登革病毒NS1蛋白作为诊断标志物：市售ELISA和比较，以定量RT-PCR和血清学诊断试验目前由佛罗里达的状态下使用

摘要

背景。正确管理感染登革病毒的患者需要早期发现。在这里，实时分子分析被证明是有用的，但有局限性，而ELISAs检测抗体仍然受到青睐，但结果获得太迟，没有临床价值。DENV NS1的产生在感染早期达到高峰，它的检测可以结合两种诊断方法的优点。方法。本研究比较了佛罗里达卫生部目前用于检测DENV感染的检测方法，包括抗DENV IgM和IgG ELISAs，以及qRT-PCR，和商品化的DENV NS1 ELISA。这些比较是在一组21人血清中进行的。结果。的14（64.3％）九DENV的qRT-PCR +样品也DENV NS1 +。有趣的是，为定量RT-PCR + 5个NS1-样品另外IgM-和IgG +暗示非主感染。相比的qRT-PCR中，NS1测定具有64.3％，特异性为100％的灵敏度，100％PPV，和58.3％的NPV。结论。NS1酶联免疫吸附试验在已知DENV qRT-PCR+样本中符合预期;然而，qRT-PCR+和IgG+血清NS1阴性结果似乎降低了NS1 ELISA对非原发病例的有效性。因此，DENV NS1 ELISA的诊断值得进一步研究。

1.介绍

造成登革热病毒感染继续构成对公众可在全球威胁，无论是在人力和经济成本。2017年，登革热病毒仍然是全球最显著节肢动物传播（arbo-）病毒性疾病之一的原因。根据世界卫生组织，目前的以3.9十亿风险的全球人口，其中估计有3.9亿感染每年发生。约96万受感染者寻求临床的高度重视，但大多数情况下没有报告。大约临床患者50万将发展成严重的疾病，需要住院与死亡的2.5％出现[1,2]。此外，75年后的情况下，登革病毒的本地传播在美国佛罗里达州记录。在2009-2012的时间段内，103土生土长的案件与广大在基韦斯特（门罗县）登革病毒1型（DENV1）的爆发有关的案件（27 2009年63 2010年）记载。然而，流行病学无关，本地收购的情况下也通过DENV1的2012年第二次爆发记录在布劳沃德，晓峰，迈阿密 - 戴德县，棕榈滩，奥西奥拉，马丁和塞米诺尔县2013年发生在马丁县[3.–5]。据认为，登革热在马丁县发生了两次，第一次发生在2011年的萨莱诺港附近，第二次发生在延森海滩附近，第二次导致了登革热的爆发。2016年，a case of DENV4（锥男，私人通讯。）在基韦斯特本地收购[6]和登革热本地再次在迈阿密 - 戴德期间寨卡病毒疫情调查[出现7]。

登革热是由黄病毒科四种不同血清型小RNA病毒DENV1-4引起的。DENV基因组的5 '和3 '端包含未翻译区域(UTRs)，开放阅读框首先编码三个结构蛋白，C、prM/M和env，其次是7个非结构蛋白，包括NS1蛋白。基因组被翻译成单个多蛋白，在翻译后进行加工和修饰[8]。NS1蛋白本身是从受感染的细胞分泌，并在该带的峰病毒血症（和RNA检测）重叠检测水平的血清中找到。这些NS1水平也与一致检测的IgM的发作急性原发性箱子和IgG在急性非主箱子[9]。已经发现，血清NS1水平升高直接指示增加的病毒负荷和进一步建立血症和NS1型材[之间的正相关性10,11]。NS1是黄病毒中普遍保守的蛋白，但在登革病毒中被发现含有交叉反应性和血清型特异性表位;在考虑开发免疫测定时，这些是重要的因素[12–14]。由于这些原因NS1被认为具有诊断价值作为感染的病毒标记物。蛋白质都发现胞内和在从感染的宿主细胞中分泌的可溶形式（SNS1），但其功能仍然是不清楚的。NS1的未成熟的形式是被糖基化的可变的单体，但容易形成通常与被感染细胞的表面相关联的热不稳定同二聚体[8,14]。From there, the major oligomeric form of sNS1 is thought to be a hexamer of around 300 kDa. The hexamer consists of 3 dimeric subunits that are noncovalently bound and are less stable than NS1 dimers [15,16]。

登革热在临床层面上是一种难以控制的疾病，这在很大程度上是由于一些患者出现严重疾病的晚期表现[17]。在过去，包括病毒分离和血清学测定(如ELISA和减少斑块中和测定(PRNT))在内的技术通常在临床解决(或发展为严重疾病)后产生结果，导致诊断对患者没有好处。然而，随着包括实时qRT-PCR等分子诊断分析在内的快速技术的出现，实验室的能力已经提高到可以在急性感染患者中获得当天的结果的水平[9]。如上所述，DENV的NS1蛋白也是一种有用的早期病毒感染标记，检测DENV的ELISA (Panbio®登革早期ELISA #E-DEN02P)目前可从Inverness Medical(现为Alere Inc.)和其他类似的免疫分析制造商获得。这些DENV NS1免疫测定可能代表了世界许多地区DENV诊断的新范式，在某种程度上，通过结合传统血清学测定和现代分子测定的优点。这包括与分子化验能力相称的早期诊断，加上设备和试剂成本的降低，以及在临床中执行它们所需的技术能力和严格程度的降低。本研究试图确定DENV NS1 ELISA详细切片的潜在价值2.3.在美国佛罗里达州诊断登革热

2.材料和方法

2.1。道德守则

这些以前收集的血清样品中去除标识符，因此本研究为不符合人类的研究活动定义的决心和美国45 CFR 46.101（4）根据从而免除IRB。这项裁决是由南佛罗里达IRB大学确定。

2.2。样本选择

一系列以前在公共卫生Laboratories-（BOPHL-）坦帕的健康 - （FLDOH-）局佛罗里达部登革病毒通过定量RT-PCR和两种抗登革病毒IgM和IgG ELISA在演唱会21个测定血清样品（20 /21）或IgM只（1/21）随后通过ELISA进行DENV NS1检测。阳性样品的对应DENV血清型通过qRT-PCR的还获得。的14的qRT-PCR +样品八阳性DENV1，五项DENV4 +，和一个为DENV2 +。没有被确定为DENV3 +是样本包括在这项研究。登革热的qRT-PCR的样品属于以下任一诊断类别：抗DENV的IgG +（）或样品阴性所有常规DENV诊断测定。无论从临床存档获得后者样品（)或血清调查()，在DENV1病毒暴发期间在佛罗里达州马丁县进行。DENV IgG和IgM ELISAs采用cdc -虫源病毒疾病分部(Ft. Collins, CO)提供的方案，基于taqman的DENV血清型特异性qRT-PCR采用cdc -登革分部(波多黎各圣胡安)提供的fda批准的方案进行。

2.3。登革病毒NS1 ELISA

使用Panbio登革热早期ELISA (Inverness Medical, Sinnamon Park, QLD, Australia， #E-DEN02P)确定个体血清样本中DENV NS1的存在。根据制造商的说明，每个样品都是一式两份，并针对我们的研究做了以下更改。(样品、阳性对照和阴性对照被重复地加到井中，校验器被重复地加到4倍，都在100μL. The ELISA sample plates were read at 450 nm with a reference filter of 620 nm. Each sample OD value (absorbance) was averaged between duplicate wells and then divided by the cut-off value to obtain index values.) Index values < 0.9 were ruled as negative, between 0.9 and 1.1 as equivocal, and values above 1.1 as positive for DENV NS1 detection. The results of this assay were then compared to those of DENV virus RNA detection via qRT-PCR as well as anti-DENV IgM and IgG ELISAs previously performed at the FLDOH-BOPHL-Tampa.

3.结果

在我们的研究中，登革病毒NS1 ELISA（表1和2)(详见补充资料中的图示摘要，网址为https://doi.org/10.1155/2017/8072491）发现有14血清9为正对DENV了也qRT-PCR的+和2 0，以前阳性的IgG只（9/16总DENV +样品）。五个样品的是在所有3个比较测定DENV-负，包括从马丁县血清学2个临床样品和3个，也通过负DENV NS1 ELISA。每个被发现是NS1 ELISA-所述DENV的qRT-PCR +样品也是阴性的IgM（5/14）。然而有趣的是，这些5的qRT-PCR +样品为阳性对IgG（和IgM-）通过ELISA，提示非主要感染。此外，每个在该研究中所表示的3个登革热血清型的这一亚组内被发现（3 5的样品DENV1，1 = DENV2，和1 = DENV4）。在另一方面，这是NS1 +一个样品呈现相同的轮廓（即，定量RT-PCR +，IgM-和IgG +）。所有七个定量RT-PCR的样品也为阴性登革病毒NS1。请注意的是测定之间所需的直接比较是那些能够早期检测（NS1 ELISA对的qRT-PCR）的之间进行。因此，虽然两个试验未能检测到在2个样品即只的IgG +中，“真阴性”样本的数目登革热（）静置进行计算，以免有利于定量RT-PCR的人为扭曲的净现值。在所有的和相比的qRT-PCR的结果的情况下，NS1测定发现具有64.3％（NPV）灵敏度，特异性为100％，阳性预测值为100％（PPV）和阴性预测值在这个小多样样本集（图形摘要和表58.3％3.）。

4.讨论

与这里发现的结果一样，之前关于商业性DENV NS1免疫测定的研究使用报告(如巴西的研究报告)[18]及马来西亚[19与标准诊断方法相比，显示了良好的结果。前者使用Platelia™登革NS1 Ag微板EIA (Bio-Rad, Hercules, CA)，后者使用SD Bioline登革Duo (Standard Diagnostics, Yongin-si, Republic of Korea)。这些组的结果灵敏度分别为95.9%和65.41%，特异性分别为81.1%和98.75%(因此，SD Bioline检测方法，一种多重检测方法，只考虑NS1)。2010年，Platelia™试验被批准用于筛查8万名波多黎各献血者。在FDA批准这项研究时，该测试已经在世界上大约40个国家使用[20]。在https://www.clinicaltrials.gov的USNIH指出，这项研究已经完成，但正式结果还有待报道21]。在利马等地[22，我们将之前提到的PanBio ELISA和Platelia™EIA与另一种免疫分析方法登革NS1条带(Bio-Rad, Hercules, CA)进行了比较。该条带是一种类似于前面提到的SD Bioline登革Duo的免疫层析测试。虽然所有的特异性都接近100%，但他们发现条带法的敏感性最高(89.6%)，其次是Platelia™EIA(83.6%)和Panbio ELISA(72.3%)。该组还报告说，这些测定法在检测DENV3病例时敏感性较低，而Platelia™测定法检测原发性病例的百分比在统计学上显著高于非原发性病例。

还应该指出的是,担忧的敏感性Platelia™环评出现在阿拉卡茹的一项研究中,巴西,其中58 119 NS1负样本而不是发现后被确认DENV4 +测试,和他们的推理指出一个问题与非基本情况下的检测(23]。如上所述，这也是在我们的研究，其中已知的qRT-PCR +所有5个NS1 ELISA-样品也的IgG +在ELISA似乎明显。However, a subsequent report published after obtaining the results reported here indicated that this drawback can be alleviated by preheating samples at 100°C for 5 m [24]。这表明，该分析可能需要分离抗原-抗体复合物和/或优先检测单体NS1而不是其二聚体形式。前者似乎很有可能，因为在非原发感染中，NS1与早期产生的IgG抗体结合会降低游离和可检测血清中该蛋白的水平。另一方面，他们的数据表明，通过加热，该方法优先检测两种登革热感染中的NS1单体[14]。这将是很重要的经验确定的是，加热步骤中所报告的上方产生抗原 - 抗体复合物和/或游离二聚体NS1的解离的解离成构成单体，并且这个步骤是用于在两种类型的感染的增加的敏感性是必不可少的。

也仍然关注，其中包括在这项研究中没有单次检测中独自一人足以诊断。其中2的7的qRT-PCR的样品被发现是DENV +仅通过IgG的检测，这是明显的。这反过来影响（DENV NS1 ELISA）下讨论的试验和在此使用的早期检测（QRT-PCR）的金标准之间的比较。王和Sekaran [19通过使用不仅能检测NS1而且能检测IgM和/或IgG的“一站式”快速测试，在很大程度上废除了与分析相关的问题。这反过来增加了他们联合检测的敏感性，同时鉴定出更多的阳性个体。这种和其他多方面的DENV诊断方法似乎是前进的正确方向，我们鼓励进一步的研究。

关于我们的研究中，我们接受更大规模的研究表征新试验时，通常包括阴性样品的更大的数字。在这里，虽然，这两种试剂和可供研究DENV +样本数量有限迫使我们接近从相反方向的研究。此外，作为一个更大的研究的一部分，这些样品也受到分析，如免疫分析[25和实验DENV NS1检测（杰森H. Ambrose等。，未发表的数据）进一步支持在这里使用的方法。尽管包括在小样本大小，但我们仍然断定测定检测DENV NS1最终应该进行登革热诊断方法，包括BOPHL-坦帕实验室的算法被并入。我们还建议，他们正在研究进一步的效用，尤其是结合不仅是其他潜在的诊断标志物，而且这些预测值，为了更好地向诊所的识别和管理好感染登革热的患者。

信息披露

所描述的内容仅由作者负责，并不代表CDC/USDHHS或SECEBT的观点。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Jason H. Ambrose进行了这个实验(除非上面注明“以前进行过”)，分析了数据，准备了手稿。Azliyati Azizan、Shamala Devi Sekaran和Jason H. Ambrose参与了本研究的设计。Azliyati Azizan构思了这项研究。Azliyati Azizan和Shamala Devi Sekaran审阅了数据，提供了数据反馈，并编辑了手稿。所有作者都审核并批准了最终的稿件。

致谢

作者要感谢在FLDOH-BOPHL坦帕员工的贡献，包括，但不限于，样本取回，致盲和随机化，并在随机化之前，可用样品类型提供信息，特别是有关他们以前的诊断工作研究样本。他们也想在研究的过程中，要特别感谢莉莲M.斯塔克博士在她的指导。本出版物中详述的研究是由CDC / USDHHS和东南中心新兴生物威胁（SECEBT），埃默里大学（亚特兰大，GA，USA）的资助，没有通过格兰特/合作协议共同支持资助。U38 / CCU423095。

补充材料

参考

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