文摘
90天的反复给药的口服毒性进行了评价根据GLP methylurate嘌呤生物碱theacrine和经合组织指导方针,这是某些植物中天然。Hsd.Brl四组。汉Wistar鼠(10 /性/组)被填喂法管理theacrine剂量的0(车辆)、180、300和375毫克/公斤体重/天。两个女人和一个男性在300和375毫克/公斤体重/天组,分别在研究过程中就去世了。组织学检查发现小叶中心的肝细胞坏死的可能的死因。男性在375毫克/公斤体重/天,轻微的减少体重的发展,食品消费,和饲料效率,减少体重的睾丸和附睾和睾丸精子发生强度降低,缺乏或减少数量的精子在附睾成熟,和减少前列腺分泌物量检测的最后三个月。在300毫克/公斤体重/天,轻微的减少重量的睾丸和附睾,连同睾丸精子发生,强度下降,缺乏或减少数量的精子在附睾成熟雄性动物中发现。的,科学被认为是180毫克/公斤体重/天,在这一剂量没有在雄性或雌性动物毒物学地相关治疗相关的发现。
1。介绍
Theacrine (1、3、7、9-tetramethyluric酸)是一种methylurate,嘌呤生物碱类的相似结构等methylxanthines咖啡因。Theacrine经常发现甲基化和氧化代谢物methylxanthine-producing咖啡因的植物(1]。这两个著名theacrine-containing食品在人类饮食的果实和种子Theobroma羊藿(cupuacu)和供养人绿茶的叶子山茶花供养人(山茶花assamicavar。供养人)[2- - - - - -8]。供养人茶叶历来是消耗在某些地区的中国茶和“健康饮料”(9- - - - - -11]。扩大芽和嫩叶的theacrine内容供养人的报告为~ 2.8%的干重和成熟叶的内容~ 1.3% (2,3,11]。从供养人的估计可能接触theacrine茶,如果有人认为使用2 - 3克的茶每杯theacrine含量2.8%,一杯茶将包含大约56 - 84毫克的theacrine(相当于0.8 - -1.2毫克/公斤体重70公斤的人)。放射性标记实验表明,theacrine合成咖啡因在某些植物包括供养人(2,4]。水平theacrine cupuacu植物地区没有特征在文学。
只有有限的研究,主要是在细胞和动物,可以突出显示任何潜在影响theacrine可能被人类摄入。初步的数据从一个七天的费多契亚等来自于口腔反复给药研究。12)表明,在老鼠theacrine运动活动增加,而一个年长的研究显示一个潜在的两相的剂量反应曲线对其影响小鼠的活动(13]。从力学上看,theacrine似乎腺苷受体拮抗剂活动(12]。其他报告凸显了theacrine产生多巴胺能的潜力和其他神经活动建议摄入量有关抗炎,抗疲劳,镇痛,和情绪增强生物活性,虽然在人类缺乏研究[14- - - - - -16]。
Theacrine王亚南展出效果在一个压力诱导肝损伤小鼠模型以及体外和体内抗氧化能力强3,17]。通常反对影响咖啡因(18,19),费多契亚等人表明,来自于腹腔内注射48毫克/公斤theacrine并未引起过敏或公差七天期间的生理效应的研究12]。
一些研究的安全theacrine全面文献检索中被发现。短暂的小鼠急性毒性研究的结果发表在作者计算了LD50的口头管理theacrine 810.6毫克/公斤bw(95%置信区间769.5 - -858.0毫克/公斤体重)(14]。据报道,类似于其他嘌呤生物碱,theacrine洋葱根尖诱导染色体畸变,蚕豆根尖在G2期细胞治疗间期和中国仓鼠细胞(20.,21]。然而,没有发现基因毒性的体内小鼠微核研究theacrine浓度高达325毫克/公斤(22]。
在对比结果中观察到的使用c . sinensis(31 g / kg咖啡因和0 g / kg theacrine),胃内的theacrine-containing茶包括水提取管理c . assamicavar。供养人(3克/公斤咖啡因和22克/公斤theacrine)并没有导致血压和心率增加在自发性高血压大鼠(10]。当老鼠有30毫克/公斤咖啡因、可可碱、或theacrine,只有咖啡因治疗对心血管参数有显著的影响(10]。
在人类研究的60名健康男性和女性,theacrine了每日(200或300毫克)8周(23,24]。两个剂量相当于2.6和3.8毫克/公斤体重/天,分别为78公斤的人(男性和女性受试者的平均体重的研究)。主要成果包括禁食临床安全标记(心率、血压、血脂和血液和肝/肾/免疫功能生物标记),所有这一切落在正常范围内没有集团×时间交互和没有副作用的差异配置文件比控制。Theacrine也给15名健康受试者在随机双盲交叉研究(25,26]。单一剂量200毫克(或安慰剂)管理,和副作用报告,血流动力学,和生化标记物的安全收集在一个3小时的postdosing时期,没有重大的发现指出。另外六个科目参加了一个单独的7天开放比较100年反复给药的研究,200年,和400毫克theacrine,没有副作用指出[25,26]。
做进一步调查的安全口服theacrine消费,我们报告的结果在当前工作90天的纯种老鼠口服subchronic反复给药毒性研究。
2。材料和方法
90天的研究根据经合组织GLP (ENV / MC /化学(98)17;经合组织,巴黎,1998年)和符合经合组织408年(采用1998年9月21日;90天的研究)27),2000年美国食品药品管理局红皮书,IV.C.4。(2003;90天的研究)指南28]。动物保健和使用的研究是符合实验室动物保健和使用委员会制度,国家研究委员会指导护理和使用实验动物(29日,2011年匈牙利法的原则CLVIII(修改1998年匈牙利法第二十八章)调节动物保护。
合成1、3、7日9-tetramethyluric酸(CAS号2309-49-1;≥98%的纯以高效液相色谱法(HPLC),质子核磁共振和液相色谱-光谱法方法)提供品牌产品TeaCrine®作为试验件的制造商(复合解决方案公司,卡尔斯巴德,CA)。TeaCrine是商用白色结晶粉末。本产品是由24个月的稳定性研究°C和%相对湿度条件下的商业包装和复合保持稳定在整个测试周期(数据未显示)。批号48-KY20141102,这符合所有商业规范的产品(包括纯度≥98%,干燥失重≤1%,炽灼残渣≤0.5%,和商业限制重金属和微生物计数)是研究利用两年保质期内日期。这批的具体纯度水平(每高效液相色谱分析)为99.5%。
theacrine利用剂量水平的研究375,300和180毫克/公斤体重/天。这些剂量选择基于出版14天反复给药的口服毒性研究Wistar鼠,利用十动物每组(五大鼠/性/组)。最高剂量组500毫克/公斤体重/天导致的死亡率3的5 5 5雄性和雌性在所有动物和震动;另外一个雄性动物死在400毫克/公斤体重/天。剩余动物在400、350和200毫克/公斤体重/天组幸存下来没有毒性的迹象,和14天的,科学研究是确定为350毫克/公斤体重/天。基于这项研究的结果和408年经合组织指导方针指出最高剂量水平应该选择,目的是诱导毒性但不是死亡或严重的痛苦,90天的高剂量研究被选为375毫克/公斤体重/天。指南建议下行剂量序列旨在展示任何剂量反应和科学在最低的剂量水平。虽然指南,双重的四倍间隔通常是最佳设置下行剂量水平,在这种情况下更小的间隔在狭窄的剂量范围,利用由于不良事件出现在14天研究,目的是检测可能的最高的科学(一个更广泛的间隔可能漏掉的)允许评估安全边际的剂量用于人类研究,如200 - 300毫克/天的剂量(2.6 - -3.8毫克/公斤体重/天78公斤人类)用于研究泰勒et al。24),并没有导致不良事件或发现在临床安全标记。
测试条剂量被暂停theacrine准备1%水甲基纤维素浓度达到18日30日和37.5毫克/毫升为了提供一个常数剂量体积10毫升/公斤。剂量被仔细准备每日体重测量和管理四个小时。对照组只收到同样体积的1%甲基纤维素车辆。
男性和女性的SPF Hsd.Brl。汉Wistar鼠(Toxi-Coop,布达佩斯,匈牙利)分别被安置,在19-25 12小时的光暗周期°C和30 - 70%的相对湿度,在II型聚丙烯/聚碳酸酯笼子Lignocel®认证实验室木头床上用品。笼子里是22厘米(宽)32厘米(长度)19厘米(高度),每周和笼子和床上用品都改变了。动物收到ssniff®SM R / M-Z + H成套饮食大鼠和小鼠和饮用自来水随意。动物适应了前七天剂量的开始。
在实验期间,动物是大约7周大,体重206 - 233克(男性)和131 - 151 g(女性)。分层八十雄性和雌性大鼠体重和随机分配到四个剂量组包含10大鼠/性/组。Theacrine是每天早上由填喂法每日剂量的0(车辆控制),180,300,或375毫克/公斤体重/天。
动物被观察到每天两次的发病率和死亡率。一般cage-side观察临床症状进行了两次在适应期内,一旦每日剂量期间,每天大约在同一时间,管理测试后的文章。详细的临床观察每周进行一次,和一个功能观察电池(FOB)在最后一周进行评估等参数一般身体状况和行为,应对处理,感觉对不同刺激的反应,握力,和运动活动30.]。测量体重在适应期间进行了两次,第一天实验前治疗,每周两次在1 - 4周,每周在第5 - 13周,牺牲前,立即。食物摄入量决心和食品效率每周计算一次。进行眼科检查所有的动物实验时间和之前的研究终止前控制和高剂量组动物。
一夜后快速(约16小时)后的最终管理测试文章,收集的三个血液样本retroorbital下静脉丛Isofluran CP®(CP-Pharma Handelsgesellschaft GmbH,德国)麻醉(0.25毫升tripotassium乙二胺四乙酸为血液学测量管,1.0毫升的柠檬酸钠管凝血测量,在血清和2.5毫升分离器管临床化学测量)后的动物安乐死从腹主动脉放血。血样分析血液(红细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB),红细胞(RBC)、白细胞(WBC),白细胞微分(中性粒细胞(NEU),淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)和嗜碱粒细胞(贝索))、血小板(PLT),意思是血细胞比容(MCV),意思是微粒血红蛋白(妇幼保健),意思是微粒血红蛋白浓度(MCHC)和网织红细胞(RET)],凝血(局部血栓形成质激活时间,凝血酶原时间)和临床化学[钠(Na+),钾(K+)、葡萄糖(GLUC)、胆固醇、尿素浓度,肌酐(克雷亚)、总蛋白(TPROT)、白蛋白(铝青铜)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷酰基转移酶(GGT)、总胆红素(治疗组)、白蛋白/球蛋白比例、胆汁酸、钙(Ca+ +)、氯(Cl−)和无机磷酸盐(π)]参数。总值病理检查和决定的选择绝对器官重量(肝脏、肾脏、肾上腺、睾丸、附睾、胸腺、脾、脑、心脏、子宫和输卵管、卵巢、甲状腺和甲状旁腺)完成和相对器官重量(相对于身体和大脑重量)计算。进行了完整的组织病理学检查保存器官和组织(肾上腺、主动脉、股骨的骨髓,脑(大脑、小脑脑桥和延髓),眼睛,女性乳腺、性腺(睾丸与附睾和卵巢),心脏,肾脏,大型肠、肝、肺、颌下和肠系膜淋巴结,股四头肌肌肉,食道、鼻鼻甲骨,胰腺,垂体,前列腺,颌下唾液腺,坐骨神经,精囊,皮肤、小肠,脊髓在三个层次,脾脏,胸骨,胃、胸腺、甲状腺和甲状旁腺,气管和膀胱、子宫和阴道)所有动物的控制和高剂量组。肾上腺、睾丸和附睾也处理和检查组织学上所有的动物的低收入和mid-dose组的基础上宏观观察尸体剖检(苍白的肾上腺和小于正常睾丸和附睾)。
使用SPSS统计分析进行了PC +软件SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。Bartlett的方差的同质性测试是用来评估异质性群体之间的差异,其次是单向方差分析(方差分析)如果没有检测到显著的异质性。邓肯的多个范围测试是用来评估的意义群际差异如果积极的方差分析结果。Bartlett的测试发现显著的异质性,Kolmogorov-Smirnov测试进行检验正态分布数据,和克鲁斯卡尔-沃利斯非参数单向方差分析,其次是Mann-Whitney吗U测试组间的比较积极的结果,使用的非正态的分布。一个值< 0.05被认为是统计学意义,统计上显著的结果报道和的水平。
3所示。结果与讨论
一只公在375毫克/公斤体重/天,两个女性在300毫克/公斤体重/天被发现死在天42岁,33岁和67年,分别。没有临床症状之前死去的男性和女性死者之一。另一个女性表现出减少活动在去世的前一天。死去的动物的尸体剖检观察显示深红色肝(所有)和肺(男一女),小于正常的睾丸(男性),凝结的血液在心脏附近的胸腔(男性),青紫的皮肤和皮下结缔组织的下部腹部(男性),空着肚子(雌性)和肠(女)、hydrometra(女),和肾上腺肿大(女)(表1)。在组织病理学检查小叶中心的肝细胞坏死是指出在所有三个动物(数字1和2)。化学诱导肝损伤会导致脂沉积症、坏死、纤维化和细胞器扩散,增生的胆管、肝细胞和肿瘤31日]。肝细胞坏死可能在衰老和幸存的未经处理的动物以及那些暴露在有毒化学物质。坏死可能凝结物的性质和特点是同质的嗜酸性粒细胞和细胞细节的损失。化学诱导坏死通常是带状,最频繁小叶或门静脉周的。因此,本文测试被认为是最有可能造成了小叶中心的坏死中看到这些动物,它被认为是可能的死因。
(一)
(b)
(一)
(b)
轻微的焦肺泡肺和肝的肺气肿和拥堵在三个死去的动物还指出,随着宏观变化肺、肝、心脏和青紫的皮肤和皮下结缔组织,被认为是由于循环发生障碍发达在痛苦和/或死亡。此外,减少数量的精子在附睾精子发生和减少强度(定义为tubuli包含成熟精子的比例)在观察睾丸男性(表2)。
在幸存的动物,每日cage-side和每周详细的临床观察和交货并没有发现毒理学地相关的结果。降低身体体重中检测出雄性和雌性动物在300和375毫克/公斤体重/天的雄性动物组织和180毫克/公斤体重/天集团天0和3之间(表3)。雄性动物的身体体重在300和375毫克/公斤体重/天组织导致较低的平均体重从每天3 - 89(表4)和低意味着全身体重控制。然而,这意味着身体体重减少天0到3完全补偿的雄性动物180毫克/公斤体重/天组和两女组(300和375毫克/公斤体重/天)的过程中总结的治疗期导致没有区别意味着身体体重增加在这些团体。
第一周期间,食品消费略下降相比,控制治疗的男性和女性各剂量组动物,也发生在雄性动物在300和375毫克/公斤体重/天在其他周(表5)。按照体重和食品消费的变化,在雄性动物饲料效率是降低了300和375毫克/公斤体重/天剂量水平在第1周和瞬变之后(表6)。
没有观察到眼科异常控制和375毫克/公斤体重/天的剂量组开始之前或结束的时候治疗期(数据没有显示)。统计上显著差异的治疗和控制被发现在一些血液和在雄性和雌性动物和临床化学参数如表所示7和8,分别。在统计上有显著差异的MCHC和RET值比控制在雄性和雌性雄性和红细胞值没有明显存在剂量依赖的相关性,历史的控制范围之内,因此不被认为是毒理学地相关。EOS值出现在男女双方历史范围内减少剂量依赖性;然而,这个值的减少并不是通常被认为是生物相关。MCV和妇幼保健水平的显著差异是轻微的和值仍在历史控制范围在180毫克/公斤体重/天组(或边际历史控制范围内的中期和高剂量组)。相关血液参数如血红蛋白和HCT没有不同控件,并没有指出血液相关器官病理。因此,研究结果不被认为是毒理学地不利。
轻微但显著增加观察肝脏ALT和AST酶活性在300 (ALT)和375 (ALT和AST)毫克/公斤体重/天。同样,意味着男性对待动物的克雷亚浓度略有升高。这些轻微,显然存在剂量依赖的相关性变化可能表明一个测试条影响肝和肾功能;然而,没有相关的组织病理学变化,这些动物的肾脏或肝脏来证明他们的相关性,和所有的值保持在历史正常范围。
有趣的是,在老鼠的低剂量,theacrine(30毫克/公斤体重/天七天)据报道,防止增加ALT和AST水平约束引起的压力(17]。然而,在最近出版的90天的另一项研究,Crl:雄性sd鼠CD IGS中给予150毫克/公斤体重/天结构类似的化合物,咖啡因,也显示增加AST、ALT和克雷亚,在历史的控制范围(32]。显著差异在AST和ALT国家毒理学规划处的一项研究报告244年费舍尔老鼠在咖啡因剂量287毫克/公斤体重/天;但是,没有剂量相关性模式建立了(33]。轻微但显著增加在AST和ALT也被报道在人类消费的咖啡(34],虽然咖啡/咖啡因的摄入也一直与保护作用对肝酶的增加(例如,ALT)和肝保护(35- - - - - -37]。咖啡因(和可能theacrine)是在肝脏代谢33,38),因此高剂量理论上可以影响这个器官由于长期的高曝光率。
其他在统计上有显著差异的临床化学值在各剂量组轻微和被认为是很少或没有的生物或毒性的相关性。例如,在统计上有显著差异的治疗组和K+,比控制,只发生在一个性别,不存在剂量依赖的相关性,并仍在历史控制范围。GLUC和Na+值出现显著减少统计,在两性暗示可能存在剂量依赖的相关性测试条的效果,虽然仍在历史所有值控制范围。Cl的差异−和π没有显示明显的剂量反应关系。
值得注意的是关于宏观结果(表1),小于正常睾丸(4/10和9/9)和附睾(4/10和9/9)观察到男性的300和375毫克/公斤体重/天组,分别。三种动物在375毫克/公斤体重/天集团也小于正常的前列腺。苍白的肾上腺雄性动物中观察到在300毫克/公斤体重/天(2/10)在雄性和雌性动物和375毫克/公斤体重/天(7/9和4/10,职责)。其他一些小的验尸结果见表1(例如,白色表面形成肾脏紧凑,疤痕,和脱发在几组)被认为是个体发现在未经处理的雄性动物,因为他们是常见的观察实验大鼠的应变和年龄。
减少器官重量控制相比,观察在雄性动物睾丸的300(绝对和相对于大脑重量)和375(绝对和相对于身体和大脑重量)毫克/公斤体重/天组和附睾的300年和375年(绝对和相对于身体和大脑重量)毫克/公斤体重/天。增加了肾上腺重量控制相比,指出男性375(绝对和相对于身体和大脑重量)和300毫克/公斤体重/天(仅相对于体重)。减少胸腺重量(绝对和相对于身体和大脑重量)被发现在300和375毫克/公斤体重/天在雄性和雌性动物(表9- - - - - -11)。在统计上有显著差异的雄性动物的某些器官的重量(心脏和肾脏)相对于体重出现体重变化的部分或全部这些组织和器官未见脑重量比率。差异在某些器官重量(绝对或相对)仅观察低剂量组而不是高剂量组(肝脏、甲状腺和子宫),因此,并不被认为是治疗相关。
在幸存的动物,组织学检查(表2)显示强度降低精子发生在精tubuli所有雄性动物在375毫克/公斤体重/天,一半的雄性动物在300毫克/公斤体重/天比控制。在所有动物睾丸发现,巨大的精细胞tubuli指出。缺乏成熟的精子在附睾的ductuli在300毫克/公斤体重/天(2/10和8/9 375毫克/公斤体重/天中度或严重程度)和减少数量的成熟精子在300毫克/公斤体重/天(1/10和1/9在最小的375毫克/公斤体重/天或轻微程度)在雄性动物。睾丸和附睾的改变伴随着炎症、变性或坏死。的数量和细胞形态学间隙控制雄性动物睾丸细胞一样。数量减少的tubuli分泌的前列腺在三个雄性动物在375毫克/公斤体重/天。剩余的雄性动物的300毫克/公斤体重/天组(5/10)和所有的动物的180毫克/公斤体重/天,对照组,各种精子发生的细胞(spermatogonia,精母细胞、精子和精子)代表不同阶段的发展和分化spermatozoons-and间质细胞出现正常。类似的效果已报告在老鼠食用高嘌呤生物碱的可可碱和咖啡因,即萎缩睾丸和附睾精子发生的细胞变性,尽管这发生的机制是未知的39,40]。然而在人类研究中,咖啡因摄入量还没有与相关不利影响精液质量,和肥力水平,总的来说,不是一直与咖啡因摄入量(41]。
没有其他治疗相关的发现在显微镜检查所选的组织。发现不被认为是毒理学地有关发生在一些动物;例如,轻微的焦肺泡肺气肿肺中可观察到的在控制和高剂量组雄性和雌性动物发病率相似。这一发现与缺氧、呼吸困难和循环障碍,发生在放血和被认为是与测试无关的文章管理42]。此外淋巴组织增生(BALT)也观察到在控制和高剂量组(对照组)的发生率较高。这是一个生理,immunomorphological现象43,44),不被认为是毒理学地相关。膨胀的子宫角发生在雌性动物控制和高剂量组;这被认为是一个轻微的神经激素的现象与发情阶段的内生殖器官,而不是毒物学地相关(45]。
没有组织病理学研究结果指出肾上腺腺体或胸腺。因此苍白的肾上腺和肾上腺、胸腺器官重量的差异被认为是可能的适应过程(器官的反应环境变化为了保持函数/生存)或应激反应和毒理学意义被认为是模棱两可的可可碱和咖啡因的摄入也发现了大鼠(32,39,46,47]。
4所示。结论
总之,300毫克的剂量(3.8毫克/公斤体重/天78公斤人类)给健康的男性和女性在之前的临床研究没有产生任何不利影响或潜在的毒理学研究结果在许多临床安全标记(24]。在当下GLP和经合组织408年Wistar鼠兼容的毒理学研究,theacrine消费与死亡率在300毫克/公斤体重/天的两个十雌性,在375毫克/公斤体重/天的十个男性,与小叶中心的肝细胞坏死认为死亡的可能原因。男性在375毫克/公斤体重/天集团也减少身体体重增加,食品消费和饲料效率,并减少重量的睾丸和附睾精子发生强度降低,成熟的精子,前列腺分泌物。男性的300毫克/公斤体重/天同样降低了重量的睾丸和附睾精子发生强度降低和成熟的精子数量。基于观察在这90天的反复给药毒性强饲法研究和缺乏相关毒理学地发现低剂量组,theacrine的科学被认为是180毫克/公斤体重/天在雄性和雌性Wistar鼠。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢以下工作:参与调查人员的贡献维多利亚Balogh, Erzsebet Biczo, Ibolya Bogdan,莫妮卡Csatari,赈灾发言人Timea Csorge Ildiko赫尔曼,,Isvanne阅读Zoltan Jakab美妙Fritz Kovacsne维多利亚Matina, Agota乔Schullerne, Janos斯塔尔,比阿特丽克斯Szilagyi Sumegine,伊娃。萨博,费伦茨。萨博,编辑Szam Zsuzsanna萨博Judit Szilak, Marta Tenk Zsuzsanna Vuleta和Levente Zoltan实验任务的性能和/或数据集合和Jared Brodin周全在论文的准备和行政支持。作者披露,提供的金融支持为所述研究复合解决方案公司(CA)卡尔斯巴德。