文摘

尽管防治(NAC)已被证明是对创伤性脑损伤(TBI)神经保护,有益作用的机制仍知之甚少。大脑炎症中扮演一个重要的角色在创伤性脑损伤后继发性脑损伤的发病机制。然而,它还没有被调查是否南汽调节TBI-induced大脑炎症反应。在这项工作中,我们调查了南京政府对皮质核转录因子的表达的影响(NF -κB B)和炎症蛋白质如interleukin-1 (il - 1 )、肿瘤坏死因子- (肿瘤坏死因子- )、白细胞介素- 6 (il - 6)和细胞间粘附molecule-1创伤性脑损伤后(ICAM-1)。因此,我们发现NF - B、促炎细胞因子和ICAM-1增加在所有受伤的动物。在动物NAC post-TBI, NF - B, il - 1 肿瘤坏死因子- 相比,ICAM-1减少vehicle-treated动物。措施的il - 6显示NAC治疗后没有变化。南京政府减少脑水肿、BBB通透性和凋亡指数在大脑受伤。结果表明post-TBI南京政府可能减弱受伤的老鼠大脑的炎症反应,这可能是一个机制NAC,改善了创伤性脑损伤后继发性脑损伤。

1。介绍

尽管创伤性脑损伤(TBI)代表了世界上一个重要的公共卫生问题,目前没有治疗,改善临床结果的措施(1,2]。最近,几个来自实验研究已经证明,防治作用的报道(NAC)在创伤性脑损伤的神经保护作用包括恢复TBI-induced线粒体功能障碍,增加抗氧化酶,减少和保护神经元(3- - - - - -5]。大多数以前的研究集中在调制的南汽在创伤性脑损伤后大脑氧化应激,但忽略了NAC对大脑的影响炎症,也起着至关重要的作用,在创伤性脑损伤后继发性脑损伤的机制6]。此外,没有研究在文献调查发现了南京政府在脑水肿的影响,血脑屏障(BBB)通透性和创伤性脑损伤后皮质细胞凋亡。

几个临床和实验研究已经证明,二次脑损伤免疫介质可以放大了许多,频繁调节应对创伤性脑损伤(7- - - - - -9]。水平的提高这些分子在受伤的大脑,包括interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),被认为有助于大脑损伤,细胞死亡,BBB功能障碍(10]。一个关键球员的规定这些分子是核因素(NF -κBκB)家族(cRel RelA / p65 RelB, p50和p52)转录因子(11,12]。在先前的研究中,我们已经表明,大脑皮层挫伤创伤很可能诱发的相伴和持久upregulation NF -κB,肿瘤坏死因子-α、il - 6和ICAM-1受伤的老鼠的大脑,这可能发挥核心作用在大脑的创伤性炎症反应(13,14]。

南京是一个复合,增加谷胱甘肽的池。后者是一种重要的细胞抗氧化剂。这是一个活性氧(ROS)清道夫,可以恢复减少细胞谷胱甘肽(15]。这也是cytoprotective因为它抑制NF -的激活κB和肿瘤坏死因子-α生产由脂多糖(16,17]。熊等等。报道,NAC可以大大恢复大脑谷胱甘肽水平和创伤性脑损伤后线粒体谷胱甘肽水平(3]。实验中风,同时,在鼠模型管理NAC缺血发作后保护大脑免受自由基损伤、细胞凋亡和炎症,宽治疗窗口(18]。不过,直到现在它仍然是未知的NAC能否影响生产的创伤性脑损伤后炎性因子在大脑。

当前研究的目的是确定是否NAC可以减弱TBI-induced大脑炎症pericontusional地区。我们假设NAC对调节的影响大脑炎症反应可能是一种机制,通过这种机制NAC减少脑水肿,保护BBB,压抑的创伤性脑损伤后皮质细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性Wistar鼠(250 - 300克)是购买从中国科学院动物中心,上海,中国。老鼠们被安置在温度和湿度控制动物季度12小时光/暗周期。机构批准的所有程序都是动物保护委员会的指导方针,按照美国国立卫生研究院的动物保健和使用。

2.2。试验协议

后大鼠皮层挫伤模型创伤:IP与氨基甲酸乙酯麻醉(1000毫克/公斤),动物头部固定于立体框架。右顶叶颅骨切开术(直径5毫米)钻在无菌条件下1毫米后,2毫米前囱侧。我们使用一个修改的捐助的重锤模型freefalling重量到暴露完整颅硬脑膜生产标准化顶叶挫伤,让钢杆重40 g的平端直径4毫米下降到活塞放在硬脑膜从25厘米的高度19]。活塞被允许压缩组织最多5毫米。操作规程后,老鼠然后回到笼子里,室温保持在23±1°c .心率、动脉血压和直肠温度监控,和直肠温度保持在37±0.5°C,通过使用物理降温(冰袋)在需要时,整个实验。Sham-operated老鼠麻醉和安装在立体定向仪,光靠右顶叶开颅手术准备,没有脑损伤。

我们建立了3个实验小组以随机的方式:(a)虚假的操作组(虚假的;n= 15),(b)创伤性脑损伤组(创伤性脑损伤;n= 18),和(c) NAC治疗组(TBI-NAC;n= 18)。老鼠TBI-NAC组注射150毫克/公斤NAC IP在15分钟和1,2,3天后手术。老鼠的骗局和创伤性脑损伤组收到相同体积的0.9%生理盐水。剂量是根据Hicdonmez等等。因为他们的有益作用防止伤害脑组织氧化损伤后创伤性脑损伤的治疗后与南汽使用相同的协议(4]。动物被斩首3天后损伤组织化验。受伤的脑组织周围皮层(见图1)是解剖冰如我们之前所述研究[14),其中一些被投入10%的缓冲福尔马林,其他人则储存在液氮立即之前使用。


图1
的示意图表示weight-dropping创伤引起的大脑皮层挫伤区和研究地区周围受伤的大脑。
2.3。核内蛋白提取和电泳迁移率改变分析(EMSA)

核内蛋白提取和量化描述14,20.]。EMSA执行使用商业套装(凝胶转变分析系统;美国威斯康星州麦迪逊Promega)方法后在我们的实验室。NF -κB寡核苷酸探针( -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC - )是end-labeled与(γ- - - - - -32P] ATP(免费的生物技术,北京)。EMSA执行根据我们之前的研究14,20.]。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)

炎症介质水平的量化使用特定ELISA试剂盒对老鼠根据制造商的指示(TNF -α法国贝桑松Diaclone研究,;il - 1β欧洲,il - 6 Biosource SA、显示、比利时)和我们先前的研究14,20.]。值表示为ng / g蛋白。

2.5。免疫组化染色

进行了免疫组织化学研究formalin-fixed,石蜡包埋。ICAM-1 rabbit-antirat单克隆抗体(稀释1:100年,圣克鲁斯生物技术,加州,美国)使用。根据我们之前的研究[执行免疫组织化学分析14]。阳性细胞的识别、计算和分析了在光学显微镜下的调查员盲分组。在每个部分阳性微血管数的数量在10(在微观领域 100倍的放大)和平均每视野积极应用容器的数量。

2.6。脑水含量

脑水肿是决定使用干/湿方法如前所述,大脑水的比例=((湿重−干重)/湿重) 100% (21]。短暂,大脑迅速从头骨和两国的大脑被分离。分别被放置到preweighed和标记的玻璃小瓶和体重。瓶被放置在一个烤箱72小时100°C然后reweighed获得干重内容。实验用动物的数量在每组脑水肿研究如下:虚假的(n= 5),创伤性脑损伤(nTBI-NAC = 6), (n= 6)。

2.7。血脑屏障通透性

血脑屏障(BBB)通透性是由伊文思蓝(EB)溢出在创伤性脑损伤后3天。简单地说,第四2%伊文思蓝注射的剂量2毫升/公斤。动物被reanesthetized 1小时后灌注聚氨酯(1000毫克/公斤),使用生理盐水去除血管内EB染色。动物被斩首;大脑被移除,在磷酸缓冲盐均质。三氯乙酸被添加到沉淀蛋白质,和样本冷却和离心机。得到的上层清液的吸光度测量使用分光光度计EB在610海里。实验用动物的数量在每组BBB通透性研究如下:虚假的(n= 5),创伤性脑损伤(nTBI-NAC = 6), (n= 6)。

2.8。TUNEL染色,凋亡细胞的定量

formalin-fixed组织嵌入在石蜡和分段4 米厚的切片机。的部分是由终端检测到凋亡细胞原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)法。TUNEL:原位细胞死亡检测设备吊舱(ISCDD,勃林格曼海姆,德国)使用。程序是根据设备的协议和我们之前的研究14]。阳性细胞的识别、计算和分析了在光学显微镜下的调查员盲分组。脑损伤的程度是评价凋亡指数TUNEL-positive细胞的平均数量在每个部分计入10(在微观领域 200倍的放大)。

2.9。统计分析

所有数据被当作平均数±标准差。使用SPSS 12.0统计分析的数据。所有的数据都受到单向方差分析。实验组之间的差异决定了费雪的LSD期末测验。推断统计学意义P< . 05。

3所示。结果

3.1。EMSA NF -κB

EMSA放射自显影法的NF -κB DNA结合活性受伤的大脑样本如图2。低NF -κB绑定活动(弱EMSA放射自显影法)被发现虚假的组。与虚假的集团相比,NF -κB绑定受伤的大脑活动显著增加(P创伤性脑损伤组< . 01)。在NF - TBI-NAC集团κB绑定活动显著下调(P< . 01)在创伤性脑损伤后大脑损伤部位周围。


图2
NF -κB损伤周围的大脑区域的活动网站虚假的集团(n= 5),创伤性脑损伤组(n= 6),TBI-NAC集团(n= 6)。(上)EMSA放射自显影法的NF -κB DNA结合活性。(底部)的NF -水平κ由计算机辅助光密度扫描和B DNA结合活性量化表示为任意密度测量单位(adu)。作为与虚假的群体,NF -κB绑定活动衡量EMSA在创伤性脑损伤组显著增加。创伤性脑损伤组相比,NAC显著抑制NF -κB TBI-NAC组激活。 与虚假的集团, 对创伤性脑损伤组。
3.2。il - 1的浓度β肿瘤坏死因子-α,il - 6在受伤的大脑

il - 1的浓度β肿瘤坏死因子-α低,il - 6的老鼠的大脑中虚假的集团( , , ng / g蛋白质、职责)(见图3)。与虚假的集团相比,皮质水平的三个极大的创伤性脑损伤后诱导炎性细胞因子(P< . 01)。如图3创伤性脑损伤后,南京政府可能导致明显降低il - 1β和肿瘤坏死因子-α的浓度,但对il - 6的浓度没有显著的影响(P> . 05)在老鼠大脑组织。


图3
受伤的大脑炎症介质的变化由ELISA在虚假的集团(n= 5),创伤性脑损伤组(n= 6),TBI-NAC集团(n= 6)。创伤性脑损伤能诱导il - 1的含量显著增加β肿瘤坏死因子-α,il - 6在老鼠大脑损伤周围的站点。TBI-NAC组、皮质il - 1的含量β和肿瘤坏死因子-α但不是il - 6与创伤性脑损伤组相比明显下调。 与虚假的集团; 和 对创伤性脑损伤组。
3.3。在大脑的血管受伤ICAM-1表达式

如图4(一),很少有ICAM-1-immunostained脑微血管观察假组大鼠大脑。在创伤性脑损伤组,ICAM-1-positive船只的数量显著增加,而在虚假的集团(P< . 01)(见图4 (b)和4 (d))。TBI-NAC组,当与创伤性脑损伤组相比,ICAM-1-positive船只的数量明显减少(P< . 05)(见图4 (c)和4 (d))。结果表明,系统性的NAC可以显著下调ICAM-1注射免疫反应性的血管受伤的大脑(见图4 (d))。

(一)
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图4
受伤的皮层假组ICAM-1免疫组织化学(n= 5),创伤性脑损伤组(n= 6),TBI-NAC集团(n= 6)。(a)虚假的老鼠显示几个ICAM-1积极的船只。(b)创伤性脑损伤大鼠显示ICAM-1积极强劲血管染色棕色。(c) TBI-NAC老鼠ICAM-1积极血管显示低于创伤性脑损伤的老鼠(疤痕酒吧,50 米)。(d)管理NAC显著抑制TBI-induced upregulation脑血管endothelia ICAM-1表达式。 与虚假的集团; 对创伤性脑损伤组。
3.4。脑水含量

显著增加(P< . 01)在含水量检测大脑受伤的样本在创伤性脑损伤后3天相比,sham-operated老鼠(见图5)。脑水含量的平均值在受伤方面减少了NAC管理局(P< . 01)与创伤性脑损伤组。受伤的一面,脑水含量的平均值之间没有显著差异骗局,创伤性脑损伤,TBI-NAC组。结果表明,post-TBI NAC治疗可以减弱这个大鼠创伤性脑损伤的脑水肿模型。


图5
改变脑含水量虚假的集团( ),创伤性脑损伤组(n= 6),TBI-NAC集团(n= 6)。受伤的大脑含水量显著增加在创伤性脑损伤后3天。NAC治疗显著降低脑含水量。没有区别的脑含水量检测三组中未受伤害的一方。 与虚假的集团; 对创伤性脑损伤组。
3.5。血脑屏障通透性

伊文思蓝的模式外渗后创伤性脑损伤图所示6。大鼠创伤性脑损伤组表现出显著增加(P<。01)在伊文思蓝BBB通透性相对于虚假的组的老鼠。南汽管理显著抑制伊文思蓝外渗(P< . 05),表明减少BBB开放NAC治疗的反应。


图6
改变在虚假的集团(伊文思蓝外渗n= 5),创伤性脑损伤组(n= 6),TBI-NAC集团(n= 6)。创伤性脑损伤可能引起显著增加老鼠大脑的BBB外渗而虚假的集团。南京政府后,伊文思蓝外渗和创伤性脑损伤组相比显著降低。 与虚假的集团, 对创伤性脑损伤组。
3.6。细胞凋亡在受伤的皮层

几个TUNEL-positive凋亡细胞被发现虚假的组大鼠大脑(见图7(一))。在创伤性脑损伤组,凋亡指数在周围的皮质网站被发现受伤的价格相比显著增加虚假的动物( )(见图7 (b)和7 (d))。TBI-NAC组相比,在创伤性脑损伤组,研究皮层的凋亡指数显著下降(P< . 01)(见图7 (c)和7 (d))。结果表明,南京政府在创伤性脑损伤可能导致更少的细胞死亡在周围的大脑皮层挫伤,并可能改善创伤性脑损伤后继发性脑损伤。

(一)
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图7
虚假的组TUNEL受伤皮质的免疫组织化学染色(n= 5),创伤性脑损伤组( ),TBI-NAC集团( )。(一)虚假的组大鼠显示几个TUNEL细胞凋亡。(b)创伤性脑损伤组大鼠表现出更多的TUNEL凋亡细胞染色棕色。(c) TBI-NAC组TUNEL细胞凋亡老鼠显示低于创伤性脑损伤组(疤痕酒吧,50 米)。(d)管理NAC显著减少凋亡指数在大鼠创伤性脑损伤后大脑受伤。 与虚假的集团; 对创伤性脑损伤组。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,(1)常见的炎症相关的创伤性脑损伤的因素,NF -κB、促炎细胞因子和ICAM-1时调节创伤性脑损伤后,可以抑制接受南汽和(2)南京政府后,脑水肿,BBB通透性,改善凋亡细胞死亡。这些首次发现,南汽巴TBI-induced大脑炎症反应,减轻继发性脑损伤后初级创伤大鼠创伤性脑损伤模型。

有几项研究关注南汽在创伤性脑损伤的神经保护作用。如前所述,埃利斯等等。在他们的文学,NAC可以直接清除自由基和刺激谷胱甘肽过氧化物酶活动在一只猫创伤性脑损伤模型(22]。他们的研究结果表明,NAC治疗可能有用的氧radical-mediated脑损伤。另一个研究表明,南汽管理postinjury在早期能有效地恢复TBI-induced线粒体功能障碍和南汽的保护作用可能与大脑中谷胱甘肽水平的恢复(3]。最近的数据显示,Hicdonmez等等。是,NAC治疗创伤后有效的脂质过氧化作用,抗氧化酶活性和神经保护在脑损伤后封闭的头部创伤(4]。在当前的研究中,我们发现,南京政府创伤性脑损伤后可以减少脑水肿,BBB通透性,凋亡细胞死亡,扮演了重要的角色,主要参与了创伤性脑损伤后继发性脑损伤。然而,尽管南汽的展示机制在神经保护,没有以前的研究集中在大脑炎症反应可能促进初级创伤后继发性脑损伤的发展。

脑部炎症代表只有一个创伤性脑损伤后的众多过程激活;由于复杂,尚未完全阐明的大量分子形成一个复杂的电路。这个级联的主要效应物释放的促炎细胞因子,通常几分钟后的挑战,因为他们存储细胞前体蛋白质最终修改成积极分子。创伤性脑损伤破坏血脑屏障,那么血液细胞,如中性粒细胞和巨噬细胞在大脑中积累,进一步维持大脑炎症级联(23]。许多免疫介质如il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6在几分钟内释放的主要损伤可以启动炎性细胞的浸润到大脑通过激活ICAM-1和其他粘附分子14]。NF -功能的重要性κB在急性炎症是基于它能调节多种基因的启动子的产品,如il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6、ICAM-1和急性期蛋白,是炎症过程的关键(11]。NF -κB提高了促炎细胞因子的转录激活,反过来激活已知细胞因子NF -κB (24]。积极的反馈是用来放大炎症信号。在我们之前的研究中,人们已经发现,有早期的相伴和持久upregulation NF -κB绑定活动,TNF -α、il - 6和ICAM-1表达受伤的大脑皮层挫伤后创伤(13,14]。

大量的研究已经证明,NAC可以调节炎症因子NF -等生产κB、促炎细胞因子和ICAM-1 [25]。卡罗尔等等。检查了NAC对大脑的影响NF -κB活动大脑中动脉闭塞后临时和NF -表明激活κB是显著增加15分钟后再灌注在受影响的半球和可以废除NAC治疗(25]。李等等。NAC对NF -的影响调查κB激活和促炎细胞因子的生产蛋白质营养不良使用动物感染性休克模型,结果表明,补充NAC可以正常化lipopolysaccharide-induced NF -κB激活和促炎细胞因子的生产在早期康复的蛋白质营养不良的老鼠(26]。我们的研究表明,大脑皮层的NF -水平κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 6和ICAM-1明显引起的创伤性脑损伤在创伤后3天。Post-TBI南京政府可以抑制这些陪同创伤性脑损伤的炎症因子的表达。虽然我们的数据已经证明NAC可以下调脑创伤性脑损伤后炎性因子,对炎症和氧化应激信号通路的变化在大脑中仍然未知。放心,需要进一步的研究,并将在我们实验室进行的。

细胞凋亡在大脑去撞墙受伤发生不仅影响现场还由于二级大脑侮辱颅内高血压等,缺氧,或微循环障碍27]。研究关于NAC对创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的影响还没有被发现。然而,一些先前的研究已经表明,NAC可以防止体外凋亡神经细胞的死亡(28,29日]。南京也抑制procaspase-9处理和酶活性的激活还存在由丙烯醛。acrolein-induced抑制细胞凋亡形态学证实了使用NAC的凝结核染色质减少,所评估的荧光显微镜(30.]。在本研究中,我们发现系统性南京政府可以抑制凋亡细胞死亡在受伤的大脑和潜在的减少创伤性脑损伤后继发性脑损伤。然而,目前尚不清楚是否NAC可以调节凋亡信号,整个机制需要进一步的研究。

总之,我们所知,这是第一次研究证明南汽的影响在创伤性脑损伤后炎症反应在大脑受伤的。我们发现创伤性脑损伤可能上调NF -的表达式κB, il - 1β肿瘤坏死因子-α周围,ICAM-1大脑受伤的网站,可明显抑制由南京政府。post-TBI NAC治疗的好处政府可能是因为其有益的影响调节大脑炎症继发于创伤性脑损伤。

确认

作者感谢Bo Wu博士和Geng-bao冯博士的技术援助。这部分工作由中国支持的奖学金委员会(CSC)。