文摘

慢性心力衰竭(CHF)与肿瘤坏死因子(TNF)含量升高 和cardiotrophin-1 (CT-1)和外周血单核细胞(PBMC)功能改变。因此,我们测试了是否CT-1诱发肿瘤坏死因子 在健康志愿者的PBMC。CT-1诱导PBMC肿瘤坏死因子 蛋白质在上层清液和肿瘤坏死因子 信使rna浓度和时间的方式由ELISA和实时PCR,分别。最大的肿瘤坏死因子 蛋白质是通过100 ng / mL CT-1后3 - 6小时,最大TNF 信使rna诱导后1小时。ELISA数据被证实使用immunofluorescent流式细胞术。抑制剂放线菌素D和brefeldin研究表明,蛋白质合成和胞内运输对于CT-1诱导肿瘤坏死因子至关重要 表达式。CT-1引起剂量依赖核因子(NF) B易位。Parthenolide抑制NF两 B易位和肿瘤坏死因子 蛋白表达表明NF B似乎是必要的。我们发现一个新的血清肿瘤坏死因子升高的机制 浓度和PBMC PBMC激活的激活在瑞士法郎除了假说从肠道细菌易位。

1。介绍

瑞士法郎的失败不仅是心脏产生足够的心输出量,但是是一种多系统疾病免疫激活导致增加一些细胞因子的浓度(1]。

在瑞士法郎几项研究显示,肿瘤坏死因子等促炎细胞因子的浓度增加α白介素(IL) 1、IL - 6的地震,cardiotrophin-1 (CT-1) [2- - - - - -5]。最检查促炎的分子之一,瑞士法郎是TNFα。肿瘤坏死因子α是一个三聚物的17-kDa多肽主要由单核细胞和巨噬细胞。肿瘤坏死因子的影响α在心脏功能是浓度和时间。短期的肿瘤坏死因子α表达被认为是一种自适应机制;而长时间的表达导致左心室功能障碍和心肌病导致瑞士法郎传播。然而,肿瘤坏死因子α不仅影响心脏本身,而是导致内皮功能障碍和外围肌肉萎缩(6]。

Cardiotrophin-1 (CT-1)是一种细胞因子白介素家族的成员,由il - 6, IL-11,睫状神经营养因子(据),Cardiotrophin-1 (CT-1) cardiotrophin-like细胞因子(CLC)、白血病抑制因子(生活),neuropoietin (NPN)和制瘤素M (OSM)和最近补充的两个新特征的细胞因子:IL-27和IL-317]。所有这些细胞因子链绑定到一个特定的受体(IL-6R、IL-11R或LIFR CT-1,制药业,OSM)。后绑定细胞因子/细胞因子受体复杂associates糖蛋白130 (gp130)导致酪氨酸磷酸化gp130和信号转导通过Janus激酶(激酶)/信号传感器和激活转录3 (STAT3)途径8- - - - - -10]。CT-1时间的方式表达在胚胎发生的器官,心脏在生活中表达,引发心脏肌细胞肥大,通过有丝分裂原,能够防止肌细胞凋亡依赖激酶途径(8,11]。

增加CT-1浓度检测急性心肌梗塞患者和慢性心力衰竭(CHF)。此外,CT-1等离子体浓度与左心室功能障碍的严重程度(11- - - - - -14]。然而,CT-1不仅对细胞的影响,而且在脉管系统通过减少系统性血管阻力在动物模型15),急性期蛋白的诱导大鼠肝细胞(16),衰减的endotoxin-induced急性肺损伤(17]。

有几项研究表明,瑞士法郎PBMCs生产 (18,19]。但到目前为止,负责的机制 生产这些细胞在这种情况下并不确定。

在这项研究中,我们调查是否CT-1诱发 α人类健康志愿者的PBMC表达。此外,我们设计了底层通路抑制剂实验来描述。

2。材料和方法

2.1。试剂

重组人类CT-1购买从研发系统(德国威斯巴登)和溶解根据制造商的指示。放线菌素D, brefeldin, parthenolide从西格玛化学品购买(Deisenhofen,德国)。抑制性抗体对CT-1购买从研发系统(德国威斯巴登)。

2.2。细胞培养

人类外周血单核细胞被Ficoll-paque来自健康志愿者(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)离心。PBS的细胞被洗了三次,resuspended RPMI 1640年补充10%胎牛血清,1%青霉素,链霉素(所有从Biochrom AG),柏林,德国),和培养在塑料碗 在腐殖化的5%的股份有限公司2的气氛。细胞培养24小时的RPMI 1640补充10%胎牛血清,1%青霉素,链霉素。之后,细胞被subconfluent和介质取代新鲜的媒介。24小时后,超过90%的PBMC被台盼蓝排斥活着测试。刺激和药理研究。

主要文化从人体静脉内皮细胞从PromoCell购买(德国海德堡)。细胞培养是根据制造商的手册内皮生长中有2%胎牛血清(能量法,PromoCell,海德堡,德国)。细胞融合在胶原蛋白我涂层组织培养塑料(美国,正欲富兰克林湖)。细胞被用于第二至第五单元的段落。

所有兴奋剂、抑制剂和媒体没有显著的内毒素水平根据制造商的指示。

药理代理人,溶解在新鲜培养基,添加到定义的时间间隔和浓度的细胞。控制,新鲜培养基添加到细胞。

批准这项研究是由席勒耶拿大学的伦理委员会,和主题给了他们的书面知情同意根据大学的指导方针。

2.3。实时聚合酶链反应

培养的总RNA提取PBMC根据RNeasy协议(试剂盒、希尔登,德国)。一个 克总RNA是相对地转录成cDNA 20卷 l与禽骨髓瘤白血病病毒(lamv)逆转录酶和益生元dT引物(美国麦迪逊Promega)根据制造商的手册。

实时PCR测定肿瘤坏死因子α互补脱氧核糖核酸与光周期计仪器使用快速启动DNA主人SYBR绿色我工具包(罗氏诊断,曼海姆,德国)。验证正确的放大产品,PCR分析了产品2%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。特定的引物对人类 从研发系统购买。放大计划 由1周期 有4分钟的持有40周期的紧随其后 用45秒, 退火温度45秒,和 用45秒。特定的引物对GAPDH是:底漆 GGG亚美大陆煤层气有限公司GTG亚美大陆煤层气有限公司GTC GG ,反义底漆 TGG行动CCA CGA CGT CAG行动 。的放大GAPDH项目由1周期 用30秒举行30周期的紧随其后 与一个5秒钟, 退火温度与十秒,和 和一个20秒。每个反应(20 l)包含2 l cDNA、2.5毫米 ,每个引物1 pmol, 2 L的快速起动器(包含缓冲、核苷酸、Sybr绿色染料和聚合酶)。放大之后,融化曲线分析来验证扩增子的正确性。消极的控制没有cDNA运行每一个PCR的特异性反应。执行数据分析使用光周期计软件3.5版。PCR效率决定通过分析一系列稀释的cDNA(外部标准曲线)。PCR证实了产品的身份比较其熔化温度(Tm)和扩增子的Tm标准或积极的控制。GAPDH是平行PCR分析,结果GAPDH值被用作演示的标准 记录。

2.4。 αELISA

培养PBMCs治疗与不同浓度的CT-1各种时间周期。 α文化上层清液的浓度由ELISA (QuantiGlo、研发系统、威斯巴登、德国)根据制造商的指示。

2.5。EMSA

核提取物通过EpiQuik核萃取装备我(美国纽约Epigentek)根据制造商的手册。之后,蛋白质浓度的核提取物根据布拉德福德方法测定。测定 2 克核蛋白质被使用,并进一步分析了凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)根据供应商手册。EMSA工具包和探针从Panomics购买,红木市,美国。

2.6。Immunofluorescent流仪分析细胞因子的生产

为细胞内染色外周血lithium-heparin管收集。100年 l的血液被添加到rpmi - 1640中包括brefeldin(最终浓度:1 g / ml)(σ,Taufkirchen,德国)和孵化时间为6小时 c .接下来,红细胞溶解了 。洗后用PBS / 2% FCS细胞染色与表面抗原CD3单克隆抗体(Coulter-Immunotech、Krefeld、德国),CD4 (Caltag,汉堡,德国)CD8或CD14 (BD-Pharmingen、海德堡、德国)(15分钟,RT),随后,洗后一步,与100年固定 l 2%多聚甲醛在rt, 10分钟后洗细胞在100年被孵化 l permeabilisation解决方案(皂素和0 0,1%,1% 一起在PBS) 1 l直接共轭anti-TNFα抗体(BD-Pharmingen、海德堡、德国)15分钟在rt,后跟一个洗permeabilisation解决方案中的细胞resuspended PBS / 2% FCS,流式细胞术分析了荧光强度(FACSCalibur,正欲,海德堡,德国)。分析区域被定义为散射和散射以及 ——或者 淋巴细胞数量和 单核细胞数量。数据分析与CellQuest软件。

2.7。统计分析

因为产生的细胞因子的数量在每个实验中,不同的影响 如果细胞生产规范化,设置为1。数据被非参数分析方法,以避免假设测量变量的分布。对比组由Wilcoxon测试。所有值都报道手段 扫描电镜。统计学意义的价值被认为是表示 。

3所示。结果

3.1。CT-1诱发肿瘤坏死因子α蛋白质和PBMC的mRNA水平

在第一组实验我们分析CT-1是否能够诱发肿瘤坏死因子α在PBMC。如图1(一)CT-1浓度的方式诱导肿瘤坏死因子α在上层清液由商业可用的ELISA。最大 浓度3到6小时后被发现并拒绝之后24小时后达到近控制值,表明CT-1导致瞬态 在PBMC发布。在接下来的实验中我们决定细胞肿瘤坏死因子α蛋白质在单核细胞、CD4细胞+和CD8+淋巴细胞与不同浓度的刺激后CT-1 brefeldin的存在使用immunofluorescent流式细胞术。细胞内的 决心在CD4+和CD8+淋巴细胞没有显示的CT-1产生影响 表达式(数据未显示)。在单核细胞我们发现细胞内肿瘤坏死因子的浓度增加α后CT-1应用程序(图1(b))。这些结果表明,CT-1诱导肿瘤坏死因子αPBCM独立的文化条件和独立的确定方法。

(一)
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(b)
(b)
图1
(a)浓度和时间的表达 α蛋白质与CT-1孵化后上层清液。人类PBMCs孵化CT-1与不同浓度和不同的时期。在指定的时间 α蛋白质含量是由商业可用的ELISA。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。(b)分析细胞内 α生产使用immunofluorescent流式细胞术。人体血液与不同浓度的孵化CT-1 6小时之后在brefeldin a红细胞细胞溶解,细胞染色单克隆抗体攻击CD14 FITC-conjugated和 αPE-conjugated。单核细胞是封闭的和结果表达规范化unstimlulated单核细胞。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。

图2
浓度和时间有关的感应 α信使rna与CT-1孵化后。人类PBMCs孵化CT-1在不同浓度和不同时期。指定的时间后信使rna是由实时PCR。所有 GAPDH mRNA表达数据规范化。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。

在肿瘤坏死因子α1小时后我们发现最大的信使rna信使rna水平。后来肿瘤坏死因子α信使rna下降(图2)。阻塞CT-1抗体对CT-1抑制CT-1诱导肿瘤坏死因子α信使rna(数据未显示)表明TNFα感应是专门CT-1所致。

3.2。CT-1在肿瘤坏死因子的影响α在PBMC表达依赖于信使rna合成和细胞内蛋白质运输

下一个实验我们解决这个问题是否TNFα蛋白表达依赖于信使rna合成和细胞内蛋白质运输。在图3结果表明,抑制放线菌素D的信使rna合成和细胞内蛋白质brefeldin运输能够废除CT-1诱导肿瘤坏死因子α蛋白质在上层的感应。这些结果表明,CT-1负责新蛋白质的合成 蛋白质。此外肿瘤坏死因子α蛋白分泌到上层的积极。


图3
3小时后 蛋白质是由上层的ELISA。CT-1 0 ng / mL被设置为1。行动:放线菌素D (5 g / mL),抑制mRNA转录,信徒:brefeldin (10 g / ml),抑制细胞内蛋白质运输。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。
3.3。CT-1诱发肿瘤坏死因子α通过NFκB

如图4CT-1浓度NFκB易位原子核由EMSA与100 ng / ml CT-1达成最大易位。


图4
CT-1引起浓度依赖的增加 EMSA活动测量。乐队对应 活动被测密度术量化和表达任意单位和规范化如果PBMC。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。

在下一套我们使用EMSA实验来验证 激活负责CT-1诱导肿瘤坏死因子α在PBMC表达。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和肿瘤坏死因子刺激α被用作控制。如果没有显示显著的细胞 蛋白质在细胞核;而CT-1易位引起的 进入细胞核。Parthenolide的抑制剂 激活,抑制 易位核(图5)。


图5
检测 活动在人类PBMC。代表EMSA CT-1诱导 活动在PBMC,这可能被parthenolide抑制剂的抑制 激活。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)刺激 α被用作控制。

NFκB易位是必不可少的 表达式如图6(一)和6(b),因为parthenolide得以抑制 表达蛋白质和mRNA水平我们不仅得出CT-1 NF负责κB易位细胞核但这易位负责 表达式。使用流式细胞仪我们发现单核细胞增加细胞内 经过parthenolide CT-1应用程序,它可以抑制(图6(c))。Parthenolide本身并没有显示出显著的正面效应 如果细胞中表达。这些结果表明,CT-1诱导 PBCM独立的文化条件和测定方法和NF独立的κB似乎必不可少的CT-1的效果 诱导PBMC。

(一)
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(b)
(b)
(c)
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图6
parthenolide对CT-1诱导的影响 α表达式。(一)人类PBMCs孵化了CT-1 (50 ng / ml) 1小时在parthenolide面前。后来是细胞溶解和细胞 α信使rna表达由real-time-PCR决定。所有 αGAPDH mRNA表达数据规范化。 、数据表示为的意思 扫描电镜。 而如果细胞。(b)人类PBMCs孵化与CT-1 (50 ng / ml) 3小时parthenolide的存在。后来 α上层清液中蛋白质浓度由ELISA决定。 、数据表示为的意思 如果细胞扫描电镜和规范化。 而如果细胞。 如果细胞相比显著。(c)分析细胞内 生产使用immunofluorescent流式细胞术。人类血液和50 ng / ml CT-1孵化6小时brefeldin A和parthenolide的存在。后来红血球细胞溶解,细胞染色单克隆抗体攻击CD14 FITC-conjugated和 αPE-conjugated。单核细胞是封闭的和结果表达正常化unstimlulated单核细胞。n = 6,数据表达的意思 扫描电镜。 如果细胞相比, 相比与50 ng / ml CT-1细胞刺激。

4所示。讨论

我们的研究的第一个结果是CT-1能够诱导 信使rna和蛋白质在PBMC的健康志愿者。

增加患者的血清和瑞士法郎与心衰的严重程度,恶病质(20.),和临床结果21]。 可能参与发展的瑞士法郎,因为高水平的 会引起左心室功能障碍、心室重塑、心肌病、肺水肿(22,23]。

人类PBMC培养能合成和分泌 。在心力衰竭,心脏本身和激活单核细胞能够分泌 (18,24]。此外,瑞郎CHF患者PBMC分泌的能力 增加与控制。我们的数据是在良好的协议与这些前研究和相反Shimokawa et al。25)发现单核细胞的细胞因子减少发电量严重心力衰竭与脂多糖刺激后。

除了瑞士法郎的假设没有心脏本身的主要来源 它由其他小组推测,激活单核细胞负责肿瘤坏死因子增加α血清浓度。单核细胞可以激活从肠道有限合伙人,因为贲门的水肿的肠道屏障功能的干扰和细菌可以很容易地把血液从肠道流明(26]。

第三种可能我们的数据显示,至少在理论上一个新的机制 生产PBMC的心脏衰竭。CT-1失败产生的心室(27)能够诱导 在PBMC有限合伙人。这里提出的机制也可能解释为什么 甚至可能在瑞士法郎仍偏高与利尿剂和水肿是成功治疗后恢复肠道粘膜的完整性。此外,我们的研究数据支持Petretta et al。28)发现, 不是失败的心脏或肠道产生的轻微到严重心力衰竭患者。

第二个我们的研究结果是CT-1激活这一事实 系统在健康志愿者的PBMC浓度的方式。我们的体外数据符合研究发现一个激活的 系统在瑞士法郎在外周血细胞。Jankowska等人报道一个激活的 系统在瑞郎CHF患者外周血白细胞衡量immuncytochemistry [29日]。Siednienko等人发现一个增广的激活 激活血液中的单核细胞使用情况转变分析瑞郎CHF患者比健康对照组(30.]。负责准确的途径 激活在瑞士法郎仍未知,有待确定。

我们的研究也有一些局限性。我们只使用抑制剂实验描述通路负责。而且我们使用相对高parthenolide浓度。但在3小时内,没有细胞毒性效应如奥尼尔等人所示(31日]。我们也使用高CT-1浓度浓度相比瑞郎CHF患者报道了Ng et al。12]。另一方面在2008年发表的一篇论文(32报道在健康对照组血清CT-1浓度和代谢综合征患者约100 ng / ml。到目前为止CT-1在健康对照组的血清浓度和病人是一个讨论的问题。但是独立的报道CT-1血清浓度的浓度CT-1应该更高的心肌CT-1在瑞士法郎的来源33]。确切的心肌内的CT-1浓度不确定到目前为止,只有mRNA和免疫组织化学研究表明增加CT-1在瑞郎CHF患者的心34]。

在我们的实验 信使rna表达和 蛋白质的生产PBMC显示标准差异很大。第一个解释大型标准偏差可能是不同人的不同遗传易感性的PBMC刺激(35]。其次,我们使用了低基底信使rna浓度作为标准化的基础解释大标准的变化。第三,增加的事实 mRNA表达后CT-1应用远远高于上层清液中蛋白质的增加可能会有条不紊地解释道。

我们使用PBMC的健康志愿者检查CT-1在瑞士法郎的效果。因为在许多促炎细胞因子升高瑞士法郎和PBMC被激活,不容易研究单个细胞因子的影响在瑞郎CHF患者PBMC。因为这个原因我们使用PBMC在文化和健康的志愿者用重组CT-1刺激他们。

总之,我们的研究提供了一个新的机制,增加血清 浓度在心力衰竭。有趣的是,在我们的研究中有限合伙人不需要提升 在PBMC表达。升高 浓度可能是心力衰竭的重要病机及延续调制系统的新陈代谢,导致细胞凋亡和有负性肌力作用[36]。根据我们的研究结果调制CT-1可能是一个有趣的药理治疗CHF目标。

承认

作者要感谢annet施密特对她优秀的技术援助。