在体外筛选干扰雄激素信号的化学物质的报告试验

摘要

内分泌干扰性化学物质(EDCs)调节激素信号并引起发育和生殖异常。今天，全世界都在关注内分泌干扰的影响，特别是雄激素受体(AR)介导的影响。雄激素或雄性激素对男性特征的发育和维持至关重要，环境中存在大量的EDCs，有可能破坏雄激素的作用。在对这些化合物敏感性增加的关键发育窗口期，这种威胁更大。及时筛查和检测EDCs对于尽量减少这些有毒化学品产生的有害影响至关重要。作为第一道筛选，体外由于其速度，方便，成本效益，转录测定非常有用。在本文中，最近体外已经综述了检测EDCS的雄激素或抗刺激活性的记者测定。已经讨论了用于此目的的两个重要的细胞系统，即哺乳动物或酵母细胞系统。报告基因如细菌荧光素酶（LUX）和绿色荧光蛋白（GFP）的使用具有显着提高的速度和敏感性。此外，许多当前的报告器测定系统可以以高吞吐量格式使用，允许以较低的价格迅速评估多个潜在EDC。

1.介绍

EDCs是干扰生物合成、代谢或内源性激素作用的化学物质，导致偏离正常的发育规划和生殖功能[1］.男性性分化完全依赖于雄激素依赖性，因此高易于扰乱雄激素作用的EDC。雌激素如睾酮及其代谢物5-α-dihydrotestorone（DHT）通过作为配体诱导的转录因子的AR发挥其效果。雄激素结合使细胞溶质AR转化为核，与雄激素响应基因的靶区域结合，并影响其转录[2］.另一方面，抗雄激素可能与AR结合，但不促进核易位或基因转录[3.］.最近的调查结果表明，少数少数天然产品，如豆类，大豆，亚麻，山药和工业化学品，如农药和杀菌剂，影响雄激素和雌激素受体的活性[4.］.这些EDCs可能对男性生殖健康和雄激素作用产生深远的影响，包括精子质量下降、隐睾丸症和尿道下裂病例增加、性别比例改变和睾丸发育不良综合征[5.］.目前已知的化学物质干扰雄激素信号通路包括二羧酰亚胺杀菌剂，例如vinclozolin，基于有机氯基杀虫剂，如p，p'-ddt和p，p'-dde，番茄胺杀菌剂，例如普罗基，邻苯二甲酸盐和尿素的除草剂如林蛙[5.］.只有通过彻底筛查和早期发现它们的危险性质，才能将这些化学品和其他化学品所引起的毒性降至最低。EDC积累的危害是由研究首次揭示的，这些研究显示了Duluth-Superior港鱼类性生活的变化[6.］.废水中的化学品在鱼肝中积聚，还会改变鸡蛋生产的女性鱼类和男性鱼类的交配行为。在纸浆和造纸厂附近的河流中检测到男性化的女性蚊虫[7.］.世界上发达国家和发展中国家都观察到鱼类的特征变化[8.那9.］.

为防止EDC诱导的毒性，许多国家已经阐述了及时检测此类化学品的准则。表中提供了来自涉及监测和控制EDC曝光的不同国家的监管机构名单1。

通常，进行两级屏幕，是第1层筛选（T1S），以充当“栅极保持器”和一级研究（T2S）在活的有机体内和更多的权威。第一个筛查是确定一种化合物是否有可能引起内分泌紊乱，是否应该受到T2S的影响。因此，T1S强调实现最大的灵敏度，即使代价是得到一些假阳性[10］.T1S包括(a)细胞自由受体结合，(b)功能检测，如转录激活或细胞增殖，(c)使用切碎的睾丸进行甾体生成，(d)附加酶检测。体内在大鼠、小鼠或兔子(用于T2S)中测定化合物的内分泌活性是很久以前发展起来的。重要的例子是评估阴道涂片类型来定义雌激素性[11和前列腺、精囊和提肛肌(MLA)的生长，以确定雄激素和合成代谢活动[12那13］.由于所涉及的成本，限制动物使用和速度的愿望，动物研究对EDC检测的贡献受到限制。

目前，雄激素水平主要在临床实践中主要是两种方式。免疫测定基于抗体识别类固醇分子的特定化学结构的能力。这些测定具有可变特异性和敏感性，并且样品中的总体雄激素生物活性不能与检测到的抗体结合相关，因为抗原识别的基础仅是结构性的，而不是功能的。一种替代的检测方法是气相色谱 - 质谱（GC-MS）。基于MS的方法是强大的，对于体育掺杂实验室的使用非常有用，因为它们都是特定和敏感的。它们的主要限制是，他们无法识别未知结构的化合物，并依赖于类固醇结构的先验知识。每天使用也是一种更多的劳动密集型和昂贵的例程[14］.

2.的在体外雄激素报告者测定

基于细胞的报告分析在短时间内提供定量和功能信息，使其成为化合物分析和药物发现中最相关和最重要的测定之一。它们测量物质（或物质混合物）的相对活性，而不需要有关配体的化学结构的先前信息。体外雄激素受体检测利用雄激素和与AR结合的化合物的自然信号通路。当配体加入系统时，受体被激活，随后产生可测量的报告蛋白。常规使用的报告基因，其产物很容易被检测，包括荧光素酶，β- 甲酰基酶，或绿色荧光蛋白。表中列出了常用的报告基因，它们的来源和功能2。

选择合适的细胞系对报告试验的敏感性和特异性非常重要[15］.

在本报告中，我们对目前使用的分析进行了分析体外报告基因检测系统可进一步作为检测雄激素和抗雄激素活性的一线筛选(T1S)。

3.用于雄激素报告基因测定的哺乳动物细胞和质粒

用于发育的细胞体外AR转录检测必须满足两个要求:(a)表达AR， (b)携带报告系统，允许测量雄激素反应。报告基因检测的原理是，当雄激素或抗雄激素进入细胞时，它与细胞质中的AR结合;雄激素- ar复合物进入细胞核，并与与报告基因偶联的雄激素反应元件结合，该报告基因的表达可被监测(图)1）。

瞬态转染检测，其中AR和ar响应报告者都被用入天然细胞已用于目的[16-18］.然而，随着受体的数量在每个系统中并且测定来测定测定，受体的数量可能不等，可能不会反映受体的内源性水平。此外，可以在有限的时间内观察到响应，因为转基因在72小时内丢失。稳定转染的细胞可以消除对反复转染的需要并降低可变性。由于他们在本次审查中讨论了他们的稳健性和一致性。

在一个典型的基于“增大化现实”技术的试验,一个细胞系如曹或MCF7使用质粒携带AR基因转染和另一个携带报告基因荧光素酶等下游调控序列的AR。稳定转染实验,细胞检查稳定的基于“增大化现实”技术和集成记者质粒。每孔约10,000个细胞被镀在96孔板上，每孔200个μ.L不含酚红和10% FCS的dmemf12培养基。第二天用PBS冲洗细胞，用新鲜培养基替换。大约3小时后，将测试化合物以10的体积加入细胞中μ.在乙醇中，最终浓度约为1mm。然后在最终浓度为0.01%的培养基中进一步稀释，再孵育24小时。荧光素酶活性用试剂盒测定。具有雄激素活性的化合物的荧光素酶活性明显高于对照。为了检测抗雄激素活性，需要在AR激动剂(如R1881或DHT)的存在下将测试化合物添加到稳定的整合细胞中。r1881诱导的荧光素酶读数在测试化合物存在时显著下降，表明存在抗雄激素活性。

两种类型的细胞系已常规用于开发雄激素转录测定：哺乳动物细胞系和实验室酵母菌株，酿酒酵母。酵母细胞具有快速增长，成本低，再现性的优点。然而，使用酵母系统表达哺乳动物蛋白质可以造成问题，例如不正确的磷酸化，糖基化，折叠或其他发生后期改性。此外，酵母系统缺乏适当的伴侣蛋白和核心蛋白，这对于适当的AR介导的转移剂是必需的。

当创建哺乳动物报告细胞系时，在该受体类的其他成员本底活性低的细胞系中表达外源性类固醇受体是至关重要的。不幸的是，许多传统上用于单个类固醇受体研究的细胞系并不满足这一条件，而且在给定的时间内存在不止一个类固醇受体的内源性表达。

在过去十年内，在各种实验室中已经在各种实验室中制定了许多报告质粒和细胞系特异性测定。Roy等人。[4.]开发出高通量系统，以96孔格式筛选化学品。使用由小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子中存在的激素响应元件（HRE）调节的Ar和荧光素酶报告基因稳定地转染Ch​​O-K1细胞。该系统具有高灵敏度（0.1nmol / L），用于雌激素，如睾酮，可以区分雄激素和抗抗衰性活性。然而，CHO-K1细胞中的低水平的内源性糖皮质激素受体（GR）表达可以干扰雄激素测定。使用MMTV启动子也可以增加结果的模糊性，因为HRE响应于AR和GR。作为一个高吞吐量系统，它能够同时评估多个样本。

内源性AR表达的细胞系也被用于AR报告基因检测[19那20.］.从MDA-MB-453乳腺癌细胞发展而来的MDA-kb2细胞系内源性表达AR，并已稳定转染mmtv -荧光素酶质粒[19］.这些细胞中Ar的表达水平为每Mg蛋白质为240氟醇，产生响应的最低观察浓度为0.1nm DHT。虽然这是一个敏感的测试系统，但是，细胞中GR的表达和使用MMTV HRE使测定较少。一些化合物在该体系中产生了混合反应，包括羟基氟胺，其作为较低浓度的较低浓度和激动剂的拮抗剂作用于拮抗剂。

Hartig等人[20.]使用猴子肾细胞系CV1和MDA-MB-453乳腺癌细胞系，表达内源性AR，用于通过腺病毒介导的转导产生报告结果。基于MDA-MB-453的细胞患有MDA-KB2细胞相同的问题，因为它们表示GR。然而，CV1细胞在0.1nm DHT的存在下显示出45倍的活化，并且由于其他受体引起的干扰很小。

通过将激素响应元件的多个拷贝融合到仅包含Tata Box，Sonneveld等人的最小启动子。[21已经开发出一系列高度敏感和特定的报告细胞系，称为CALUM（化学活化的荧光素酶表达）细胞系。它们使用与荧光素酶基因连接的AR和HRE相关的最小启动子稳定地转染人骨细胞系U2-OS。欧洲委员会₅₀使用该测定，DHT为0.13±0.02nm。细胞没有显示对雄激素前体或GR配体的显着反应，但在暴露于高浓度时诱导响应（0.1μ.米)地塞米松。这是在哺乳动物细胞系中发展起来的最敏感和最特异的报告试验之一。Xu等人利用非洲猴肾细胞系CV-1开发了雄激素报告系统[22那23］.他们对猫记者的使用是对原始的改善β- 高碳糖苷酶报告系统并导致EC₅₀DHT为0.39 nm。然而，这是一个瞬态报告的测定系统，因此容易出现不同批次转染的变化。表中展示了上述所有哺乳动物记者系统的优缺点的比较分析3.。

4.酵母基报告系统

酵母细胞具有快速增长，易于处理，廉价介质组分，以及对测试化学品或溶剂的毒性作用的鲁棒性。而且，在酵母中，可以在不存在影响AR途径的任何其他哺乳动物蛋白质的情况下确定朝向AR的物质的活性。这些因素在一起使酵母AR屏幕快速轻松。因此，许多不同的群体使用酵母报告系统筛选AR激动剂和拮抗剂。基于酵母的检测系统涉及色度检测[24那29或者萤火虫荧光素酶报告者[29］.Chatterjee等人[26]开发了一种使用人类AR的酵母的报告系统，并被驱动β- 高烷基酶。的产品Lacz.由Cyc1酵母启动子驱动。EC.₅₀睾酮为16 nM，二氢睾酮为4 nM。的使用Lacz.该检测系统的报告细胞需要长时间的暴露来显示信号[30.］.

最近,Photorhabdus Luminescens.Lux Operon已被替换为Lacz.酵母雄激素报告筛查（YAS）测定中的基因（S. Cerevisiae.Blyas），[27］.Blyas菌株含有掺入其染色体中的人AR基因。雄激素响应元素存在于质粒中，该质粒也包含组成型表达的勒索和卢克酸基因。Sanseverino等人。[28使用Blyas测定筛选潜在的激素活性化学品。这提供了更大的灵敏度（1.1±0.5×10^-8对于二氢睾酮）与原版相比Lacz.记者。生物发光测定法的一个显著优点是速度。60秒内观察到可量化的生物发光，3-4小时内检测到最大信号。BLYAS可用于高通量。报告信号显影不需要外源性试剂，降低了成本和操作。BLYAS的分析间变异性也较小。BLYAS测定法使用的一个障碍是化学溶解度，因为不能评价不溶于甲醇的化学物质。在酵母培养基中直接添加疏水化学品可增加其用途;然而，非特异性溶剂对生物发光的影响和潜在的酵母毒性需要监测。另一个最近开始使用的报告系统是绿色荧光蛋白，GFP [24那25］.报告GFP发出绿色光，可以从培养中直接测量而不分解细胞。而且，发色团的形成可以在没有任何其他辅助因子的情况下发生。在Beck等人的AR反活化试验中[25[使用GFP报道器，AR的来源是来自PSVaro质粒的人AR。使用由由3bp间隔物分离的两种6bp不对称元件组成的共有的雄激素响应元件。作者使用两者进行测定β- 高烷基酶和GFP记者。获得的职能β-半乳糖苷酶和GFP在睾酮存在时分别为27 nM和23 nM，在二氢睾酮存在时分别为16 nM。GFP荧光的高背景使得在他们的系统中检测GFP信号有点困难。表中提供了所有酵母为基础的AR报告试验系统的比较分析3.。

5.讨论和结论

大量的报告和人类研究为自然和工业来源的EDCs的存在提供了证据，这些EDCs可以特异性地改变雄激素信号[1］.这些可能会通过干扰雄激素生物合成，代谢或作用来影响正常的男性发育编程。通过快速，稳健，廉价和敏感的筛选试验鉴定这些化合物对于最小化处理和暴露于这些化学品，这是必不可少的。在这篇点评中体外已经分析了基于雄激素受体转录的报告分析系统，并突出了它们的优缺点。

雄激素报告试验可以很容易地检测到通过模拟雄激素或阻断雄激素受体转录途径改变雄激素信号的EDCs。报告系统的敏感性很重要，而第一级筛选最强调的是敏感性。ravio等人[31通过引入Ar相互作用蛋白3共粘膜剂，使用了一种提高敏感性的新方法。其他AR共用仪，如P160，P300和/或CARM1 [32]也可纳入报告系统，以提高AR报告分析的敏感性。使用不同的报告器(如GFP和Lux)也提高了筛查的灵敏度和易用性[27那28那30.而不是传统的β- 高透明酶或荧光素酶的系统。

哺乳动物细胞系和酵母细胞系都被广泛用于筛选。虽然酵母系统是廉价和强大的，但酵母不包含所有哺乳动物的酶，激活剂和辅助调节，因此可能不支持所有化合物的转录，否则会影响哺乳动物系统的转录。而且，基于酵母的检测通常比基于哺乳动物细胞的检测更不敏感。哺乳动物细胞系包含大部分的协同调节因子，在这方面表现更好。然而，由于一些协同调节因子是组织或细胞特异性的，来自雄激素应答组织(如前列腺、睾丸和成纤维细胞)的细胞系可能更适合这些研究。Kim等人[15研究人员使用了三种不同的前列腺癌细胞系，进行了短暂的雄激素转染试验。在PC3/AR的研究中⁺细胞在10的存在下显示14倍⁻¹²M - DHT是最敏感的雄激素报告检测方法之一。

在基于哺乳动物细胞系的分析中常用的增强子区域是MMTV-LTR启动子[4.那15那19］.这种增强剂系统的主要缺点是其对糖精和孕酮的响应雄激素。还使用了来自大鼠药物基因调节区的天然雄激素响应转录增强剂[21那26］.然而，该增强剂内的HRE也可以通过糖皮质激素和孕酮受体来识别。因此，需要鉴定和使用具有哺乳动物系统中特异性雄激素受体的增强剂。在这方面，与哺乳动物细胞系相比，酵母细胞代表着具有酵母中已知内源受体的巨大优势。

Sonneveld等。已经比较了34种化合物的相对激动活动体外记者测定与在活的有机体内Shershberger测定在康明奇雄性大鼠中[33］.AR Calux数据与Hershberger测定的相关性导致相关系数（)，表明相关性不强。然而，个别化合物的反应体外几乎总是能够预测结果在活的有机体内在他们的研究中。这两项研究之间的这种差异可能是由于在Hershberger测定中引出反应所需的雄激素的生理浓度很高（160μ.G / kg睾酮），因此较弱的雄激素不会达到活化浓度。他们的研究突出显示，虽然基于细胞的报告分析是激动剂或拮抗活动的整体良好指标在活的有机体内，但考虑到整个动物的复杂生理，需要进行更多的研究来验证两者之间的相关性体外报告分析系统在活的有机体内动物测试系统。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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