学意义。阳性细胞被定义为有巴菲颗粒在细胞质中(图7 (c))。结果表示为每组意味着±SD ( 而虚假的, 与生理盐水组(图7 (d)))。

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图7
通过免疫组织化学方法检测TLR2表达式。(a) TLR2表达虚假的组:TLR2表达式可以观测到周期性的虚假的小组24小时。生理盐水组(b) TLR2表达式:TLR2在生理盐水组表达明显增加了24小时。阳性细胞被定义为呈现淡黄色的颗粒在细胞质中。(c) TLR2表达式OMT治疗组:TLR2表达下降相对OMT治疗组在24小时。在每组(d) TLR2表达时间点:TLR2蛋白质的表达明显高于生理盐水组在6小时持续了48小时。没有区别生理盐水和OMT集团在6小时。与生理盐水组相比在24小时和48小时,TLR2的表达蛋白质OMT治疗组低,差异显著 而虚假的, 与生理盐水组相比。

MyD88蛋白的表达在每组手术后24小时指出使用免疫组织化学技术。MyD88表达虚假的组如图8(一个)。高水平的MyD88表达观察生理盐水组(图8 (b))。MyD88 OMT组的表达低于生理盐水组,差异有统计学意义。阳性细胞被定义为有巴菲颗粒在细胞质中(图8 (c))。结果表示为每组意味着±SD ( 而虚假的, 与生理盐水组(图8 (d)))。

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图8
通过免疫组织化学方法检测MyD88表达式。(a) MyD88表达虚假的组:MyD88表达式可以观测到周期性的虚假的小组24小时。生理盐水组(b) MyD88表达式:MyD88表达明显增加盐水组24小时。阳性细胞被定义为呈现淡黄色的颗粒在细胞质中。(c) MyD88表达式OMT治疗组:MyD88表达下降相对OMT治疗组在24小时。在每组(d) MyD88表达时间点:MyD88蛋白的表达明显高于生理盐水组在6小时持续了48小时。没有区别生理盐水和OMT集团在6小时。与生理盐水组相比在24小时和48小时内,表达OMT MyD88蛋白较低的治疗组,差异显著 而虚假的, 与生理盐水组相比。

4所示。讨论

OMT的抗炎症和抗氧化效果(以及其在免疫调节作用)已引起关注,在过去的几年里(13,14]。已经证实,OMT可以作用于非特异性炎症反应(15]。OMT发挥其抗炎效果不依赖的垂体一肾上腺系统:它直接作用于炎症细胞(15]。OMT双向immunoregulant。也就是说,它可以在低浓度刺激淋巴细胞的增殖,抑制这在高浓度扩散。

可以观察到脑梗死在多种病理过程(16),可以受到多种因素的影响。一般来说,相信脑梗死是一个典型的noninfective病变,和它的病理生理机制包括氧自由基的产生和释放炎症介质。通常被认为在非生物炎性病变有重要影响(1,17]。

通常是i型跨膜受体。他们的细胞外的领域是其分子模式(PAMP时)。他们的细胞内是一个结构域命名人数/ IL-1R(行动),可进行刺激信号。至少11通常(TLR1-TLR11)已确定。TLR4和TLR2已经确认参与炎症反应,并促进免疫细胞的成熟和分化。各种通常表达在人类和小鼠的大脑18,19]。TLR4是广泛表达在室周的神经丛,小胶质细胞和星形胶质细胞。TLR4信使rna也观察颅内血管平滑肌细胞和上皮细胞。TLR2被描述在星形胶质细胞表达,小胶质细胞、内皮细胞、室管膜细胞、神经元。许多pamp可以激活TLR4,包括肽聚糖(PGN) Lipoteichoic酸(LTA)、脂蛋白和氧化应激(即。氧自由基)。潜在的TLR2配体激活一些内生“危险分子”像高机动组盒蛋白1 (Hmgb1)或热休克蛋白70 (HSP70) [20.,21]。激活TLR4 NF -然后TLR2传输信号κB通过MyD88-dependent和独立通路,诱导激活促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF - )和白细胞介素(ILs)。TLR家族成员认识到不仅外源微生物还内生有害物质(22]。例如,他们参与反应的坏死细胞,热休克蛋白,细胞外基质的降解产物。最近表明TLR4和TLR2有至关重要的作用在中枢神经系统损伤(23- - - - - -25),小胶质细胞的主要中介这样的伤害。作为炎症跨膜受体,通常的作用已成为一个有争议的问题领域的感染性疾病。有许多研究TLR4在非生物的影响炎症损伤(如缺血的心肌、肝脏、大脑),但很少有报道在缺血性非生物感染性损伤。脑梗死后,它被证实感染的受伤在缺血性组织成为脑水肿的直接原因(1]但感染性损伤治疗脑梗塞后TLR4和TLR2水平相关联?

我们计算了脑组织的含水量和梗塞大小(如由TTC染色)评估OMT对TLR4的表达,TLR2 MyD88和NF -κB在焦脑梗死大鼠。TLR4的表达,TLR2、MyD88和NF -κB信使rna和蛋白质在测试组通过rt - pcr和免疫组织化学检测,分别。OMT可以降低含水量,减少缺血性脑组织梗死面积。它也可能削弱TLR4的表达,TLR2 MyD88, NF -κ信使rna和蛋白质。我们假设内生活化剂被确定后TLR4或TLR2,信号转导通路是开启的。这导致招聘MyD88,激活NF -κB和随后的促炎细胞因子的释放,从而导致组织损伤。通过减少TLR2和TLR4的表达基因和蛋白质,OMT可以减少MyD88和NF -的表达κB基因和蛋白质。这可以抑制炎性损伤,削弱脑水肿,并提供神经保护与后续的脑缺血性损伤。TLR4、TLR2和一个串行的炎症因素(如MyD88和NF -κB)调节免疫系统需要进一步的研究。我们的研究表明,政府的120毫克/公斤OMT足以提供重要的神经保护对MCAO导致的神经损伤。我们支持这一发现组织学和神经系统数据:减少脑梗塞体积。这些结果表明,OMT对缺血有有益的影响。然而,潜在的神经保护机制OMT尚未清楚。我们的研究表明,OMT可能通过减少TLR4的表达,改善炎症TLR2 MyD88, NF -κB。

总之,我们的研究证实,OMT MCAO保护大脑免受损害;这种效应可能是通过下调TLR4的表达,TLR2 MyD88, NF -κb . TLR4的表达升高,TLR2 MyD88, NF -κB被认为是符合缺血诱发神经元损伤和死亡通过炎症机制。TLR4、TLR2、MyD88和NF -κB通路可能是脑缺血治疗的战略目标之一,OMT也许一部小说,有效治疗药物治疗缺血性脑损伤。

承认

红光风扇和李Litao co-first作者。