文摘

大肠杆菌O157: H7是一种肠道食源性病原体与威胁生命疾病的条件。牛胃肠道中的肠道菌经常污染潜力高的动物产品,如肉类、牛奶和奶酪。一个横断面研究调查志贺产毒的存在大肠杆菌索科托州O157: H7牛奶产品在大都市。二百六十(260)样品(包括160年生和100发酵的牛奶样品)从不同来源收集研究区域内。细菌分离和生化特征产生了大肠杆菌检出率为9.23% (24/260)。分子识别的恢复隔离的PCR扩增Stx1基因的发现大肠杆菌O157: H7积极率为20.83% (5/24)。的总体发病率大肠杆菌O157: H7是1.92%(5/260),阳性比例为原料和发酵的牛奶样品分别为1.86%(3/160)和2.0%(2/100),分别。确切概率法显示无意义的协会之间的隔离和牛奶不同的类型( ; ;(95%置信区间:0.154—-5.704))。结果显示存在大肠杆菌O157: H7索科托州内原料和发酵的牛奶卖的大都市,尼日利亚。研究结果表明可能feacal污染的牛奶产品,与严重的公共卫生后果。这需要需要屏幕其他地区生产的奶制品,如黄油和奶酪。卫生部门在国家需要启发奶农在人畜共患的潜力大肠杆菌O157: H7和牛的角色在病原体的传播。

1。介绍

大肠杆菌是一种革兰氏阴性、杆状的兼性厌氧细菌的家庭肠杆菌科。根据其毒性,细菌生物分为五组,即产肠毒素的大肠杆菌(ETEC),致肠病的大肠杆菌(EPEC),肠出血性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)、附加和消除大肠杆菌(AEEC)和志贺产毒大肠杆菌(STEC) [1]。大肠杆菌O157: H7是一个新兴的血清型大肠杆菌占大多数的人类疾病由肠毒素引起的大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)。它与威胁生命的疾病状况等人类的溶血性尿毒症综合征(HUS),血栓性血小板减少性紫癜(TTP),和出血性结肠炎(HC) [2]。生物体后第一次被公认的人类病原体的爆发出血性结肠炎与食用受污染的牛肉汉堡(3]。牛的主要储集层大肠杆菌O157: H7和抗感染的病原体缺乏受体负责附件的细菌宿主细胞(4]。然而,人类极易受到感染后直接接触受污染的动物粪便或食用受污染的动物产品,如牛肉,牛奶,奶酪(5,6]。大肠杆菌O157: H7全球分布和决定因素负责其出现在人类尚未确认7,8]。然而,畜牧业系统的变化,屠宰和肉类加工实践已经提出在病原体的出现发挥重要作用[9]。肠出血性大肠杆菌表示一个或多个强大的细胞毒素被称为志贺毒素(Stx),这是疾病的发病机理的主要毒力因子由细菌引起的。大肠杆菌O157: H7产志贺毒素1编码的Stx1基因的毒素血清无法区分痢疾(10]。

牛奶形成一些传统乳制品的一个重要组成部分的菜和饮料在尼日利亚北部富拉尼语、豪萨语部落。有时生吃挤奶或允许发酵后作为一个受欢迎的主食饮料的主要配方被称为“fura da禁忌。“越来越多的卫生不卫生的担忧一些牲畜的农民手挤奶方式研究区域。同样,习惯饮用未经巴氏灭菌的乳品milk-borne感染的风险和其产品带来了相当大的消费者。本研究旨在调查志贺产毒的存在大肠杆菌O157: H7索科托州内原料和发酵的牛奶卖大都市利用文化和分子的方法。

2。材料和方法

2.1。研究区域

研究区域大都市索科托州,尼日利亚国家索科托州的首都。它是由四个地方政府区域,即索科托州北部,南部,索科Wamakko, Dange-Shuni。该州位于13°N纬度和经度之间4°8′E和6°54′E在尼日利亚西北部。国家占地面积约56000平方公里(11]。国家股票与尼日尔共和国北部边境,南科吉州,扎姆法拉州东部。根据2006年的人口普查,索科托州估计有人口约4344399。状态是排名第二的牲畜人口约有300万头牛,山羊400万只,385万只羊,080万只骆驼,100万家禽(12]。

2.2。研究设计和样本收集

一个横断面研究,奶牛群和牛奶零售网点在索科大都市被确定为原料和发酵奶的集合,分别。160原料奶样本收集来自16个奶牛3地方政府区域内(地方政府)由62样本索科托州北部,55样本索科托州南部,43 Dange-Shuni样本。抽样不能完成Wamakko LGA没有建立奶牛群。收集样本,泌乳奶牛随机选择10毫升的牛奶收集无菌瓶从每个牛的牲畜。十毫升(10毫升)的混合发酵的牛奶样品中也收集了来自100个不同的销售网点的大都市。牛奶样品(原料和发酵)运输公共卫生实验室在一个冰柜,兽医学院,Usmanu Danfodiyo大学索科托州,尼日利亚。

2.3。文化和生化特征

发酵的牛奶样品的酸度是确定使用pH试纸(厄特曼®)。原料和发酵牛奶样本之前使用无菌蒸馏水稀释10倍接种1毫升到MacConkey琼脂(英国Oxoid)和亚文化对伊红美蓝琼脂(英国Oxoid)使用电镀技术传播。板块在37°C孵化24小时和细菌菌落圆形,润泽、光滑,粉红色MacConkey琼脂,但伊红美蓝琼脂上的绿色金属光泽被认为是大肠杆菌。假定所有殖民地受到传统生化测试小组(IMViC)和隔离吲哚阳性和甲基红试验但不利于Voges Proskauer和柠檬酸利用率测试我们发现大肠杆菌。所确定的大肠杆菌隔离被进一步亚文化到山梨糖醇MacConkey琼脂(英国Oxoid)和孵化一夜之间在37°C。Nonsorbitol发酵时出现光滑、圆形和无色殖民地初步确认大肠杆菌O157: H7早些时候描述(13]。

2.4。DNA提取

核酸提取的沸腾的方法被采用为早些时候描述(14]。简单地说,每个孤立的铂环量是悬浮在二百毫升(200μl) TE缓冲(Tris-HCl(10毫米):EDTA(1毫米))microfuge管,加热15分钟在96°C。管被立即转移到冰15分钟然后在15000 g离心机在室温下2分钟。小球被丢弃,而上层清液含有DNA模板用于聚合酶链反应。

2.5。分子识别

多重聚合酶链反应(PCR)是通过使用TopTaq™大师混合PCR试剂盒(试剂盒®)。25μ12.5 l反应混合物中μl TopTaq大师混合2 x, 7.5μl RNase-free水,2.5μl 200 ng DNA模板,和0.25μM two-primer鸡尾酒(表1放大的180个基点Stx1如前所述(基因15]。样品受到35 PCR周期,每1分钟组成的变性在95°C,退火在65°C的2分钟前10周期,递减循环15到60°C,和1.5分钟72°C的伸长递增2.5分钟周期25至35岁之间。无菌RNase-free水和证实大肠杆菌O157: H7隔离被用作正面和负面的控制,分别。

表1
寡核苷酸序列用于PCR。
2.6。琼脂糖凝胶电泳

1.5%的琼脂糖凝胶是由暂停1.5克100毫升的琼脂糖粉1 x Tris-Borate-EDTA(此种)缓冲区和热板加热,直到完全溶解。溴化乙锭(2.5μl)被加入到液体涌入前琼脂糖凝胶施法者集,并允许在室温下固化。施法者是正确放入电泳槽和淹没1 x此种缓冲区的最大级别之前仔细把梳子。PCR产品(5μl)被加载到使用10井μl埃普多夫吸管。四个每毫升(4μl) 100个基点的梯子(新英格兰生物学实验室Inc .)和2μl凝胶装入染料蓝色6 x(生物学实验室新英格兰Inc .)也被加载到一个井连接水箱之前电源组,插到电源供应。产品电泳在85伏50分钟。琼脂糖凝胶电泳后,立即被使用凝胶Doc™XR + (BioRad)。这种凝胶图像拍摄和相应的标签。

2.7。数据分析

获得的结果提出了在表和叙述。确切概率法被用来确定之间的联系大肠杆菌O157: H7隔离和类型的牛奶(原料和发酵)通过5%的显著性水平和95%置信区间。所有分析使用SPSS(23版;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果与讨论

的总体发病率大肠杆菌为9.23%(24/260)的分离率为9.38%(15/160)和9.0%(9/100)为原料和发酵牛奶,分别。使用x平方分布统计分析( )测试显示无意义的协会( 、= 1.05(95%置信区间:0.44—-2.49))之间大肠杆菌隔离和牛奶的不同类型(表2)。分子识别的志贺毒素1基因的PCR扩增(Stx1)在大肠杆菌O157: H7显示5个的24大肠杆菌隔离是正的患病率为20.83%(5/24)(图1)。原料和发酵奶的患病率是1.86%(3/160)和2.0%(2/100),分别。确切概率法显示无意义的协会( ;或= 0.94;(95%置信区间:0.154—-5.704))之间大肠杆菌O157: H7隔离和牛奶的不同类型(表3)。原料奶样本阳性的比例大肠杆菌采样在地方政府三个方面分别为5.45%(3/55),12.70%(8/62)和9.30%(4/43)的索科托州南部,北部,索科和Dange-Shuni,分别。单变量logistic回归分析显示无意义的关联大肠杆菌隔离和当地政府区域(表4)。然而,只有3隔离大肠杆菌从原料奶样本中恢复过来大肠杆菌O157: H7阳性比例为25.0%(2/8)和33.3%(1/3)索科索科托州北部和南部地区开展,分别。没有一个大肠杆菌隔离从Dange-Shuni LGA STEC。确切概率法显示无意义的协会( ;或= 1.50;(95%置信区间:0.084—-26.86))STEC隔离和地方政府在研究区域(表中5)。两个STEC确认在9大肠杆菌孤立的从发酵的牛奶来自不同地方(索科托州北部和南部索科托)。然而,没有进行统计分析,以确定任何协会STEC隔离和地方政府因为这两个领域有一个积极的范例。

表2
的频率大肠杆菌从原料和发酵的牛奶样品分离。
表3
的频率大肠杆菌O157: H7隔离从原料和发酵的牛奶样品。
表4
单变量分析大肠杆菌从原料奶在三个地方政府地区隔离(地方政府)。
表5
的频率大肠杆菌从原料奶O157: H7隔离在两个地方政府区域(地方政府)。

图1
琼脂糖凝胶电泳结果PCR检测Stx1基因大肠杆菌O157: H7。梯子巷M: 100个基点(生物学实验室),巷1:积极控制,通道2到6:积极的样品,和巷7:消极的控制。

牛奶是一种很好的媒介的生长和增殖导致细菌等微生物和一些疾病单核细胞增多性李斯特氏菌,沙门氏菌物种,志贺氏杆菌物种,弯曲杆菌物种与食用受污染的牛奶(有关16]。所有负责milk-borne疾病的病原体,大肠杆菌O157: H7是最致病性,因为它已经在各种疾病有罪溶血性尿毒症综合征、血栓性血小板减少性紫癜,出血性结肠炎(2]。此外,病原体的传播动力学的研究报告了类似的毒性资料在隔离恢复从人类和产肉动物如牛16]。的隔离大肠杆菌O157: H7原料和发酵的牛奶在这个研究表明潜在的病原体和随后的粪便脱落污染的牛奶。牛是有机体的主要水库,可以积极摆脱粪便中的细菌没有任何临床表现(5,17]。因此有高风险的牛奶污染后从受感染的动物或不卫生的集合群与运营商病原体的报道(18]。手挤奶是最练习方法的牛奶收集在豪萨/富拉尼族游牧群落在尼日利亚。这些牲畜的农民自己的全国人口90%以上的牛和不实践premilking洗手等卫生和清洁/消毒的乳房乳头(19]。此外,他们不会用巴氏法灭菌牛奶,因为他们没有正确教育在饮用了受污染的牛奶的健康风险20.]。因此,这些奶农提供的牛奶可能是含有致病性菌群从乳房或乳头运河和动物的皮肤,从而给消费者带来严重的健康威胁。

发酵的牛奶作为一种保护通过降低pH值与合成减少微生物负载。它是牛奶保存最古老的手段之一,未经高温消毒的牛奶是留给接受自然发酵的微生物出现在牛奶和周围的空气。在大多数传统,培养液的未知微生物的身份从以前发酵牛奶作为起动文化。然而,这种做法把潜在的有害微生物在生产过程中,从而使产品不适合消费。虽然发酵牛奶的酸度使其成为大多数细菌的生存不利的媒介,大肠杆菌O157: H7稳步形容是耐酸可以生存在发酵牛奶pH值低至4.0 (21]。这凸显了无足轻重的协会之间观察到的生物和牛奶的不同类型(表2和3)。此外,豪萨语/富拉尼族牧民在尼日利亚练习相同的畜牧业和传统的畜牧生产方法。这背后的原因可能是隔离的大肠杆菌从牛奶从研究区域内的不同地方收集的样本和无意义的协会之间的隔离恢复(大肠杆菌STEC)和地方(表4和5)。

原料奶的污染被认为发生在挤奶时由于卫生条件恶劣或处理牛奶运输的过程中22]。同样,污染物在发酵的牛奶可能是之前介绍过的发酵过程或稍后在运输的过程中。然而,在这项研究中,检测大肠杆菌O157: H7原料和发酵的牛奶的PCR扩增Stx1基因与早些时候报告显示的情况相符的基因大肠杆菌O157: H7恢复从牛奶和牛肉23,24]。

4所示。结论

本研究的结果表明存在大肠杆菌O157: H7索科托州内原料和发酵的牛奶卖大都市。奶制品可能污染的牛奶收集、加工、存储、和/或运输,因此呈现严重的公共卫生问题,特别是儿童,老年人免疫功能不全的受试者,。这些发现非常需要危害分析关键控制点(HACCP)牛奶生产的传统方法,以识别潜在的微生物污染物的来源,并引入适当的预防和控制措施。兽医推广服务的国家应该重申农业卫生习惯,教育豪萨语/富拉尼族牧民的重要性农场卫生和相关的风险与食用受污染的牛奶。重点应该是人畜共患的潜力大肠杆菌O157: H7和牛的角色在病原体的传播。卫生当局在索科托州和国家的需要调节牛奶和奶制品的生产和销售通过引入定期筛查和健康证书发行给农民。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

作者要感谢奶牛场和牲畜在大都市的索科在样本收集的合作。作者还要感谢管理Usmanu Danfodiyo大学索科托州,尼日利亚,提供的设施用于这项研究。