性发育成熟女性比利时白兔子(平均年龄 7 ± 1 个月;平均体重, 2.70 ± 0.40 公斤)保持在标准实验室条件下(温度 20. ± 1 C ° 、相对湿度 50 ± 10 % ,12小时光:12小时黑暗周期)。动物被单独安置在不锈钢笼子;食物和水都是可用的 随意。这项研究是伦理委员会批准国家研究生殖健康研究所(NIRRH),帕雷尔和孟买。采取的措施都是按照指导委员会批准的控制和监督的目的动物实验(CPCSEA),由印度政府建立在动物保健。

兔子被分成三个组组成的六个动物。第一批动物收到乳酸链球菌肽凝胶配方准备1% polycarbophil(15.15毫米polycarbophil 2毫升的1% /天连续14天)。第二和第三组兔子收到SDS凝胶(56 μ 米2毫升1% polycarbophil /天/连续14天)和2毫升1% polycarbophil凝胶,分别。这种凝胶配方被交付到阴道使用12厘米灵活的导管,插入其8厘米。兔子的身体重量和临床观察记录,包括外阴肿胀区域,血液染色尿液和大便软。

15天,cervicovaginal灌洗(cvl) 500年管理来自安慰剂和治疗兔子 μ l使用生理盐水和动物的解剖 有限公司 2 窒息。样品在1000 g离心5分钟将上层清液与细胞碎片。阴道组织之间缝隙打开罕见尿道口和穹窿。部分cervicovaginal组织固定在Bouin的解决方案。石蜡的5 μ 米厚的被削减,通常用于immunolocalization (TLR-3和9)和细胞因子(il - 4、6、10和TNF - α )。其余组织立即处理流仪评价通常和rt - pcr分析。

CVE组织三组兔子隔绝,切成小碎片,池(200 - 300 mg) groupwise被临时冻结在液氮干冰和存储直到进一步分析。在分析,细胞悬浊液被酶消化如前所述[准备 25]。短暂,CVE的碎片和50 000 U /毫升的胰蛋白酶消化(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)2.5% (w / v)胰液素溶液为1小时(σ)4 C ° ,其次是1小时消化在22岁 C ° 在恒定的旋转(120 rpm)。消化组织被漩涡释放上皮细胞悬液通过20之前表 μ 尼龙网(微孔Corp . Billerica,妈,美国)。细胞吸气通过20计针准备孤立的细胞再悬浮在完成Rosewell公园纪念研究所- 1640 (rpmi - 1640)中(美国马里兰州生活技术,Inc .)(25毫米玫瑰补充10%胎牛血清(Hyclone), 50 μ M 2-mercaptoethanol, 2毫米谷酰胺,100 μ g / mL链霉素,青霉素和100 U /毫升),然后播种到Nunc细胞培养插入(10毫米直径,孔隙大小,0.4 μ 米)涂稀释基底膜基质(σ),享年300岁 μ l /插入顶端细胞室文化。将被插入24组织培养板包含500 μ l的培养基。上皮细胞培养的纯度是评估通过anti-CD45抗体表明CVE细胞占90%以上的细胞出现在每个插入。

这个实验的目的是确定的模式变化TLR表达式的CVE安慰剂,乳酸链球菌肽,SDS gel-treated兔子。CVE deparafinized二甲苯,组织部分患者按照等级的酒,最后洗在PBS (0.1 PBS, pH值7.4)。1:10 0稀释的非特异性结合被正常山羊血清和孵化37 C ° 1小时。在PBS洗涤后,一夜之间,幻灯片被孵化在4 C ° 1:10 0稀释的山羊反人类的TLR-3和TLR-9抗体(Imgenex)(猫 # sc - 8691 TLR-3和猫 # IMG 305 TLR-9) PBS。部分洗在PBS和孵化FITC共轭驴antigoat二级抗体(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)的稀释1:1000 37 C ° 1小时的黑暗。免疫荧光信号捕获使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)(德国蔡司510元)。

流式细胞术在流式细胞仪进行有利的流式细胞分析仪(美国,正欲)评估TLR-3和9 CVE细胞表面表达的。基于初始优化研究,细胞( 1 × 10 6 在PBS /毫升)清洗简单,非特异性结合阻塞了1:10 0的正常山羊血清稀释37 C ° 1小时。对于细胞内染色,细胞首先处理固定缓冲区(4% pararformaldehyde)其次是透化作用缓冲区(Triton X 100 0.1%)。与PBS洗涤后,一夜之间,幻灯片被孵化在4 C ° 1:10 0稀释的山羊反人类的抗体TLR-3和TLR-9 1% BSA在PBS。在PBS洗涤后,细胞在37孵化 C ° 1小时在黑暗与FITC共轭驴antigoat二级抗体的稀释1:1000。在PBS洗五次后,为每个细胞检测荧光信号通过一个520纳米氩离子激光。我们包括正常山羊血清适当负控制排除任何非特异性结合的抗体通过fc受体。数据至少000事件为每个样本收集。荧光直方图和点阴谋后生成控制使用细胞的细胞群追求软件( http://facs.scripps.edu/)。

的免疫组织化学定位促炎细胞因子(il - 6和TNF - α )是按照设备协议所描述的制造商(美国明尼苏达州研发系统)(猫 # DTA00C il - 6和猫 # DY206 TNF - α )。il - 4和10的本地化使用山羊执行反人类的主要抗体(西格玛奥德里奇,猫 # I7526 il - 4、il - 10 I5020)。短暂,cervicovaginal组织部分安慰剂,乳酸链球菌肽,SDS gel-treated兔子如上所述进行处理。内源性过氧化物酶活性被治疗cervicovaginal淬火组织为0.03% H 2 O 2 在PBS甲醇10分钟,冲洗5分钟。排除非特异性结合,部分被孵化在正常山羊血清代替主要抗体和视为消极的控制。与PBS洗涤后,幻灯片与各自的孵化主要抗体在一夜之间在4 C ° 。第二天,幻灯片在PBS和孵化1小时洗两次在RT 1:10 0稀释的驴antigoat二级抗体结合辣根过氧化物酶(合)(西格玛奥德里奇,猫 # G6638)。

在PBS洗涤后,部分被孵化10分钟 3 - - - - - - 3 ′ diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)包含 倪 2 + 和 H 2 O 2 在PBS。组织部分被短暂地在水中冲洗,用苏木精复染色。在酒精系列脱水后,部分被清除在二甲苯,与DPX安装,使用奥林巴斯显微镜BX50可视化。

半定量的分析细胞因子的免疫沉淀反应进行了使用图像分析软件Biovis 1.42之前详细( 26]。短暂,从每个部分被随机选择四个方面对每个动物的三组。图像从这些地区被CCD相机了。集成光密度(IOD)计算每个区域的棕色免疫沉淀反应。负控制幻灯片在类似的方式进行了分析。每组的均值±SDs计算。

水平的促炎(il - 6和TNF - α ),th2型il - 4和抗炎细胞因子(il - 10)在cvl衡量ELISA按照协议上面所讨论的。产品的光学密度形成用ELISA测定读者(800年ELX Bio-TEK仪器)。细胞因子水平的计算是通过二次回归分析基于对数转换光学密度。干扰细胞因子凝胶配方的ELISA被飙升排除已知浓度的标准。控制和处理样本化验一井和实验重复三次。

NF -的激活 kB信号级联CVE组织决心按照制造商的协议使用Phospho-NF - kB p65 (Ser536)夹心酶联免疫试剂盒(细胞信号,马,美国)。短暂,细胞溶解产物与裂解缓冲准备(20毫米三,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米乙烯glycol-bis (2-aminoethyl) - N, N, N ′ , N ′ 特里同x - 100年(EGTA) 1%, 2.5毫米焦磷酸钠,1毫米 β 甘油磷酸盐,1毫米Na3一1 μ g / mL亮抑酶肽)和用冰。溶菌产物是离心机在14 000 rpm(埃普多夫541 r) 10分钟4 C ° 颗粒细胞碎片。整除,收集上清液和存储 − 80年 C ° 在单使用整除。细胞溶解产物被添加到microwells涂Phospho-NF - kB p65 (Ser536) (93 h1)鼠标马伯和孵化一夜之间在4 C ° 。

广泛的清洗清洗缓冲后,100年 μ l Phospho-NF - kB p65兔子马伯(细胞信号,马、美国、猫 # 3033)是添加到井和孵化1小时37 C ° 检测捕获Phospho-NF - kB p65蛋白。洗后,100 μ l antirabbit免疫球蛋白二次抗体结合合(细胞信号,马、美国、猫 # 在37 7074)添加和孵化 C ° 1小时认识到结合抗体。100年 μ l衬底, 3 ′ - - - - - - 3 ′ tetramethylbenzidine(三甲)添加和孵化10分钟37 C ° 发展蓝色。通过添加100反应停止 μ l停止解决方案。黄色的产品的OD被ELISA读者以450海里。每个值的平均数±标准差是六个人的观察获得三个实验在不同的日子里进行。

从CVE组织总RNA分离乳酸链球菌肽、SDS,安慰剂gel-treated兔子顺序提取使用TriPure试剂根据制造商的协议(罗氏公司、德国)。RNA是量化spectrophotometrically在260和280 nm (uv - 160 a、日本岛津公司、日本)。RNA的质量和完整性是由1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和用于半定量rt - pcr。放大之前,所有的RNA样本处理RNase-free DNase-I(试剂盒)排除基因组DNA污染。简单,反应在ptc - 200进行热循环(美国马里兰州MJ研究)总量的50 μ 包含10 l反应混合物 μ l 5 x rt - pcr缓冲,2 μ l核苷酸混合物,1 μ l酶混合,2 μ l的0.4 μ 每个引物M, 1 μ 总RNA (2 l μ g), 1 μ l德勤的解决方案,和31 μ l核糖核酸酶游离水。RT PCR合成cDNA 50岁 C ° 30分钟之后,放大使用gene-specific引物(表 194)30 - 40周期 C ° 30秒,退火在55 - 64 C ° 为30秒,扩展为68 C ° 40秒之后,最终扩展为68 C ° 7分钟。反应是放大在逆转录酶的缺乏消极的控制。nontemplate控制反应还包括确保缺乏DNA污染。管家基因,GAPDH担任内部加载控制。PCR产品通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,沾EtBr (0.5 μ g / mL)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国),由紫外线透照可视化,使用凝胶医生系统成像(美国加州Bio-Rad)。

在大多数情况下,结果表示为平均值±标准偏差。据统计,安慰剂组和治疗组之间的显著差异使用方差分析或评估 t测试和差异被认为是重要的如果 p 值是 < 0。 。

确定乳酸链球菌肽凝胶在粘膜免疫的影响,兔子阴道内的管理与安慰剂,乳酸链球菌肽和SDS凝胶。代表图像TLR-9 immunofluorescent本地化的TLR-9 CVE细胞图所示 1。TLR-9本地化在细胞膜和细胞质内的CVE细胞。类似的表达模式是TLR-3(数据没有显示)。阴道分娩的高剂量乳酸链球菌肽凝胶没有任何负面影响TLRs-3和9的表达相比安慰剂gel-treated组。

乳酸链球菌肽凝胶的炎症可能是通过流式细胞术进一步评估。结果显示无显著差异TLR-3阳性细胞的数量和9之间的安慰剂,乳酸链球菌肽gel-treated组(图 2)。然而,在SDS gel-treated集团平均荧光强度TLR-3和9显著增加。实验重复了两次重复和相似的结果。

确定阴道乳酸链球菌肽凝胶导致调制通常和细胞因子基因的表达TLR使用rt - pcr和细胞因子mRNA转录本进行了分析。如数据所示 3和 9rt - pcr结果显示没有变化在乳酸链球菌肽表达gel-administered兔子相比安慰剂组。

证明了CVE细胞表达TLRs-3和9,我们接下来研究了调制各种细胞因子在cervicovaginal组织为了应对杀微生物剂凝胶免疫组织化学。的表达细胞因子(il - 4、6、10和TNF - α )中观察到的细胞质分泌产品没有安慰剂和nisin-treated团体之间的染色强度的变化。然而,水平明显调节(数字 4- - - - - - 7在SDS对待动物。增加与增强白细胞的数量无关或中性粒细胞cvl(数据没有显示)。ELISA结果与免疫组织化学cvl在完美的协议数据(图 8)。

调制NF - kB-related信号确定在阴道内的乳酸链球菌肽凝胶的应用和与安慰剂比较gel-administered组。的磷酸化状态NF - kB和顺向NF -后基因表达的变化 kB调制ELISA测定通过比较相对大量的磷酸化NF - k蛋白质总NF - B kB蛋白。暴露的CVE SDS凝胶明显激活NF -触发 k然而,这种感应NF - kB信号没有观察到乳酸链球菌肽凝胶治疗动物和安慰剂gel-treated组(图 10)。

检查是否观察到的细胞因子水平的增加与阴道粘膜免疫的变化有关,我们评估defensin-1 CVE细胞中的基因的表达。三个独立实验的结果表明,乳酸链球菌肽凝胶治疗没有造成任何改变的mRNA表达defensin-1相比安慰剂gel-treated组。而在SDS凝胶治疗组defensin-1基因的表达明显升高(图 11)。