文摘

血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-I)已知影响内皮功能降低的形成强有力的血管收缩的血管紧张素ⅱ的生物利用度,增加血管舒张血管舒缓激肽和一氧化氮。为了测试的潜在差异类ACE-I,我们已评估其对endothelin-1和一氧化氮的影响可用性,以及在人类血管内皮细胞活性氧生成(HUVECs)从脐带静脉。HUVECs被培养的要么sulfhydryl-containing ACE-I (zofenoprilat或卡托普利)或nonsulfhydryl-containing ACE-I(依那普利或赖诺普利)。24小时后,所有ACE-I endothelin-1分泌减少,增加一氧化氮产量。然而,zofenoprilat (42%,8小时的潜伏期)更有效(比依那普利)(25%)、赖诺普利(21%)、卡托普利(在减少endothelin-1分泌30%)。同样,zofenoprilat(8小时后孵化+ 110%)更有效()比依那普利(+ 64%),赖诺普利(+ 63%)和卡托普利(+ 65%)增加亚硝酸盐+硝酸生产。ACE-I在一氧化氮的影响可用性和endothelin-1分泌物是由缓激肽的激活受体被恢复,至少部分由一个特定的对手。Zofenoprilat,在较小程度上,卡托普利也使肿瘤坏死因子(TNF)刺激生产活性氧和降低TNF刺激内皮细胞中谷胱甘肽消费。总之,ACE-I类之间的结构差异与介质的相互作用中发挥作用,影响内皮细胞的体内平衡。zofenoprilat施加显著的抗氧化效果由于其巯基集团和lipophilia似乎负责更大的内皮保护活动。

1。介绍

血管紧张素转换酶(ACE),也被称为kininase二世,是一个二价dipeptidyl羧基metallopeptidase现在既是一种膜结合上皮,神经上皮、内皮细胞,包括血管的可溶性形式在不同的体液,包括血液(1]。由于其能够打通c端二肽的肽,高手可以把活动十肽血管紧张素我活动八肽血管紧张素ⅱ或灭活细胞分裂素(1]。因此,ACE战略调节vasoconstrictive之间的平衡和salt-retentive肾素-血管紧张素系统,常和利钠kallikrein-kinin [1]。因此,在最初使用抗高血压药物(2),血管紧张素转换酶抑制剂(ace是)迅速成为一个基本的工具还在治疗充血性心力衰竭、心肌梗死后左心室功能障碍,糖尿病和非糖尿病肾病2- - - - - -4]。

尽管成功使用的所有上述条件,负责血管福利机制所ACE-I并不完全理解。ACE-I能够提高endothelium-dependent [5]和endothelium-independent [6)血管放松。然而,ACE-I内皮的影响不仅是依赖减少血管紧张素II的形成,增加缓激肽的生物利用度(2,5,6]。在这方面,有人建议ACE-I的血管作用可能也与他们的能力来减少生产endothelin-1 (ET-1) [7),其中一个最有效的血管收缩剂(8),通过增加一氧化氮(NO)的生产(7,9)导致ET-1基因表达下调(9]。

在这方面,包含ACE-I巯基可以充当抗氧化剂清除超氧化物阴离子(10)以及nonsuperoxide激进分子(11]。自unscavenged超氧化物阴离子淬灭不给助氧化剂过氧亚硝基化合物(12),这是无法抑制(甚至让)ET-1基因表达,包含ACE-I巯基可以在减少特别有效培养HUVECs ET-1分泌的增加没有生产(13]。

为了解决这个话题,我们比较zofenoprilat和卡托普利的影响,,两个包含ACE-I巯基,与依那普利和赖诺普利,两个包含ACE-I nonsulfhydryls, ET-1分泌和生产人类血管内皮细胞(HUVECs)。此外,评估ACE-I抗氧化性能,对细胞内的影响内容的内源性自由基清除剂减少谷胱甘肽(GSH) (14,15)和活性氧的生成也评估。

2。材料和方法

2.1。细胞

HUVECs收获从新鲜人类脐带静脉培养到第三passageas前所述[7,16,17]。纯洁的内皮细胞单层证实了他们的鹅卵石形态模式和与单克隆抗体特定细胞染色血管性血友病因子(17]。新汇合的细胞培养基与胰蛋白酶化被取消;胰蛋白酶抑制20%胎牛血清,和细胞在培养基中洗。经过10分钟的离心(1100 rpm,C),上层的删除和HUVECs resuspended培养基(3毫升),然后用于实验。

HUVECs或者给予zofenoprilat孵化(zofenopril)的活性形式,或依那普利(卡托普利)的活性形式,或者赖诺普利卡托普利对各种时间24小时。重复上述实验的缓激肽,或,血管舒缓激肽受体拮抗剂或,血管舒缓激肽受体拮抗剂。最后,实验也重复的存在没有合酶竞争性抑制剂-nitro-L-arginine甲酯(L-NA)。

得到Zofenoprilat Menarini Ricerche SpA、佛罗伦萨、意大利。血管紧张素ⅱ被Clinalfa (Laufelfingen、瑞士)。其他试剂购买的西格玛(圣路易斯,密苏里州,美国)。如果不是另有规定,所有的测试物质已经被添加到培养基的最终浓度浓度,完全抑制人类重组ACE的对手正在研究[18]。

2.2。Endothelin-1

肽是化验如前所述[16]。总之,培养基来自每个好离心机在3.000 rpm 10分钟。上层清液随后冻干,重组开始高效液相色谱缓冲区,注射到列(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典),筛选了70多分钟使用一个线性渐变的15 - 75%乙腈/ 0.1%三氟乙酸在水里。分数是每分钟收集和蒸发在调整之前分析缓冲区(50更易与L磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,包含0.9%的氯化钠,0.05%,0.5%的牛血清白蛋白)。Endothelin-1免疫反应性被敏敏感等然后在重组样本化验(半岛实验室,加州贝尔蒙特,美国)。Interassay和intra-assay变化< 10%。大的ET-1抗体与endothelin-2 endothelin-3 < 7%,根据供应商。

2.3。一氧化氮

没有生产HUVECs评估评估没有代谢物的浓度(),也就是说,亚硝酸盐加硝酸,在培养基中。简单地说,后,比色检测亚硝酸盐浓度进行评估所有样品的硝酸盐转化成亚硝酸盐(试验设计有限公司,来自美国密歇根州安阿伯市,美国)如前所述[7]。

2.4。测量细胞内谷胱甘肽氧化还原状态和氧化应激

细胞内谷胱甘肽(GSH)含量测定根据我们小组以前描述的方法(15]。简而言之,HUVECs首先稀释在1毫升等渗盐水+盐酸(10更易/ L),然后细胞溶解在丙酮、四次解冻,离心机15分钟c .上层清液5-sulfosalicylic酸脱去蛋白质有10%,用于总谷胱甘肽的决心,也就是说,谷胱甘肽(GSH) +二硫化谷胱甘肽(GSSG),酶方法所描述的安德森(19]。GSSG决心,0.1毫升脱去蛋白质的上层清液服用2μL 2-vinylpyridine,最后与三乙醇胺中和pH值为6.5,化验后1小时孵化。然后,内皮细胞谷胱甘肽含量计算减GSSG总细胞内谷胱甘肽浓度。

细胞内氧化应激在基线测量,与肿瘤坏死因子(TNF)孵化后α据吴和Juurlink的方法(14]。总之,培养HUVECs装满了渗透剂5 -(6)羧基- - - - - --dichlorodihydrofluorescein (DCHF)酯为60分钟。在细胞内的酯酶渗透DCHF酯转化为其不透水。后者是氧化荧光光纤通过强氧化剂如羟基自由基(15,20.]。然后,细胞内氧化应激在HUVECs量化通过光纤监测内容与激发荧光计在525和495 nm和排放表示为百分数控制。

2.5。统计分析

迁移的变化分析了方差分析Bonferroni紧随其后的测试。多重比较分析方差分析其次是事后分析调整显著性水平。被认为是统计意义。数据给出均值±SD四个实验。

3所示。结果

3.1。ACE-I抵消Endothelin-1分泌HUVEC:不同通路的证据

所有测试ACE-I自发ET-1分泌减少了HUVECs水平相似诱导的血管舒缓激肽(见图1(a))。预培养与缓激肽受体拮抗剂但不是缓激肽受体拮抗剂无论是在废除对ET-1 ACE-I分泌的抑制作用HUVECs(见图1(b) -1(f))。这些数据表明,缓激肽刺激受体参与了抑制作用的四个测试ace是ET-1分泌。尽管所有的四个测试药物中和自发ET-1 HUVECs分泌,zofenoprilat是更有效的比其他ACE-I在此设置。此外,在ET-1 zofenoprilat分泌的抑制作用被缓激肽只是部分抵消受体抑制(见图1(c))。这一发现表明,血管舒缓激肽受体刺激并不代表的唯一途径参与抑制作用zofenoprilat HUVECs ET-1生产。

3.2。增加的抑制作用没有可用性负责ACE-I HUVECs Endothelin-1分泌

所有测试ACE-I与缓激肽显著增加自发浓度培养基(见图2(a))。ACE-I和血管舒缓激肽相关变化浓度是前孵化的HUVECs中和的缓激肽受体拮抗剂在(见图2(b) -2(f)),而血管舒缓激肽受体拮抗剂在在此设置是完全无效的数据吗2(b) -2(f))。的预培养HUVECs NO合酶抑制剂L-NA完全废除ACE-I和缓激肽的影响生产(见图2(b) -2(f))。此外,L-NA还中和ACE-I ET-1生产的抑制效果(见图1(b) -1(f))。这些数据表明,增加生产中起着关键作用的抑制作用ACE-I HUVECs endothelin-1分泌。尽管所有四个测试ACE-I有效地增加浓度培养基,这种效应更明显的zofenoprilat(见图2(a))。此外,血管舒缓激肽受体抑制只是部分有效的抵消zofenoprilat-induced增量浓度培养基(见图2(c))。

3.3。ACE-I减少细胞内氧化应激,提高谷胱甘肽含量

HUVECs预培养和zofenoprilat和卡托普利与依那普利和赖诺普利,但并非是导致肿瘤坏死因子的显著下降α刺激产生的活性氧(见图3(a))。尽管含巯基ACE-I降低TNFα刺激培养HUVECs活性氧生成,zofenoprilat是更有效的比卡托普利在此设置(见图3(a))。符合这一点,zofenoprilat但不是卡托普利,赖诺普利和依那普利对谷胱甘肽显著保护HUVECs减少观察与TNF孵化后α(见图3(b))。

4所示。讨论

ACE-I抵消ET-1生产能力由内皮细胞(7,9)已被建议作为一个相关因素施加知名血管保护作用的血管紧张素转换酶抑制(7,21]。事实上,虽然主音ET-1生产由内皮细胞生理有助于血管张力(21,22),这种肽本身所有的生物可能导致动脉粥样硬化血管损伤的发病和进展(8,21]。当前报告提供证据表明ACE-I,在浓度测试,完全抑制ACE,不分享共同的相似的功效抵消ET-1释放血管内皮细胞。事实上,我们发现zofenoprilat比卡托普利更有效,赖诺普利和依那普利在减少ET-1分泌物培养HUVECs。此外,我们的数据表明,不同细胞内途径参与的抑制性影响四个检测ace是ET-1分泌。在这种情况下,先前证明ACE-I ET-1生产的抑制作用HUVECs是由于血管舒缓激肽受体介导的增加没有生产HUVECs [9]。

众所周知,氧衍生自由基可以灭活不12]。反过来,没有代表一个障碍等氧化剂unscavenged超氧化物阴离子(23]。因此,它是合理的推测更大的效果观察与zofenoprilat ET-1分泌和增加生产减少培养HUVECs可能是由于其抗氧化性能(11,24]。在较小程度上符合这一点,zofenoprilat和卡托普利,但不是赖诺普利和依那普利,能够减少生成活性氧诱导的肿瘤坏死因子α在HUVECs。进一步,zofenoprilat但不是两个nonsulfhydryl包含ACE-I赖诺普利和依那普利钝化的谷胱甘肽减少HUVECs TNF诱导α。自含巯基ACE-I应该充当抗氧化剂的内源性自由基清除剂谷胱甘肽(2,10,11),这些发现表明,巯基可以负责在减少ET-1 zofenoprilat生产的影响,也就是说,由于sulfhydryl-related清除能力和随之而来的减少内生氧化剂没有失活。符合这一假说,Cominacini et al。24]表明zofenoprilat,但不是卡托普利,保护细胞内促炎的多向性的中介核因子κB对oxidant-induced激活和能够把谷胱甘肽从消费oxLDL引起的。同样,sulfhydrylic ace是已报告保护培养的内皮细胞免受nonsuperoxide和超氧化物自由基诱导的损害(11)和降低低密度脂蛋白氧化易感性在高血压患者25,26]。

然而,巯基的存在集团zofenoprilat分子并不完全解释我们的发现。事实上,其他含巯基ACE-I测试在我们的研究中,卡托普利,是温和但不显著比赖诺普利和依那普利在我们的测试更有效。这些数据同意先前的发现获得在白细胞和内皮细胞,证明卡托普利差回收新生成的过氧化物阴离子(27,28]。在这方面,比卡托普利zofenoprilat显示更高的亲油性,表明它可以起到更明显细胞内作用[18]。值得一提的在这方面,最近的证据,Soardo et al。29日)抑制效果展示zofenoprilat饮酒导致的ET-1生产的内皮细胞相比,卡维地洛,与已知的抗氧化活性[β肾上腺素能受体阻滞剂30.]。

总之,巯基包含ACE-I zofenoprilat,即活性药物的前体药物zofenopril [18),是更有效的比nonsulfhydryl包含ACE-I赖诺普利和卡托普利和包含一个卡托普利的巯基ET-1分泌减少养殖HUVECs和提高生物利用度。这些发现可能反映了不同抗氧化能力之间的四个ace是测试。因为增加ET-1生产和减少不深入参与动脉粥样硬化的病理生理学生物利用度(22ET-1],相互变化,没有生产的血管内皮细胞可能导致收益源于临床使用血管紧张素转换酶抑制剂(2]。巯基的存在赋予ACE抑制剂一些辅助属性,如更大的保护低密度脂蛋白氧化(26)和核转录因子κB激活(24),清除超氧化物阴离子(10和nonsuperoxide激进11),在这项研究中,更加明显对ET-1 /不平衡的有利影响血管内皮细胞。是否这些zofenoprilat内皮的影响可能导致观察到的心血管好处源于zofenopril治疗(31日)还有待阐明。

承认

作者感谢玛丽亚小姐为她的秘书援助希腊。