文摘

血管生成是一个重要的事件发展的过敏性炎症反应和组织重塑的病理生理学过敏性疾病。在目前的研究中,因此,我们研究了抗组胺药对血管生成的影响通过选择epinastine盐酸盐(EP)和小鼠肥大细胞在体外。肥大细胞( 与小鼠IgE特定细胞/毫升)presensitized卵白蛋白(OVA)与10 ng / mL刺激卵子在不同浓度的EP 4小时。血管生成因子的水平,keratinocyte-derived趋化因子(KC)、肿瘤坏死因子- (肿瘤坏死因子)和血管内皮生长因子(VEGF)在文化上层清液,通过ELISA检测。我们还研究了信使rna通过rt - pcr血管生成因子的表达式。EP显著地抑制生产KC,肿瘤坏死因子,VEGF诱导IgE-dependent机制超过25 ng / mL。使用rt - pcr半定量的分析表明,EP也显著降低mRNA表达KC,肿瘤坏死因子,VEGF。这些结果强烈表明,EP抑制血管生成因子生产通过信使rna表达的抑制肥大细胞和结果在变应性疾病的临床条件有利的修改。

1。介绍

变应性鼻炎(AR)是广泛接受的有症状的疾病引起的鼻粘膜的ige过敏性炎症,和鼻痒、喷嚏、鼻液溢水,和鼻塞,使通过鼻子呼吸困难(1]。这些临床症状也是众所周知的是由几个因素如组胺、前列腺素、和其他炎症介质(例如,炎性细胞因子)分泌激活炎症细胞包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T细胞在炎症的局部1]。除了这些经典的免疫反应,在鼻腔的高墙内结构变化也被报道在过敏性鼻炎患者。这些结构变化包括上皮破坏,粘液腺肥大,粘膜myofibroblast变换,并增加基质蛋白沉积(2,3]。这些细胞的变化现在被称为组织重构和两组蛋白质基质金属蛋白酶(MMPs)和他们的反调节抑制剂,TIMPs,被公认是组织重塑的重要因素[4]。

最近,有越来越多的证据表明,血管生成在炎症的发展中扮演一个重要的角色在组织重塑的病理生理学和过敏反应(2,5,6]。众多诱导的血管生成已确定的数字,包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子)和白介素8 (IL),和其他(6,7]。一些实验证据强烈表明,炎症,炎性细胞浸润和一些居民细胞是血管生成因素的生产商。人类中性粒细胞(8和淋巴细胞)9合成和秘密如VEGF和引发的血管生成因素。外周血嗜酸性粒细胞被发现时分泌的因素刺激granulocyte-macrophage集落刺激因子和IL-5体外(10]。细胞,成纤维细胞,居民也展示了丰富的血管生成因子(11]。在这些细胞中,肥大细胞和嗜酸性粒细胞一直强调在过敏性炎症效应细胞的血管生成(7,12]。尽管最近的研究主要集中在抗组胺药的能力,这是最重要的代理在变应性疾病的治疗,包括基于“增大化现实”技术,调节炎性细胞因子的释放从肥大细胞和嗜酸性粒细胞,几乎没有关于抗组胺药对血管生成的影响。因此,目前的研究进行检查盐酸epinastine (EP)的影响,在日本最著名的抗组胺剂,在keratinocyte-derived趋化因子(KC)、肿瘤坏死因子,VEGF是已知影响血管生成的主要因素(13以小鼠肥大细胞在IgE-dependent方式)。

2。材料和方法

2.1。老鼠

特定的无菌BALB / c雄性老鼠从查尔斯河购买日本公司(日本厚木)。

2.2。代理

EP是请日本捐赠的勃林格殷格翰集团有限公司(日本东京)作为一个纯粉不含防腐剂。这是溶解在rpmi - 1640中(SIGMA-ALDRICH Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%从GIBCO BRL热灭活胎牛血清(盖瑟斯堡,医学博士,美国;RPMI-FCS)的浓度为10毫克/毫升,消毒,通过0.2 m过滤器,然后用RPMI-FCS稀释在适当浓度的实验。

2.3。制备小鼠IgE

BALB / c小鼠腹腔内注射两次,间隔2周和光纯化学物质(5.0毫克的卵白蛋白kouichi卵子;日本大阪)吸收0.5毫克量0.5毫升的明矾。一周后,血液通过心脏穿刺和卵子特定的IgE纯化与KAPTIV-AE Tecnogen S.C.p.A。(意大利蒙特弗娜)根据制造商的指示。提取的蛋白质浓度溶液测定蛋白质化验设备从Bio-Rad实验室(美国加州大力神)和调整与RPMI-FCS 1.0毫克/毫升。

2.4。肥大细胞的制备

小鼠腹腔肥大细胞分离(如前所述)(13]。简单地说,老鼠与乙醚麻醉,exanguinated斩首。与腹腔冲洗10毫升的肝素化(10国际单位/毫升)钙和magnesium-free汉克的解决方案(哈佛商学院)。液体收集,离心机在150克15分钟4°c颗粒状细胞在哈佛商学院resuspended含有0.1%牛血清白蛋白和提交一个连续的等张Percoll梯度(72%)为肥大细胞隔离。纯化肥大细胞在RPMI-FCS resuspended。细胞纯度(> 96%)和可行性(> 98%)进行评估通过阿尔新蓝和台盼蓝排斥染色,分别。

2.5。肥大细胞的致敏和治疗

使肥大细胞的IgE, ,细胞被孵化500 ng / mL OVA-specific IgE 30分钟37°C、清洗和resuspended RPMI-FCS。敏化肥大细胞( 细胞/毫升)与10 ng / mL刺激卵子的4个小时中存在各种浓度的EP总量为2.0毫升。文化的上层清液离心后收集细胞悬液在150克15分钟4°C和储存在−40°C之前测定的因素。获得水溶性胞内内容,颗粒状细胞悬浮在2.0毫升有声的哈佛商学院被中断在一个冰冷的水洗澡5分钟和离心机在3000 g 4点30分钟°c .上层清液的获取和存储在−40°直到使用C。在检查mRNA表达的情况下,肥大细胞激活的IgE与卵巢刺激以类似的方式存储80−4小时°直到使用C。在所有的实验中,EP加入细胞培养开始前一个小时抗原刺激和细胞培养的一式三份。

2.6。试验的因素

KC、TNF和VEGF水平文化上层的化验使用商用鼠标ELISA检测盒(R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)根据制造商的建议。

2.7。实时聚合酶链反应

从肥大细胞信使rna提取使用 mac mRNA隔离包从Miltenyi研究GmbH (Bergisch格拉德巴赫、德国)根据制造商的指示。的第一链互补DNA合成从1.0(互补) 使用上标g mRNA进行前置放大系统GIBCO BRL的互补脱氧核糖核酸合成(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。PCR是使用GeneAmp 5700序列检测系统应用生物系统公司(美国加州福斯特城)。聚合酶链反应混合物由2.0 l(样本cDNA解决方案(10.0 ng / mL), 25.0 l (SYBR-Green Mastermix(应用生物系统公司),0.3 l感和反义引物,蒸馏水给最后一个体积为50.0 l。反应进行如下:4分钟95°C,紧随其后的是40周期15秒95°在60 C, 60秒°C。β肌动蛋白是放大作为内部控制。信使rna水平计算通过使用比较参数阈值周期(Ct)和规范化β肌动蛋白。寡核苷酸序列所使用的引物如下:KC [14), -GCGCCTATCGCCAATGAG - (意义)和 -AGGGCAACACCTTCAAGCTCT - (反义);VEGF [15), -CAGCTATTGCCGTCCGATTGAGA - (意义)和 -TGCTGGCTTTGGGAGGTTTGAT - (反义);肿瘤坏死因子(16), -CCTGTAGCCCACGTCGTAGC - 和 -TTGACCTCAGCGCTGAGTTG - ;为β肌动蛋白(16), -ACCCACACTTGTGCCCATCTA - (意义)和 -CGGAACCGCTCATTGCC - (反义)。

2.8。统计分析

数据的统计学意义分析了实验组和对照组之间的方差分析以及Fisher PLSD测试。 被认为是统计。

3所示。结果

3.1。抑制活性的EP在KC,肥大细胞肿瘤坏死因子,VEGF生产

第一组实验进行检查的影响EP KC, TNF和VEGF生产从肥大细胞体外诱导抗原刺激。肥大细胞( 细胞/毫升)敏化与卵巢是否刺激特定的IgE卵子的0,10、20、25、30、40 ng / mL EP为4小时。文化因素水平上层清液被ELISA化验。如数据所示1(一)和1 (b)、治疗与EP的细胞数量低于20 ng / mL没有造成压制KC和肿瘤坏死因子的释放,增加了抗原刺激。然而,EP显著抑制细胞的能力释放KC和肿瘤坏死因子抗原刺激后,当代理添加到细胞培养在25 ng / mL和更高(数字1(一)和1 (b))。图中的数据1 (c)也表明,抑制EP对VEGF的影响从肥大细胞释放抗原刺激引起的;治疗肥大细胞与EP超过30 ng / mL VEGF水平明显抑制抗原刺激引起的。然后我们检查由ELISA水溶性胞内提取的因子水平。如数据所示2(一个),2 (b),2 (c)肥大细胞、治疗与EP没有造成细胞因子释放的预防;因素的水平(KC、TNF和VEGF)提取物细胞治疗EP 40 ng / mL几乎相同(不重要)的刺激,但参与控制(卵+ IgE)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
抑制活性epinastine盐酸盐(EP)对血管生成因子生产IgE-dependent肥大细胞的机制。小鼠腹腔肥大细胞( 细胞/毫升)敏化与IgE特定卵白蛋白(OVA)与10 ng / mL刺激卵子在不同浓度的EP 4小时。血管生成因子的水平在文化通过ELISA上层清液进行了分析。数据被表示为一式三份的平均pg / mL±SE文化。KC: keratinocyte-derived趋化因子(a);肿瘤坏死因子:TNF -α(b);VEGF:血管内皮生长因子(c);* 与控制在0 ng / mL (EP)。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
盐酸epinastine (EP)对血管生成的影响因素从肥大细胞释放IgE-dependent机制。小鼠腹腔肥大细胞( 细胞/毫升)敏化与IgE特定卵白蛋白(OVA)与10 ng / mL卵巢刺激。4小时后,细胞被收集,有声的破坏,血管生成因素的水平cytosole被ELISA检测。数据表示为一式三份的平均pg / mL±SE文化。KC: keratinocyte-derived趋化因子(a);肿瘤坏死因子:TNF - (b);VEGF:血管内皮生长因子(c);* 与控制在0 ng / mL (EP)。
3.2。抑制EP KC的mRNA表达的影响,肿瘤坏死因子,VEGF

第二组实验进行检查的EP对KC mRNA表达的影响,肿瘤坏死因子,VEGF在卵巢刺激。肥大细胞( 细胞/毫升)敏化与卵巢是否刺激特定的IgE卵子的0,10、20、25、30、40 ng / mL EP为4小时。信使rna表达被半定量rt - pcr检测。如数据所示3(一个),3 (b),3 (c)、治疗与EP抑制肥大细胞信使rna表达的因素研究,增加卵巢刺激。代理的最低浓度,导致显著的抑制,是25到30 ng / mL。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
抑制活性epinastine hydrochrolide (EP)对血管生成因子mRNA表达ige肥大细胞的机制。小鼠腹腔肥大细胞( 细胞/毫升)敏化与IgE特定卵白蛋白(OVA)与10 ng / mL刺激卵巢4小时。信使rna表达血管生成因素被实时rt - pcr检测。数据表示为一式三份的平均±SE文化。KC: keratinocyte-derived趋化因子(a);肿瘤坏死因子:TNF -α(b);VEGF:血管内皮生长因子(c);* 与控制在0 ng / mL (EP)。

4所示。讨论

EP是一个选择性的和有效的 无抗胆碱能受体拮抗剂和镇静效果17,18]。我们先前的研究清楚地表明,EP会抑制胸腺和activation-regulated趋化因子(TARC)生产从人类外周血T细胞il - 4和costimulatory分子刺激引起的(19]。也观察到,EP能对抗反对IL-4-mediated T细胞体外细胞因子的不平衡(20.]。这些报告表明,EP对细胞因子和趋化因子的调制生产,负责过敏免疫反应的发展,包括部分代理的治疗作用方式的过敏性疾病。

气道壁的结构变化包括上皮细胞、黏膜下层,平滑肌,脉管系统被称为气道重塑,这主要是由几种类型的基质金属蛋白酶,在过敏性疾病,如哮喘和过敏性鼻炎4,21,22]。此外,有积累的证据表明,过敏炎症导致鼻墙,结构变化特点是血管生成和牙龈基底膜肥厚(2,3,23,24]。血管生成包括破坏基底膜的基质金属蛋白酶,内皮细胞的迁移和增殖,内皮细胞形成管和转换(25]。这个过程是由大量的诱导物,包括纤维母细胞生长因子家族的成员,VEGF,血管生成素、转化生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素和趋化因子(7,26]。其中,VEGF是最强有力的监管机构的血管生成,诱导增强扩散,迁移和管形成内皮细胞(7,26]。VEGF促进金属蛋白酶- 1的分泌趋化因子的表达,以及细胞粘附分子和E-selectin [7]。VEGF也引起血管舒张,负责水肿、炎性细胞浸润和鼻腔分泌物增加,通过诱导内皮一氧化氮合酶和一氧化氮后续增产7,26]。此外,VEGF刺激单核细胞趋化作用,有助于从骨髓内皮细胞在血管生成的招聘7]。加上目前的结果,显示出抑制EP VEGF生产活动可能被解释为意味着一些EP治疗效果的基于“增大化现实”技术取决于其抑制肥大细胞的VEGF的生产。除了VEGF,肿瘤坏死因子被认为是一个多功能的促炎细胞因子,起着核心作用在许多炎性疾病的启动和维护,包括哮喘和过敏性鼻炎。虽然TNF与Th1-dependent主要炎症有关,最近的报告显示,肿瘤坏死因子是必不可少的Th2型细胞因子的生产和渗透的Th2 T细胞过敏性炎症的网站(27]。TNF是由多种炎症细胞,特别是肥大细胞和巨噬细胞通过IgE-dependent机制以及增强的影响il - 4和il - 10对抗原IgE生产(27,28]。此外,肿瘤坏死因子mRNA的表达增加endothelial-leukocyte粘附molecule-1 (ELAM-1)和血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1),这是必不可少的嗜酸性粒细胞迁移到过敏性炎症的网站,在鼻黏膜在卵白蛋白致敏小鼠27),这表明抑制肥大细胞肿瘤坏死因子的生产通过IgE-dependent机制也可能部分占代理在变应性疾病的治疗机制。

KC(引发的小鼠相同器官),一名科学家亚科,是由几种类型的免疫细胞,包括上皮细胞、巨噬细胞,肥大细胞,淋巴细胞免疫和nonimmunological刺激后(29日]。尽管一些报告清楚地表明,存在大量的引发,对中性粒细胞和嗜酸性粒细胞,化学引诱物鼻灌洗液从过敏性鼻炎(30.- - - - - -32),粒细胞趋化因子的作用是有限的过敏性鼻炎的炎症网站渗透(29日]。另一方面,除了引发的人类微血管内皮细胞培养表面三维胶原gel-caused-tube-like结构形成(32]。anti-IL-8也报道称,政府为兔眼角膜显著抑制新血管的形成(血管)植入引起的乙烯醋酸乙烯酯颗粒含有肿瘤坏死因子(33),这表明引发TNF-mediated血管生成中起着至关重要的作用。从这些报道,EP KC生产的抑制作用IgE-dependent肥大细胞的机制也可能过敏疾病的治疗有重要影响。

尽管目前的结果清楚地表明EP的抑制作用proangiogenic因素的生产从肥大细胞通过信使rna表达的抑制抗原刺激,EP的精确机制可以从肥大细胞抑制proangiogenic因素的生产目前还不清楚。的主要刺激肥大细胞激活的聚合的高亲和力受体IgE所谓的足球俱乐部εRI (34]。的交联足球俱乐部εRI-bound iqe分子与特定过敏原激活receptor-associated酪氨酸激酶和进一步的磷酸化的启动下游分子如麦克米兰,phosphatidyl-inositol-3-OH-kinase和磷脂酶Cγ(34]。这些近端信号事件激活蛋白激酶C,最终启动肥大细胞效应等功能脱粒和细胞因子的生产34]。这些激酶的活化也报告要求 ,也就是增加了交联的IgE过敏原在肥大细胞表面(35]。据报道,EP超过 米可以抑制 涌入, 从细胞内钙释放储存的肥大细胞暴露于复合和P物质(48/8036,37]。从这些报告,强烈建议EP抑制的变化 cytosole浓度诱导抗原刺激,导致抑制肥大细胞的血管生成因子的生产。除了这些信号通路、转录因子NF -κB调节炎症基因产物的表达在许多不同的细胞谱系。肥大细胞、TNF的表达il - 6, Fc后引发基因ε国际扶轮结扎严格取决于NF -的激活κB (34,35]。NF -κB是一个无处不在的蛋白质转录因子和通常驻留在细胞质的非活动状态。然而,当激活它把原子核,结合DNA和激活基因。激活NF -κB是引起的退化和离解的我κ内源性抑制剂NF - BκB,通过 端依赖和独立的机制(20.]。加上目前的结果,也有可能EP抑制NF -κB通过Ca-independent机制激活并导致抑制肥大细胞的血管生成因子的生产。

药理研究表明,口服后的EP患者过敏疾病的单剂量20毫克,这个代理的血浆浓度逐渐增加,达到一个高原 ng / mL [38),这表明目前的体外研究的结果可能反映了EP体内的生物功能。

总之,目前的结果表明,EP对血管生成的抑制作用因素包括生产,部分治疗模式的行动代理的过敏性疾病,包括过敏性过敏和花粉病。

承认

本研究支持,在某种程度上,由日本勃林格殷格翰集团有限公司有限公司(日本东京)。