toll样受体和细胞因子替代生物标志物来评估阴道杀微生物剂后的免疫反应

文摘

局部杀菌剂用于频繁使用由女性在生育年龄。因此,必须评估他们对阴道的粘膜免疫功能的影响。在目前的研究中,我们评估乳酸链球菌肽,一种天然抗菌肽(AMP),对其功效作为阴道内的杀微生物剂。对阴道的影响免疫功能是由本地化toll样受体(TLRs-3 9)和细胞因子(il - 4、6、10和TNF -)在阴道内的管理后的兔cervicovaginal上皮高剂量的乳酸链球菌肽凝胶连续14天。结果显示没有改变通常的表达和细胞因子蛋白和mRNA水平。然而,在SDS gel-treated组,显著水平调节的感应NF -B信号级联。因此,通常和细胞因子表现为敏感指标筛选immunotoxic候选人杀微生物剂的潜力。

1。介绍

正在寻求防止局部杀菌剂的传播人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和其它性传播感染(性病)[1]。抗hiv / STI杀微生物剂的成功取决于他们的能力保持阴道自然防御,因为人类阴道一致的复层上皮与微生物群落提供了一种有效的屏障对hiv - 1 (2]。众所周知,病原体或化学刺激引起的炎症条件可能会导致更高的风险获取和传播hiv - 1由于上皮破坏和招聘的hiv - 1免疫细胞(3]。

在早期开发安全有效的局部杀菌剂消除的性传播性传播感染的风险/ hiv - 1、壬苯醇醚- 9 (n - 9),化工产品,成为领先候选人由于其对微生物的有效活动在体外作为避孕和广泛的商业用途(4,5]。然而,临床试验显示,频繁使用的n - 9导致生殖道的炎症损伤和溃疡粘膜直接创建一个门户的hiv - 1 (6,7]。另外两个产品,硫酸纤维素(6%)和carraguard也没有杀微生物剂尽管临床前安全试验(http://www.aidsmap.com)。

的一个最有前途的替代化学- / detergent-based阴道杀微生物剂似乎是天然抗菌肽(安培)8,9]。他们代表古老的宿主防御效应分子产生的先天免疫系统针对病原微生物或炎症刺激。最广泛AMP特征是lantibiotic乳酸链球菌肽,34个氨基酸阳离子、两性分子肽分子质量的3.5 kDa [10,11]。我们以前的研究表明,阴道内的乳酸链球菌肽管理局不触发任何炎症反应在CVE的兔子8,12]。

在发展的背景下一个安全的杀菌剂,它也是至关重要的,决定其干扰阴道粘膜免疫功能。的一个显著特征,阴道粘膜的免疫细胞识别和区分能力入侵微生物共生的细菌或炎性因子(13,14]。阴道粘膜免疫细胞具有不同的toll样受体(通常),属于一个大家庭的高度保守的蛋白质,是必不可少的pathogen-specific识别传感器的先天免疫系统15- - - - - -18]。到目前为止,11这个家庭的成员已确定在各种细胞(19- - - - - -21]。TLR信号阴道上皮细胞之间的沟通是一个关键的组件和潜在的免疫细胞在固有层(20.,22,23]。因此,我们推测通常可以作为合适的生物标志物来评估候选人的杀微生物剂引起的阴道炎症。

杀微生物剂发展的一个关键差距是由于缺乏引起代理安全标记。因为阴道杀微生物剂反复使用几十年,它将有利于评估对阴道先天免疫防御系统的影响。合适的生物标志物需要确定的变化发生在粘膜环境在分子水平上,包括诱导炎症或主机阴道的防御,损失由组织学(没有反映23]。非侵入性的方法来检测的组织炎症组织学的研究将是一个有用的助手。考虑到通常的关键作用和细胞因子在阴道粘膜先天免疫,我们进行了一项研究来确定阴道阴道内的乳酸链球菌肽凝胶的应用后免疫反应。

在这项研究中,我们选择TLRs-3和9,细胞因子(il - 4、6、10和TNF -)作为他们扮演不可或缺的角色在宿主天然免疫与适应性免疫的阴道。TLRs-3和9是已知的质膜上表达以及在核内体和刺激记忆b细胞发育,增殖,分化。他们也诱导抗炎细胞因子的分泌时,粘膜上皮炎症刺激感(19]。本研究的目标是(1)检查重复的影响应用高剂量的乳酸链球菌肽凝胶在阴道粘膜免疫使用兔子模型;(2)调查TLR乳酸链球菌肽凝胶和细胞因子引起的变化环境的兔子阴道;和(3)确定的角色通常及其下游信号级联主机阴道防御机制。我们所知,这是第一个报告演示在活的有机体内通常分布和识别假定的途径由TLR细胞因子间的相互作用在兔子的CVE阴道内的政府的杀微生物剂后,乳酸链球菌肽凝胶。

2。材料和方法

乳酸链球菌肽(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国很多075 k1355)是由在交联葡聚糖凝胶过滤层析纯化G-25和rp -描述(24]。短暂,凝胶过滤色谱法初步纯化后的冻干样品酸化以0.1%三氟乙酸(默克公司,孟买,印度)和应用到制备C8柱(美国生病Vydac)连接到一个Dionex高效液相色谱单元。肽的分数在三步筛选了梯度0.01%三氟乙酸在水和0.01%三氟乙酸在50%乙腈(Spectrochem,孟买,印度):0 - 100%(60分钟),举行100% 5分钟,带回0% (100 - 0%)。收集各个肽峰值及其吸光度是监控在220 nm使用分光光度计(日本岛津公司、uv - 160和日本)。积极的分数被冻干汇集和集中。乳酸链球菌肽凝胶(15.15毫米相当于50毫克)polycarbophil作为胶凝剂,制定使用1% SDS凝胶(56米相当于32polycarbophil g)在1%,安慰剂凝胶使用polycarbophil 1%。

2.1。动物

性发育成熟女性比利时白兔子(平均年龄个月;平均体重,公斤)保持在标准实验室条件下(温度、相对湿度,12小时光:12小时黑暗周期)。动物被单独安置在不锈钢笼子;食物和水都是可用的随意。这项研究是伦理委员会批准国家研究生殖健康研究所(NIRRH),帕雷尔和孟买。采取的措施都是按照指导委员会批准的控制和监督的目的动物实验(CPCSEA),由印度政府建立在动物保健。

2.2。阴道内的政府乳酸链球菌肽凝胶的兔子

兔子被分成三个组组成的六个动物。第一批动物收到乳酸链球菌肽凝胶配方准备1% polycarbophil(15.15毫米polycarbophil 2毫升的1% /天连续14天)。第二和第三组兔子收到SDS凝胶(56米2毫升1% polycarbophil /天/连续14天)和2毫升1% polycarbophil凝胶,分别。这种凝胶配方被交付到阴道使用12厘米灵活的导管,插入其8厘米。兔子的身体重量和临床观察记录,包括外阴肿胀区域,血液染色尿液和大便软。

15天,cervicovaginal灌洗(cvl) 500年管理来自安慰剂和治疗兔子l使用生理盐水和动物的解剖窒息。样品在1000 g离心5分钟将上层清液与细胞碎片。阴道组织之间缝隙打开罕见尿道口和穹窿。部分cervicovaginal组织固定在Bouin的解决方案。石蜡的5米厚的被削减,通常用于immunolocalization (TLR-3和9)和细胞因子(il - 4、6、10和TNF -)。其余组织立即处理流仪评价通常和rt - pcr分析。

2.3。隔离的兔子CVE细胞

CVE组织三组兔子隔绝,切成小碎片,池(200 - 300 mg) groupwise被临时冻结在液氮干冰和存储直到进一步分析。在分析,细胞悬浊液被酶消化如前所述[准备25]。短暂,CVE的碎片和50 000 U /毫升的胰蛋白酶消化(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)2.5% (w / v)胰液素溶液为1小时(σ)4,其次是1小时消化在22岁在恒定的旋转(120 rpm)。消化组织被漩涡释放上皮细胞悬液通过20之前表尼龙网(微孔Corp . Billerica,妈,美国)。细胞吸气通过20计针准备孤立的细胞再悬浮在完成Rosewell公园纪念研究所- 1640 (rpmi - 1640)中(美国马里兰州生活技术,Inc .)(25毫米玫瑰补充10%胎牛血清(Hyclone), 50M 2-mercaptoethanol, 2毫米谷酰胺,100g / mL链霉素,青霉素和100 U /毫升),然后播种到Nunc细胞培养插入(10毫米直径,孔隙大小,0.4米)涂稀释基底膜基质(σ),享年300岁l /插入顶端细胞室文化。将被插入24组织培养板包含500l的培养基。上皮细胞培养的纯度是评估通过anti-CD45抗体表明CVE细胞占90%以上的细胞出现在每个插入。

2.4。Immunofluourescent(如果)通常的本地化

这个实验的目的是确定的模式变化TLR表达式的CVE安慰剂,乳酸链球菌肽,SDS gel-treated兔子。CVE deparafinized二甲苯,组织部分患者按照等级的酒,最后洗在PBS (0.1 PBS, pH值7.4)。1:10 0稀释的非特异性结合被正常山羊血清和孵化371小时。在PBS洗涤后,一夜之间,幻灯片被孵化在41:10 0稀释的山羊反人类的TLR-3和TLR-9抗体(Imgenex)(猫sc - 8691 TLR-3和猫IMG 305 TLR-9) PBS。部分洗在PBS和孵化FITC共轭驴antigoat二级抗体(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)的稀释1:1000 371小时的黑暗。免疫荧光信号捕获使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)(德国蔡司510元)。

2.5。流仪结果

流式细胞术在流式细胞仪进行有利的流式细胞分析仪(美国,正欲)评估TLR-3和9 CVE细胞表面表达的。基于初始优化研究,细胞(在PBS /毫升)清洗简单,非特异性结合阻塞了1:10 0的正常山羊血清稀释371小时。对于细胞内染色,细胞首先处理固定缓冲区(4% pararformaldehyde)其次是透化作用缓冲区(Triton X 100 0.1%)。与PBS洗涤后,一夜之间,幻灯片被孵化在41:10 0稀释的山羊反人类的抗体TLR-3和TLR-9 1% BSA在PBS。在PBS洗涤后,细胞在37孵化1小时在黑暗与FITC共轭驴antigoat二级抗体的稀释1:1000。在PBS洗五次后,为每个细胞检测荧光信号通过一个520纳米氩离子激光。我们包括正常山羊血清适当负控制排除任何非特异性结合的抗体通过fc受体。数据至少000事件为每个样本收集。荧光直方图和点阴谋后生成控制使用细胞的细胞群追求软件(http://facs.scripps.edu/)。

2.6。细胞因子的免疫组织化学定位

的免疫组织化学定位促炎细胞因子(il - 6和TNF -)是按照设备协议所描述的制造商(美国明尼苏达州研发系统)(猫DTA00C il - 6和猫DY206 TNF -)。il - 4和10的本地化使用山羊执行反人类的主要抗体(西格玛奥德里奇,猫I7526 il - 4、il - 10 I5020)。短暂,cervicovaginal组织部分安慰剂,乳酸链球菌肽,SDS gel-treated兔子如上所述进行处理。内源性过氧化物酶活性被治疗cervicovaginal淬火组织为0.03%在PBS甲醇10分钟,冲洗5分钟。排除非特异性结合,部分被孵化在正常山羊血清代替主要抗体和视为消极的控制。与PBS洗涤后,幻灯片与各自的孵化主要抗体在一夜之间在4。第二天,幻灯片在PBS和孵化1小时洗两次在RT 1:10 0稀释的驴antigoat二级抗体结合辣根过氧化物酶(合)(西格玛奥德里奇,猫G6638)。

在PBS洗涤后,部分被孵化10分钟- - - - - -diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)包含和在PBS。组织部分被短暂地在水中冲洗,用苏木精复染色。在酒精系列脱水后,部分被清除在二甲苯,与DPX安装,使用奥林巴斯显微镜BX50可视化。

2.7。图像分析

半定量的分析细胞因子的免疫沉淀反应进行了使用图像分析软件Biovis 1.42之前详细(26]。短暂,从每个部分被随机选择四个方面对每个动物的三组。图像从这些地区被CCD相机了。集成光密度(IOD)计算每个区域的棕色免疫沉淀反应。负控制幻灯片在类似的方式进行了分析。每组的均值±SDs计算。

2.8。测量细胞因子水平Cervicovaginal灌洗

水平的促炎(il - 6和TNF -),th2型il - 4和抗炎细胞因子(il - 10)在cvl衡量ELISA按照协议上面所讨论的。产品的光学密度形成用ELISA测定读者(800年ELX Bio-TEK仪器)。细胞因子水平的计算是通过二次回归分析基于对数转换光学密度。干扰细胞因子凝胶配方的ELISA被飙升排除已知浓度的标准。控制和处理样本化验一井和实验重复三次。

2.9。测量Phospho-NF-kB p65 CVE细胞

NF -的激活kB信号级联CVE组织决心按照制造商的协议使用Phospho-NF -kB p65 (Ser536)夹心酶联免疫试剂盒(细胞信号,马,美国)。短暂,细胞溶解产物与裂解缓冲准备(20毫米三,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米乙烯glycol-bis (2-aminoethyl) - N, N,,特里同x - 100年(EGTA) 1%, 2.5毫米焦磷酸钠,1毫米甘油磷酸盐,1毫米Na3一1g / mL亮抑酶肽)和用冰。溶菌产物是离心机在14 000 rpm(埃普多夫541 r) 10分钟4颗粒细胞碎片。整除,收集上清液和存储在单使用整除。细胞溶解产物被添加到microwells涂Phospho-NF -kB p65 (Ser536) (93 h1)鼠标马伯和孵化一夜之间在4。

广泛的清洗清洗缓冲后,100年l Phospho-NF -kB p65兔子马伯(细胞信号,马、美国、猫3033)是添加到井和孵化1小时37检测捕获Phospho-NF -kB p65蛋白。洗后,100l antirabbit免疫球蛋白二次抗体结合合(细胞信号,马、美国、猫在37 7074)添加和孵化1小时认识到结合抗体。100年l衬底,- - - - - -tetramethylbenzidine(三甲)添加和孵化10分钟37发展蓝色。通过添加100反应停止l停止解决方案。黄色的产品的OD被ELISA读者以450海里。每个值的平均数±标准差是六个人的观察获得三个实验在不同的日子里进行。

2.10。RNA通常隔离和rt - pcr分析,细胞因子,Defensin-1分子

从CVE组织总RNA分离乳酸链球菌肽、SDS,安慰剂gel-treated兔子顺序提取使用TriPure试剂根据制造商的协议(罗氏公司、德国)。RNA是量化spectrophotometrically在260和280 nm (uv - 160 a、日本岛津公司、日本)。RNA的质量和完整性是由1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和用于半定量rt - pcr。放大之前,所有的RNA样本处理RNase-free DNase-I(试剂盒)排除基因组DNA污染。简单,反应在ptc - 200进行热循环(美国马里兰州MJ研究)总量的50包含10 l反应混合物l 5 x rt - pcr缓冲,2l核苷酸混合物,1l酶混合,2l的0.4每个引物M, 1总RNA (2 lg), 1l德勤的解决方案,和31l核糖核酸酶游离水。RT PCR合成cDNA 50岁30分钟之后,放大使用gene-specific引物(表194)30 - 40周期30秒,退火在55 - 64为30秒,扩展为6840秒之后,最终扩展为687分钟。反应是放大在逆转录酶的缺乏消极的控制。nontemplate控制反应还包括确保缺乏DNA污染。管家基因,GAPDH担任内部加载控制。PCR产品通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,沾EtBr (0.5g / mL)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),由紫外线透照可视化,使用凝胶医生系统成像(美国加州Bio-Rad)。

2.11。统计分析

在大多数情况下,结果表示为平均值±标准偏差。据统计,安慰剂组和治疗组之间的显著差异使用方差分析或评估t测试和差异被认为是重要的如果值是。

3所示。结果

3.1。Immunofluorescent通常的本地化

确定乳酸链球菌肽凝胶在粘膜免疫的影响,兔子阴道内的管理与安慰剂,乳酸链球菌肽和SDS凝胶。代表图像TLR-9 immunofluorescent本地化的TLR-9 CVE细胞图所示1。TLR-9本地化在细胞膜和细胞质内的CVE细胞。类似的表达模式是TLR-3(数据没有显示)。阴道分娩的高剂量乳酸链球菌肽凝胶没有任何负面影响TLRs-3和9的表达相比安慰剂gel-treated组。

3.2。流式细胞术的通常

乳酸链球菌肽凝胶的炎症可能是通过流式细胞术进一步评估。结果显示无显著差异TLR-3阳性细胞的数量和9之间的安慰剂,乳酸链球菌肽gel-treated组(图2)。然而,在SDS gel-treated集团平均荧光强度TLR-3和9显著增加。实验重复了两次重复和相似的结果。

3.3。rt - pcr分析TLR表达式

确定阴道乳酸链球菌肽凝胶导致调制通常和细胞因子基因的表达TLR使用rt - pcr和细胞因子mRNA转录本进行了分析。如数据所示3和9rt - pcr结果显示没有变化在乳酸链球菌肽表达gel-administered兔子相比安慰剂组。

3.4。细胞因子的免疫组织化学定位

证明了CVE细胞表达TLRs-3和9,我们接下来研究了调制各种细胞因子在cervicovaginal组织为了应对杀微生物剂凝胶免疫组织化学。的表达细胞因子(il - 4、6、10和TNF -)中观察到的细胞质分泌产品没有安慰剂和nisin-treated团体之间的染色强度的变化。然而,水平明显调节(数字4- - - - - -7在SDS对待动物。增加与增强白细胞的数量无关或中性粒细胞cvl(数据没有显示)。ELISA结果与免疫组织化学cvl在完美的协议数据(图8)。

3.5。测定NF -kB P65 CVE细胞

调制NF -kB-related信号确定在阴道内的乳酸链球菌肽凝胶的应用和与安慰剂比较gel-administered组。的磷酸化状态NF -kB和顺向NF -后基因表达的变化kB调制ELISA测定通过比较相对大量的磷酸化NF -k蛋白质总NF - BkB蛋白。暴露的CVE SDS凝胶明显激活NF -触发k然而,这种感应NF -kB信号没有观察到乳酸链球菌肽凝胶治疗动物和安慰剂gel-treated组(图10)。

3.6。rt - pcr分析,兔子Defensin-1

检查是否观察到的细胞因子水平的增加与阴道粘膜免疫的变化有关,我们评估defensin-1 CVE细胞中的基因的表达。三个独立实验的结果表明,乳酸链球菌肽凝胶治疗没有造成任何改变的mRNA表达defensin-1相比安慰剂gel-treated组。而在SDS凝胶治疗组defensin-1基因的表达明显升高(图11)。

4所示。讨论

局部杀菌剂被评为承诺策略预防性病/艾滋病的同时保护或提高自然粘膜屏障(27,28]。乳酸链球菌肽,一种天然的AMP,目前正在开发的阴道内的杀微生物剂预防性病和意外怀孕8]。筛选乳酸链球菌肽凝胶为不受欢迎的特点在临床环境,我们选择了兔模型,因为它已经证明,兔子阴道杀微生物剂的响应能力类似于人类的阴道(29日]。

免疫调节炎症被牵连在阴道中扮演一个角色先天免疫(30.]。炎症反应限制杀菌剂的有益作用,这可能是特别关注的,如果炎症持续超出了杀微生物剂在场时间(29日]。阴道上皮细胞代表主要居民先天免疫细胞在阴道深处,调节炎症反应杀微生物剂(31日]。通常哺乳动物的toll样受体),包括TLR-1 TLR11,传感器成为一个重要的角色在宿主防御机制(32]。TLR调制中的作用的基础上,先天免疫和响应炎症挑战,我们检查了TLR-3和9的表达这些炎症刺激的识别中扮演着重要的角色在阴道宿主免疫防御33,34]。

条件下的预期用途/直肠阴道内的杀微生物剂,个人将暴露于杀微生物剂更短或更长时间。因此,高剂量的乳酸链球菌肽凝胶polycarbophil 2毫升的1%(15.15毫米)每天连续14天在兔子管理以确保凝胶的估计风险/收益是否有利于其预期使用。immunofluorescent结果显示本地化TLRs-3和9的质膜以及CVE细胞的核内体存在于细胞质中。TLR表达式并没有改变的CVE细胞乳酸链球菌肽和安慰剂gel-treated组。这些结果是在协议与流式细胞仪数据没有变化百分比免疫反应性的细胞表达观察TLRs-3和9。然而,细胞的数量表达TLRs-3和9在SDS gel-treated动物显著升高。研究进一步扩展到看透TLR表达式在分子水平上的调控。rt - pcr结果显示没有变化的表达式TLRs-3和9 mRNA转录的CVE细胞乳酸链球菌肽gel-treated兔子相比安慰剂gel-treated组,表明阴道乳酸链球菌肽凝胶的应用并没有引起任何炎症相关的改变在转录和翻译水平。通过TLR-3 CVE细胞识别组织炎症和9,可能通过非特异性机制。这些结果诱惑我们推测,信号通过通常可能参与机制引发Th2-based免疫反应,可以预防或促进阴道炎症(35]。

早些时候的研究表明,许多当地的阴道粘膜的炎症反应启动通常由一个复杂的相互影响,在人类阴道炎症因子(32,36]。在一个优雅的研究中,Fichorova et al。33]显示TLR 1 - 6基因的存在主要和无限增殖子宫,ectocervical,阴道上皮细胞系。他们证明mRNA TLRs-1, 2, 3, 6在这些细胞。相比之下,没有检测PCR产物的地在细胞。它最近已被证明,受体激动剂TLR-2(发酵菌),TLR-3[保利(我:C)], TLR-5(鞭毛蛋白)和TLR-9 (CpG ODN)已知刺激免疫细胞分泌各种proinfammatory细胞因子(23]。这些研究支持我们现在观察乳酸链球菌肽凝胶没有上调由CVE细胞分泌炎性细胞因子的水平。相反,在SDS gel-treated动物,阴道组织中细胞因子的水平和阴道分泌物TLR-3/9-dependent的方式调节可能减缓组织炎症。

进一步分析机制,我们接下来研究了NF -的表达kB,因其能调节细胞因子和defensin-1 CVE细胞中表达。如图10,磷NF -k总NF - B p65和kB p65保持不变在安慰剂和乳酸链球菌肽gel-treated组,表明阴道乳酸链球菌肽凝胶的应用没有改变NF -kB信号级联。

我们进一步评估defensin-1的表达的主要效应分子对感染/炎症粘膜先天免疫(37]。考虑到一些defensins表达的中性粒细胞,上皮细胞、巨噬细胞、NK细胞和T细胞亚群在人类38,39),目前的结果表明,乳酸链球菌肽凝胶治疗没有造成任何改变defensin-1基因的表达表明NF -kB信号级联并没有受到影响。上述研究表明,乳酸链球菌肽凝胶可以提高或维持正常的免疫状态,协助解决炎症,而SDS凝胶似乎导致免疫抑制效应。

因此,我们假设通常或细胞因子似乎预测生物标志物来评估阴道粘膜的炎症状态在杀微生物剂管理。这些结果支持这一事实可溶性TLRs-2和4调节特定TLR-mediated响应,从而提供新的组织炎症生物标记40]。目前的数据让我们假定通常似乎至关重要的介质时阴道的防御和摄动引起炎症通路支配CVE细胞导致粘膜损伤。这些发现将有助于我们对性病/艾滋病的粘膜免疫的理解,可以帮助提高妇女生殖健康的质量。建立下游目标TLR-microbicide交互可能会进一步解开错综复杂的阴道的功能。

本研究首次提供证据的乳酸链球菌肽凝胶作为安全阴道内的化合物,以供将来使用。测试中的其他化合物目前临床试验计划将使该方法的验证并确定这是否安全、便宜的策略提供了一个替代生物标志物预测杀微生物剂安全性和有效性。然而,这项研究太小,使一个明确的结论。如果在一个更大的样本,确认这个策略可以用来确定哪些未来一代杀微生物剂应在发展前进,可能导致主要的成本节约。然而,鉴于这个新生国家的知识关于这一重要领域,很明显,需要更多的研究来提供有价值的见解通常和阴道先天免疫的生物。

确认

作者感谢博士Chander p .宫前主管给予鼓励,开展本研究。工作(NIRRH /女士/ 4/2008)部分是由印度医学研究理事会()。作者感谢Mangesh先生Malvankar优秀的秘书协助。

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