人甲状腺乳头状癌和未分化甲状腺癌中toll样受体、MyD88和TRIF的免疫组化分析

摘要

目的．我们假设先天免疫反应途径可能参与甲状腺癌的发生。为了研究这一假设，我们旨在分析先天免疫系统中几种受体和分子在甲状腺乳头状癌(PTC)和未分化甲状腺癌(ATC)组织中的表达。方法．手术切除的标本,11 ATC组织25 PTC组织和8结节性增生(NH)组织选择了toll样受体的表达(TLR) 2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9识别,骨髓分化主要响应基因88 (MyD88)和toll-interleukin-1受体domain-containing适配器诱导INF -β免疫组化(IHC)。结果．每个组织中有多个tlr表达。TLR3在所有组织中均有强烈表达。相比之下，在任何组织中均未检测到TLR4。TLR5在NH中表达，而在PTC和ATC中表达明显减少，TLR9在NH组织中缺失，而在PTC和ATC中均表达。在MyD88表达上，PTC与ATC无明显差异。与NH相比，PTC和ATC中TRIF显著上调。令人惊讶的是，PTC和ATC组织的TLRs、MyD88和TRIF表达模式相似。结论．这些数据表明先天免疫系统参与了PTC和ATC。特别是，在PTC和ATC中证实了tlr3介导的TRIF激活。这为甲状腺癌的发生提供了新的见解。

1.介绍

先天免疫反应始于模式识别受体(如toll样受体)对受损细胞释放的微生物成分或内源性分子的识别[1- - - - - -3.］．迄今为止，共鉴定出10个人类tlr和13个小鼠tlr [1- - - - - -3.］．tlr表达于各种免疫细胞，如树突状细胞(dendritic cells, DCs)和巨噬细胞，以及非免疫细胞，包括上皮细胞[1- - - - - -3.］．TLRs的信号转导主要通过两条下游途径进行:髓系分化初级反应基因88- (MyD88-)依赖和toll-白介素-1受体结构域连接诱导INF-β- (TRIF-)依赖途径。这些途径最终激活转录因子，如核因子kappa B (NF-κB)或干扰素调节因子3 (IRF3)，导致各种促炎细胞因子和I型干扰素(IFN)的产生[1- - - - - -3.］．目前公认的慢性炎症，如持续感染，可以促进癌变。具体来说，持续感染幽门螺杆菌、乙型或丙型肝炎病毒或人类乳头瘤病毒分别会增加胃癌、肝癌和宫颈癌的风险[4- - - - - -6］．最近的研究集中在tlr与不同类型的癌症之间的关系，如卵巢[7，8),食管(9，10)、肺(11- - - - - -13,胃14],乳腺癌[15),结肠(16，17和许多其他器官[18- - - - - -20.］．

甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌(PTC)，占所有甲状腺癌的近90%，预后良好;甲状腺间变癌(ATC)，仅占所有甲状腺癌的一小部分，生存率低[21，22］．虽然PTC的10年生存率为95%，但少数病例有侵袭性的复发和转移过程[22，23］．除了感染，甲状腺对辐射也很敏感，这可能导致甲状腺持续炎症。≤18岁的辐射暴露是甲状腺癌的强危险因素，风险随剂量线性增加[24，25］．最近的研究表明，TLR激动剂和拮抗剂可以减少辐射损伤，比传统的辐射防护药物更有保护作用，副作用更少[25- - - - - -30.］．因此，tlr是对抗电离辐射的候选辐射防护对象。

基于这些发现，我们假设tlr与辐射诱导的甲状腺癌变有关。在本研究中，我们通过免疫组化(IHC)分析TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、MyD88和TRIF的表达，以确定甲状腺癌是否与先天性免疫反应有关。此外，我们比较了这些先天免疫反应在PTC和ATC组织。

2.材料和方法

２.１.患者和组织样本

2001年至2019年，日本东洋大学森森医学中心外科手术采集了703例甲状腺组织标本，包括癌性和结节性增生(NH)。标本中11例经组织学诊断为ATC组织。为了避免任何偏倚，随机选择25个PTC组织，8个NH组织作为非癌对照。PTC中1例同时伴有桥本甲状腺炎。使用TMN分期系统对PTC样本进行分类[31]如下:第一阶段(n= 19)，第二阶段(n= 3)，阶段III (n= 2)，和阶段IVb (n= 1)。患者特征总结见表1．

２.２.免疫组织化学

一种基于聚合物的检测技术被用于防止甲状腺上皮内的内源性亲和素和生物素活性[32］．所有样品均经福尔马林固定和石蜡包埋。组织切片在二甲苯中脱链，然后用梯度乙醇系列复水。为了提取抗原，切片在pH 9 (Nichirei Biosciences, Inc.， Tokyo, Japan)的靶向提取液(TRS)中处理，98°C水浴40分钟。然后在室温下冷却玻片，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。接下来，切片用0.3% H处理₂O₂在甲醇中10分钟，PBS洗涤，然后在室温下与一抗孵育60分钟。切片在PBS中洗涤两次，并在室温下与辣根过氧化物酶标记聚合物溶液(Nichirei Biosciences, Inc.， Tokyo, Japan)孵育30分钟。抗原可视化采用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB;Dojindo实验室，熊本，日本)。最后，切片用苏木精复染，乙醇脱水，裱片。

２.３.抗体

特异性TLR2 (ab213676)、TLR3 (ab62566)和TRIF (ab13810)抗体来源于Abcam。TLR4 (HPA049174)、TLR5 (HPA015573)、TLR7 (HPA059613)和TLR9 (HPA004731)的特异性抗体来自Sigma-Aldrich。MyD88 (sc-136970)特异性抗体来自Santa Cruz Biotechnology。

２.４.数据评分方法

tlr的免疫组化表达由两位独立的病理学家按照先前描述的评分系统进行评分[10，11，14，15，33，34］．染色强度评分如下:0，无染色;1、弱染色;2、适度染色;3，强烈染色。如果两名病理学家的评分存在差异，则由第三名病理学家对组织评分以获得一致意见。染色比例评分为阳性细胞面积百分比(0-100%)。总体免疫组化评分是将强度评分乘以阳性染色百分数计算得出的，其值从0到300不等。

2．5．统计分析

统计分析采用Excel表格中的钟形曲线(Social Survey Research Information Co.， Ltd.)。日本东京)。采用Kruskal-Wallis和steel - dass测试比较组间免疫组化评分。值<0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

３.１.TLR在PTC、ATC和NH组织中的表达

NH中TLR2染色较弱，PTC和ATC组织中TLR2染色较弱(图)1(一)- - - - - -1 (f)）.

然而，只有PTC患者的IHC评分明显高于NH患者( ）(图1 (g)）.

NH、PTC和ATC组织在细胞质或部分细胞核中表现出强烈的TLR3染色(图)2(一个)- - - - - -2 (f)）.与ATC相比，PTC的IHC表达评分显著升高( ）(图2 (g)）.相比之下，除了基质中的单核细胞外，我们在NH、PTC或ATC组织中未观察到TLR4的表达(图)3(一个)- - - - - -3 (f)）.TLR5在NH组织的细胞质中中度表达，在细胞核中部分表达(图)4(一)- - - - - -4 (f)）.与NH相比，PTC和ATC的TLR5表达和IHC评分显著降低( 和 ，)(图4 (g)）.TLR7在NH中几乎检测不到，在PTC和ATC中表达相对较弱(图)5(一个)- - - - - -5 (f)）.然而，与NH相比，ATC的IHC评分显著上调( ）(图5 (g)）.PTC和ATC细胞质TLR9中度染色，NH未见(图)6(一)- - - - - -6 (f)）.与NH相比，PTC和ATC的IHC评分显著上调( 和 ，)(图6 (g)）.

３．２．下游tlr信号分子在PTC、ATC和NH组织中的表达

我们观察到胶质中有明显的棕色色素沉着，类似于甲状腺上皮上强烈的MyD88染色。而MyD88在NH中呈弱阳性，在PTC和ATC中呈中度阳性(图)7(一)- - - - - -7 (f)）.PTC患者的IHC评分明显高于NH患者( ）(图7 (g)）.同样，我们观察到NH中TRIF弱阳性，PTC和ATC中中度染色(图)8(一个)- - - - - -8 (f))， PTC和ATC的IHC评分明显高于NH ( 和 ，)(图8 (g)）.

4.讨论

在本研究中，我们发现TLRs在NH、PTC和ATC组织中有差异表达。此外，与非癌对照相比，TRIF在两种癌组织中均显著上调。这些结果表明先天免疫反应可能参与甲状腺癌的发生。

TLR9在PTC和ATC中表达均显著增加，但在NH中表达缺失。在PTC和ATC中也观察到TLR2和TLR7，尽管TLR7表达较低。相反，我们观察到TLR5在NH中适度表达，在PTC和ATC中下调。

与NH相比，MyD88在PTC中也显著上调。NH与ATC之间、PTC与ATC之间无显著差异。除TLR3外，所有tlr都启动myd88依赖的信号通路。虽然我们在这些癌组织中观察到几乎相同的TLR表达模式，但在PTC和ATC中，TLR对myd88依赖通路的贡献尚不清楚，在TLR信号转导和myd88依赖通路激活后，可能会出现更复杂的机制。

有趣的是，我们发现与NH相比，PTC和ATC中TRIF显著上调。TLR3在NH、PTC和ATC组织中表达强烈。相比之下，没有肿瘤组织表达TLR4。与我们的研究结果一致，以往的报道显示TLR3在人类正常甲状腺上皮、PTC组织和PTC细胞系中过表达[21，35］．由于TRIF依赖通路通过TLR3或TLR4被激活，PTC和ATC中TRIF的上调会导致TLR3的激活。

Takemura等[28证明小鼠全身照射特异性激活小肠隐窝上皮细胞TLR3，通过TRIF途径加重严重肠道损伤。此外，TlR3-/-小鼠对这种类型的损伤具有抗性。辐射是甲状腺癌的一大危险因素[24，25]，通过从受损细胞释放分子直接或间接刺激tlr。因此，辐射可能通过激活tlr导致甲状腺组织的慢性损伤，从而促进癌变。我们假设TLR3可能是辐射敏感性的候选传感器，导致了tri依赖通路的激活;然而，这一假设需要充分探索。

Harii等人[35]显示TLR3过表达自自身免疫性甲状腺疾病桥本甲状腺炎患者的人甲状腺细胞。虽然有几项研究调查了桥本氏甲状腺炎和甲状腺癌之间的联系，但结果仍然存在争议[36，37］．在我们的样本中，我们只发现了一例PTC患者桥本氏甲状腺炎，如“材料和方法”所述。因此，在本研究中我们无法确定自身免疫与甲状腺癌之间的关系。

除了病毒双链RNA (dsRNA)外，TLR3还可以识别细胞死亡时释放的自核酸[38］．IFN依赖途径的激活导致IFN调节因子-3 (IRF-3)的激活和几种炎症细胞因子和I型IFN的释放[1，2，39］．因此，阻断TLR3检测到的DAMPs(例如来自辐射损伤细胞的DAMPs)可能是比使用传统TLR3拮抗剂更具体的治疗方法，并可能抑制TRIF或IRF-3的激活或TRIF依赖的细胞因子和ifn的释放。

有些病例复发，可能危及生命。然而，由于缺乏侵袭性病例，本研究中绝大多数PTC病例处于早期(使用TMN分类76%为I期)。因此，我们预测PTC和ATC组织由于其不同的临床病理特征，会呈现不同的TLR表达模式。然而，TLR、TRIF和MyD88在两种癌组织中的表达相似。麦考尔等[21之前比较了PTC和ATC细胞株中TLR3和非标准Wnt5a的表达，发现非标准和非标准Wnt通路参与了PTC的形成。基于本研究，其他途径，如Wnt途径，可能有助于PTC转化为ATC。需要进一步的研究来研究这一独特的机制。

5.结论

部分tlr在PTC和ATC中表达。此外，与NH相比，在PTC和ATC中，下游两个主要TLR信号通路中必不可少的分子之一TRIF均上调。总之，我们的数据表明先天免疫反应可能有助于甲状腺肿瘤的发生。具体来说，我们的数据表明，TLR3激活了甲状腺癌中trif依赖的通路，这可能是辐射损伤的重要受体。

数据可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在文章和补充材料中。

伦理批准

这项研究符合机构和国家研究委员会的道德标准，并符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案以及类似的道德标准。本研究得到了日本东洋大学医学院伦理委员会的批准(A19052_A16067)。

同意

在征得患者同意后进行组织采集。

的利益冲突

作者声明他们在这篇文章的发表上没有利益冲突。

作者的贡献

KS构思了研究设计，并准备和编辑了手稿。MW、NT、FS、HO参与免疫组化分析。

致谢

作者感谢Tetsuo Nemoto教授(昭和大学北横滨医院，东京，日本)帮助免疫组化解释。作者还感谢Minoru Shinozaki和Naomi Tanabe在免疫染色方面出色的技术支持。

补充材料

图S-1-1 NH的HE和IHC图像，样本1。图S-1-2: NH的HE和IHC图像，样本2。图S-1-3: NH的HE和IHC图像，样本3。图S-1-4: NH的HE和IHC图像，样本4。图S-1-5: NH的HE和IHC图像，样本5。图S-1-6: NH的HE和IHC图像，样本6。图S-1-7: NH的HE和IHC图像，样本7。图S-1-8: NH的HE和IHC图像，样本8。图S-2-1: PTC的HE和IHC图像，样本1。图s -2: PTC的HE和IHC图像，样本2。 Figure S-2-3: HE and IHC images of PTC, sample 3. Figure S-2-4: HE and IHC images of PTC, sample 4. Figure S-2-5: HE and IHC images of PTC, sample 5. Figure S-2-6: HE and IHC images of PTC, sample 6. Figure S-2-7: HE and IHC images of PTC, sample 7. Figure S-2-8: HE and IHC images of PTC, sample 8. Figure S-2-9: HE and IHC images of PTC, sample 9. Figure S-2-10: HE and IHC images of PTC, sample 10. Figure S-2-11: HE and IHC images of PTC, sample 11. Figure S-2-12: HE and IHC images of PTC, sample 12. Figure S-2-13: HE and IHC images of PTC, sample 13. Figure S-2-14: HE and IHC images of PTC, sample 14. Figure S-2-15: HE and IHC images of PTC, sample 15. Figure S-2-16: HE and IHC images of PTC, sample 16. Figure S-2-17: HE and IHC images of PTC, sample 17. Figure S-2-18: HE and IHC images of PTC, sample 18. Figure S-2-19: HE and IHC images of PTC, sample 19. Figure S-2-20: HE and IHC images of PTC, sample 20. Figure S-2-21: HE and IHC images of PTC, sample 21. Figure S-2-22: HE and IHC images of PTC, sample 22. Figure S-2-23: HE and IHC images of PTC, sample 23. Figure S-2-24: HE and IHC images of PTC, sample 24. Figure S-2-25: HE and IHC images of PTC, sample 25. Figure S-3-1: HE and IHC images of ATC, sample 1. Figure S-3-2: HE and IHC images of ATC, sample 2. Figure S-3-3: HE and IHC images of ATC, sample 3. Figure S-3-4: HE and IHC images of ATC, sample 4. Figure S-3-5: HE and IHC images of ATC, sample 5. Figure S-3-6: HE and IHC images of ATC, sample 6. Figure S-3-7: HE and IHC images of ATC, sample 7. Figure S-3-8: HE and IHC images of ATC, sample 8. Figure S-3-9: HE and IHC images of ATC, sample 9. Figure S-3-10: HE and IHC images of ATC, sample 10. Figure S-3-11: HE and IHC images of ATC, sample 11.（补充材料）

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