文摘

后沙门氏菌入侵,肠道上皮细胞释放一系列不同的促炎细胞因子。白介素6 (IL)由肠上皮细胞可能具有抗炎和对细胞健康有保护作用的影响,并可能抵消一些败血症和内毒素的有害影响。最近的研究在各种啮齿动物模型实验性结肠炎利用PJ-34,一个强有力的聚(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)抑制剂,支持这一概念,标志着有益的影响可以利用PJ-34治疗人类炎性疾病。本研究旨在探讨PJ-34的效果沙门氏菌全身的肠上皮细胞il - 6生产及其机制。我们发现PJ-34增强Salmonella-induced Caco-2 il - 6生产细胞,分泌蛋白质或mRNA的表达。PJ-34治疗增强NF -的活性 B在沙门氏菌Caco-2来华的细胞。此外,PJ-34参与调控的il - 6在美国生产typhimurium-infected Caco-2细胞也可能通过ERK但不是p38 MAPK物或PI3K / Akt通路,免疫印迹的磷酸化ERK的经验显示,p38、物和Akt蛋白。它表明PJ-34可能发挥其保护作用对入侵沙门氏菌感染肠道上皮细胞通过ERK和NF -调控的il - 6生产 B但不是P38 MAPK物或PI3K / Akt信号通路。

1。背景

上皮细胞被认为是发挥重要作用在粘膜免疫促炎细胞因子的表达,以应对微生物损伤(1]。在肠道粘膜细胞因子产生在脓毒症和内毒素,白介素6 (IL)尤为重要,因为它的多种重要的生物效应(2]。虽然一般认为是促炎细胞因子(3),也有证据表明,il - 6具有重要的抗炎特性和各组织(可能起到保护作用4- - - - - -6]。il - 6在肠道屏障中扮演着重要的角色l . monocytogenes来华的人类肠道上皮细胞(7,8]。由于il - 6的多个生物效应,更好的理解的分子调节肠上皮细胞il - 6生产和方法调节il - 6在肠道粘膜感染肠上皮细胞可能有重要的临床意义。

在过去的十年里,大量的研究已经证实PARP-1激活的角色在一个广泛的病理生理的条件,如关节炎、哮喘、炎症性肠病,肺部炎症,多器官功能衰竭,脓毒性休克(9]。PARP抑制剂的显著的有益效应在这些动物模型的各种疾病也表明,可以利用PARP抑制剂来治疗人类的炎性疾病。

最近的研究在各种啮齿动物模型实验性结肠炎支持PARP-1激活的作用在疾病的发病机理10- - - - - -14]。PJ-34,小说和高度有效的体外(IC50 10000倍低于典型的复合3-aminobenzamide) PARP-1抑制剂,适用于机械的监管角色调查PARP [15]。此外,PJ-34细菌性腹膜炎引起的脓毒性休克的治疗改善生存在猪16]。然而,PARP的角色在沙门氏菌肠炎的发病机制和PJ-34 PARP-1抑制剂的影响和遗传击倒的PARP-1 siRNA沙门氏菌感染的肠上皮细胞的炎症反应是不清楚,促使我们调查在Salmonella-induced PJ-34肠道炎症的作用及其机制。

2。目的

在这项研究中,我们旨在考察的影响PJ-34 Salmonella-induced il - 6生产Caco-2细胞体外和细胞内信号通路的调节效果。

3所示。材料和方法

3.1。试剂

从Inotek PJ-34购买公司(贝弗利,MA)和股票的解决方案在二甲亚砜(DMSO)。添加抑制剂是细胞在感染之前指定的浓度大约30 - 60分钟。标准实验室试剂是σ(圣路易斯,密苏里州)。

3.2。菌株

野生型鼠伤寒美国应变SL1344一直在前面描述的(17,18]。一夜之间,细菌被种植在静态文化与最小曝气Luria-Bertani(磅)中。细菌是通过离心收集14000 g 5分钟,用无菌磷酸盐(PBS)洗净,resuspended组织培养中没有抗生素的密度 /毫升。25 l整除悬挂(108细菌)被用来感染的细胞。

3.3。细胞培养和感染

位于马里兰州Rockville Caco-2细胞(写明ATCC),改变了人类结肠上皮细胞系,是生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充heat-inactivated 10%胎牛血清,青霉素100单位/毫升,100年 g / ml硫酸链霉素,20毫米玫瑰(σ)5%的股份2气氛在37°C。通过10 - 30是用于所有实验。对于一些感染实验,细胞被播种在12-well组织培养板(4厘米2/好;BD生物科学),在60% - -80%融合使用。

3.4。细胞分离

核,胞质膜提取物未感染,感染,或PJ-34-treated Caco-2细胞由王等的方法。19用细微的修改。细胞被洗两次与冰冷的磷酸盐、溶解在缓冲(10毫米Hepes-KOH, pH值7.8,10毫米氯化钾,MgCl 2毫米2EDTA, 0.1毫米,0.1毫米EGTA, 0.7%诺乃清洁剂p 40)蛋白酶和磷酸酶抑制剂30分钟在冰上,涡大力15年代,离心机,享年3000岁 在4°C g 10分钟(上层清液胞质分数)。颗粒状核和膜resuspended缓冲B(40毫米Hepes-KOH, pH值7.8,350毫米氯化钠,MgCl 2毫米2,EDTA 1毫米,0.2毫米EGTA、20%甘油、1%诺乃清洁剂p 40)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂对冰60分钟,混合大力10 s在15、30和45分钟,离心机,享年15000岁 在4°C g 30分钟。包含核蛋白质储存在上层清液 °C。颗粒状膜在裂解缓冲resuspended蛋白酶和磷酸酶抑制剂。蛋白质浓度在细胞分数测定使用Bio-Rad化验设备。

3.5。细胞因子测定

Caco-2层被感染(水、偏振膜的情况下)一式三份为1小时37°C。媒介是吸气的感染期,与无菌PBS细胞被洗两次,中含有庆大霉素在100 g / ml是补充道。孵化后5小时37°C,上层清液中收集和il - 6浓度测定酶联免疫吸附试验(ELISA)如下所述。这些细胞被洗PBS和细胞溶解Triton x - 100年0.2毫升的1%。一个整除的溶解产物用于确定蛋白质浓度的直流试验(Bio-Rad大力神,CA)按制造商提供的说明。il - 6的浓度是评估使用OptEIA人类白介素酶联免疫吸附试验(ELISA) (BD生物科学)所描述的制造商。允许对比多个实验,il - 6产生的数量是归一化的蛋白质含量细胞单层。由于基线il - 6的变化生产,结果表示为“成倍增加”,代表规范化感染产生的il - 6层除以规范化控制产生的il - 6,未受感染的单层膜。

3.6。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

从控制或感染细胞总RNA制备的试剂盒试剂(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA),制造商的方向。RNA与随机reversetranscribed五个一使用GeneAmp工具包(罗氏,新泽西州,新泽西)详细描述(早些时候17,18]。

3.7。实时逆转录聚合酶链反应

实时逆转录聚合酶链反应分析荧光温度周期计(LightCycler;罗氏诊断)如前所述20.]。这种技术不断监视逐周期荧光标记PCR产物的积累。短暂,cDNA对应于10 ng的RNA作为模板在10 包含4 mM MgCl l反应2,0.5 M的底漆,1 LightCycler-FastStart DNA主人SYBR绿色我混合(罗氏诊断)。样本加载到毛细管和孵化荧光thermocycler (Light-Cycler)首次在95°C变性10分钟紧随其后的是45个周期,每个周期组成的95°C 10年代,58 5 s°C,并为20年代72°C。每次运行结束时,熔化曲线资料是由冷却样品为15秒65°C,然后慢慢加热0.20°C / s到95°C的连续测量荧光证实放大特定的记录。使用LightCycler Cycle-to-cycle荧光发射数据监控和分析软件(罗氏诊断)。的特异性扩增产品进一步验证了对放大产品在2%琼脂糖凝胶电泳。碎片被溴化乙锭染色可视化,以及PCR的特异性产品被代表样本的测序验证。使用以下引物:il - 6, 太极拳ACA - ATG AAC太极拳TTC AGC GC - (正向引物)和 - g亚美大陆煤层气有限公司AGC有条件现金援助CAG GCT GGACTG - (反向引物,628个基点);glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶, -CCAGCCGAGCCACATCGCTC - (正向引物)和 -ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT - 。标准曲线得到每个引物组与连续稀释的互补。所有量化规范化的看家基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶。相对表达了作为一个比率目标基因表达和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶表达。

3.8。西方墨点法

等量的总蛋白,sds - page分离,转移到硝化纤维膜的半干的印迹(如前所述)(17,18]。屏蔽膜后5%脱脂奶粉,他们探索与磷酸化抗体一种蛋白激酶(细胞信号,贝弗利,MA)磷酸化κB(新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA), p65 NF -κB或磷酸化ERK(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),和磷酸化物或p38(新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)。膜是不断孵化与适当的二次抗体结合辣根过氧化物酶和发达西部ECL检测试剂(美国新泽西州Amersham-Pharmacia生物技术,皮斯卡塔韦)。适当的接触x射线胶片,然后过滤器剥夺和reprobed抗体总Akt(细胞信号,贝弗利,MA),总ERK, p38,我κB, 肌动蛋白、板/ C或钙粘蛋白(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。

3.9。统计分析

所有实验至少进行两次类似的结果。统计学意义是利用学生的决定t以及。

4所示。结果

4.1。PJ-34 PARP-1抑制剂,强化Salmonella-Induced il - 6生产

在图1,我们发现il - 6的增强,在蛋白质分泌或mRNA表达,增加更高浓度的PJ-34应用(20后具有统计学意义 米PJ-34)。然后,我们开始研究PJ-34对il - 6的影响的机制。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
PJ-34 (a)的影响沙门氏菌全身的il - 6蛋白的分泌。Caco-2细胞不及时治疗(控制),或处理5、10、20、40、80 M PJ-34 (5、10、20、40、80 pj),或DMSO溶液的体积(D)相当于PJ-34的最高浓度。然后他们被感染(仅控制和PJ)或感染了野生型年代。沙门氏菌感染菌株SL1344 1小时。分析了上层的ELISA对白介素6小时后。il - 6产生的数量显示为折叠比未感染的增加,控制细胞。结果是代表两个类似实验的结果。数据的含义 标准差三决定。* 。PJ-34 (b)的影响沙门氏菌全身的il - 6 mRNA。Caco-2细胞不及时治疗,或治疗5、10、20、40、80 M PJ-34。然后他们被感染或感染了野生型年代。沙门氏菌感染菌株SL1344 1小时。总RNA制备3小时后,分析了实时定量PCR估计数量的il - 6成绩单。il - 6 mRNA的数量生产,标准化GAPDH相应金额的记录,显示为折叠比未感染的增加,控制细胞。结果是代表两个类似实验的结果。数据的含义 标准差三决定。* 。
4.2。PJ-34增强,延长NF -的激活κ我通过增加κB - 退化和NF -核易位κB

进一步阐明机制PJ-34, PARP-1抑制剂,增加Salmonella-induced在肠道上皮细胞il - 6生产,我们检查的胞内信号通路与细胞因子的表达。il - 6基因的转录调控是复杂的,涉及到不同的转录因子21]。转录因子NF -κB是一个关键的转录因子在调节细胞因子和趋化因子,包括il - 6基因表达(22]。激活的NF -κB通路,以及增殖作用的蛋白激酶(MAPK);细胞外生长factor-regulated激酶(ERK)和p38,都被证明是参与沙门氏菌全身的细胞因子和趋化因子的生产(17,23,24]。确定这些信号参与PJ-34在受感染的肠道上皮细胞的影响,Caco-2细胞不及时治疗,或治疗40 M PJ-34,然后感染了野生型沙门氏菌应变SL1344。激活的NF -κB通路是通过检查评估核易位的NF -κ我和降解的蛋白质抑制剂κB - 。如图2(一个),沙门氏菌感染导致退化的我κB - 和NF -核易位κb . PJ-34增强,延长NF -的激活κ我通过增加κB - 退化和NF -核易位κB(图2 (b)),导致后续upregulation il - 6基因的转录。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
PJ-34 Salmonella-induced激活NF -的影响 B。NF - B是一个中央监管机构肠道上皮细胞的先天免疫反应引起的感染enteroinvasive细菌。西方的屁股说明(a)我的表达 - b 在胞质蛋白提取Caco-2细胞暴露于野生型年代。沙门氏菌感染菌株SL1344缺席或PJ-34的存在。肌动蛋白作为核蛋白质和正常化(b)的表达p65 NF-kB蛋白质核提取物Caco-2细胞暴露于野生型年代。沙门氏菌感染菌株SL1344缺席或PJ-34的存在。肌动蛋白和膜/ C作为一个标准化的胞质及核蛋白质,分别。结果显示代表3个独立的实验。
4.3。PJ-34增强ERK的磷酸化受感染的肠道上皮细胞,但没有改变物或p38-MAPK磷酸化

我们还研究了活化MAPKs (ERK、物和p38激酶)(图3),使用抗体特定磷酸化(激活)或总形式的这些蛋白质。而抑制PARP PJ-34没有影响沙门氏菌端依赖p38激酶的磷酸化和物,它有一个清晰的和可再生的ERK激酶激活的增强效果。这些发现表明,MAPK通路参与的监管效果PJ-34 Salmonella-induced il - 6生产在肠道上皮细胞。然而,他们不同调节细胞反应。


图3
PJ-34对Salmonella-activated胞内信号。Caco-2细胞不及时治疗,或治疗40 M PJ-34,然后感染野生型鼠伤寒美国应变SL1344时报表示。激活ERK的物,人们分析了完整的细胞免疫印迹蛋白质的磷酸化抗体(p)的兵,物,p38和总ERK和p38。ERK的活化增强PJ-34但不是物和p38。结果显示代表3个独立的实验。
4.4。PJ-34对膜没有影响招聘和AKT激活受感染Caco-2细胞

NF -κB是一个关键的转录因子调节促炎细胞因子和趋化因子。此外,NF -之间的亲密关系κB和PARP-1由多行显示的证据表明,合成的聚(ADP-ribose)促进NF -κB transactivation和抑制PARP-1可以激活和随后的细胞因子表达减弱。一些报道也表明,PARP抑制剂诱导的一种蛋白激酶磷酸化和激活lipopolysaccharide-treated小鼠或培养细胞在氧化应激,提高PARP抑制介导的保护作用通过PI3K-kinase / Akt通路。在先前的研究中,我们演示了NF -κB和PI3K / Akt通路沙门氏菌肠炎的发病机制中起着重要作用[17,18]。然而,我们发现抑制PARP-1 PJ-34没有影响沙门氏菌全身的一种蛋白激酶的磷酸化(图4)。


图4
PJ-34对Salmonella-activated胞内信号。Caco-2细胞不及时治疗,或治疗40 M PJ-34,然后感染野生型年代。沙门氏菌感染菌株SL1344时报表示。AKT通路的激活是分析细胞分数与磷酸化抗体(免疫印迹膜部分)(p)一种蛋白激酶和总一种蛋白激酶。钙粘蛋白是膜蛋白的正常化。结果显示代表3个独立的实验。一种蛋白激酶的激活和招聘PJ-34没有显著抑制。

5。讨论

我们的研究给了第一个洞察监管对炎症反应的影响的小说PARP-1抑制剂PJ-34受感染的肠道上皮Caco-2细胞。在这项研究中,我们发现野生型年代。沙门氏菌感染诱导il - 6生产Caco-2细胞,而PJ-34增强il - 6表达,分泌il - 6和il - 6信使rna。虽然一般认为是促炎细胞因子(3),也有证据表明,il - 6具有重要的抗炎特性和各组织(可能起到保护作用4- - - - - -6]。Hasselgren等人的研究表明,肠上皮细胞产生的il - 6可能是抗炎和对细胞健康有保护作用的效果,增加了肠道粘膜的il - 6水平可能会抵消一些败血症和内毒素的有害影响25,26]。强烈的炎症反应引起的沙门氏菌感染导致上皮细胞层的破坏可能导致的肠粘膜的细菌易位和木糖醇的吸收进入循环(27,28]。因此,木糖醇的细菌易位和吸收可能产生深远的系统性影响,并可能导致菌血症以及内毒素。然而,il - 6被描述成为一个中介的上皮屏障保护(29日)和内源性il - 6起着重要,nonredundant作用限制肠道损伤和细胞死亡30.]。益生菌菌l . paracasei可能通过增强il - 6生产起到一些有益的作用在肠上皮细胞受到炎症刺激31日]。

在我们的研究中,PJ-34调节沙门氏菌全身的il - 6生产。这也许解释的显著的有益效果PJ-34在啮齿动物的各种模型的局部炎症,il - 6的水平在不测量32]。PJ-34可以提供抗炎和保护对肠上皮细胞的影响,以抵消入侵和有害的影响沙门氏菌内毒素通过肠上皮细胞il - 6的upregulation生产。我们所知,到目前为止,还没有报告表明PJ-34调节Salmonella-induced il - 6表达在肠道上皮细胞。

之前报道,基因缺陷或药物抑制PARP-1带来有益的影响在实验结肠炎模型(10- - - - - -14,32,33]。封锁PARP抑制细胞间粘附分子1 (ICAM-1)或cyclooxygenase-2表达式[13,33),中性粒细胞招募(13,14,33)、氧化剂的一代和粘膜损伤小鼠结肠炎。然而,一个(罕见)报告表明PJ-34对il - 6的影响生产(34]。分析当地的il - 6表达骨骼肌缺血和再灌注显示48 h后明显高于水平PJ-34治疗组与生理盐水相比。作者表明,并不是所有的细胞因子在再灌注是有害的活动。它可能提供保护或抗炎效果。

il - 6基因的转录调控是复杂的,涉及到不同的转录因子21]。转录因子NF -κB是一个中央监管机构的il - 6基因表达(22]。激活的NF -κB通路,以及增殖蛋白激酶(MAPKs):细胞外生长factor-regulated激酶(ERK)和p38,已被证明是参与沙门氏菌全身的细胞因子和趋化因子的生产(17,22,23]。此外,信号通路参与的多样性PARP抑制剂的防护效果取决于所使用的实验模型和抑制剂。大多数研究[10- - - - - -14]显示激活的转录因子NF -减少κB和AP-1,而很少有研究表明增加MAPK的磷酸化和PI3K / Akt途径除了物。小说PARP抑制剂l - 2286,促进Akt的ischemia-reperfusion-induced激活ERK和p38-MAPK孤立的心和体内心脏损伤(35]。

进一步阐明PJ-34的机制调节生产il - 6,我们检查了各种信号通路,涉及细胞因子的表达。而抑制PARP-1 PJ-34没有影响沙门氏菌全身p38激酶的磷酸化,物,或一种蛋白激酶,它有一个明确的和可再生的增强效应激活ERK激酶和核易位的NF -κb .这些发现与先前的报道相比A549肺上皮细胞(36)或wrl - 68人类肝细胞(37]。他们发现PJ-34抑制NF -κB激活但不是AP-1 cytokine-stimulated A549细胞并没有影响大多数趋化因子的表达(36]。他们还表明,对磷酸化的MAPKs PJ-34没有影响。在wrl - 68细胞转染和小干扰rna或药物抑制PARP PJ-34,一种蛋白激酶的磷酸化(Ser473年在氧化应激与野生型相比)增加。然而,根据我们的研究结果,Kameoka et al。38]证明了PARP和NF -之间的负相关κB的活动。他们表明cl - 3527细胞最低的PARP内容表达35-fold NF -更大的活动κ比野生型B L1210细胞。然而,差异似乎存在cl - 3527和PARP-1-gene破坏细胞(39,40)显示,明显抑制NF -κB-dependent信号。这些作者解释说,这种差异可能是由于不同残余聚在这些突变体(ADP-ribosylating)活动。它表明,转录因子和信号通路之间的各种不同的细胞类型和相同的细胞内也可能有所不同取决于刺激(41]。

我们的研究结果表明,旁边还可以调节不同的信号级联基因表达。据我们所知,这是第一个体外报告,哪些属性NF -一个关键的角色κB和ERK在Salmonella-induced upregulation Caco-2细胞il - 6,由PARP-1抑制剂PJ-34授予。

6。结论

总之,目前的研究提供了第一个证据表明PJ-34可能增强肠上皮细胞il - 6生产受到沙门氏菌感染PJ-34的影响,至少在某种程度上,通过NF -κB和ERK信号通路。因为其他研究已经表明,il - 6有抗炎和肠黏膜保护作用,目前的结果提供了一个新颖的机制PJ-34可能起到一些有益的作用,但需要额外的体内实验来定义中il - 6的作用对细胞健康有保护作用的影响由PJ-34提供治疗。

确认

作者希望感谢鲍比Cherayil众多的富有成效的讨论。这项工作的部分支持由国家科学社区批准号NSC - 95 - 2314 - b - 182 - 197。