肠球菌高水平氨基糖苷耐药氨基糖苷修饰酶基因分析

摘要

酶修饰导致对氨基糖苷(HLAR)的高水平抗性，消除了细胞壁活性剂和氨基糖苷联合暴露的协同杀菌效应。因此，本研究的目的是确定hla肠球菌分离株的患病率和氨基糖苷修饰酶基因的分布。对来自不同临床样本的100株肠球菌非重复分离株进行分析。根据临床和实验室标准协会的指南，采用Kirby-Bauer椎间盘扩散法筛选肠球菌。采用e试验测定所有菌株对庆大霉素和链霉素的最低抑菌浓度。对hla肠球菌分离株进行多重聚合酶链反应(PCR)，以鉴定氨基糖苷修饰酶基因，负责耐药性。60%的菌株被发现是高水平庆大霉素耐药(HLGR)，而45%的菌株被发现是高水平链霉素耐药(HLSR)。通过多重PCR, 80%的HLGR分离株携带双功能氨基糖苷修饰酶基因AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia而45个高水平链霉素耐药菌株中有18个，也就是40%携带雅彻（3.”) iii a。然而,雅彻（2''）-ib，雅彻（2'') ", aph (2''）-ID，和ant (4”）-ia未检测到编码其他氨基糖苷的基因。双官能氨基糖苷酱改性酶基因AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia是负责Hlar的主要基因。

1.介绍

肠球菌是许多温血动物肠道的天然居住者。因此，它们会随粪便大量释放，并可能成为许多食物中的主要污染物微生物群[1］．肠球菌是感染性心内膜炎的第三个主要原因，占假性瓣膜内膜炎的6-7％，5-20％的天然瓣膜病例，即[2］．1986年10月至1997年4月的医院监测数据列表肠球菌作为医院菌血症的第三个主要原因，占所有分离株的12.8％[3.］．已经证明了畜牧业抗生素的使用与抗生素抗性之间的联系。食物动物中肠细胞的抗性与从医院感染中分离的肠球菌（包括对氨基糖苷类，林冠酰胺，大溴化硼，亚硝化呋喃，青霉素，喹诺酮类，链条，四环素，并且很少是万古霉素）的肠细胞（包括抗氨基糖苷的抗性（包括抗性）的描述非常相似4］．

目前，在肠球菌属，共有28种[5］．这些物种中的大多数在人类中并不常见。粪肠球菌是最常见的分离物，与80-90%的人类肠球菌感染有关。肠球菌粪便排名第二，与10-15%的感染病例隔离。其他肠球菌种类，包括E.Casseliflavus，E.Avium，E.Durans，E.Cecorum，E.Hiraeum，E.Hirae，E. Raffinosus，E.Malodoratus，E. Dispar，E.Flavescens，E.Flavescens，和E. Mundtii，很少被人类感染分离[6］．

所有肠球菌对氨基糖苷类药物具有内在的低水平耐药性，最低抑菌浓度(mic)为4μg/mL，高达256μg / ml。通过限制药物吸收，探讨肠球菌的兼肠球菌代谢对所有氨基糖苷的低水平抗性，这与参与电子传输的蛋白质相关。加入干扰细胞壁合成的药剂，例如氨苄青霉素（或万古霉素），显着增加了氨基糖苷的摄取，大大提高了杀伤肠球菌［3.］．在临床实践中，氨基糖苷类、庆大霉素和链霉素是仅有的两种化合物被推荐达到这种协同作用。不鼓励使用其他氨基糖苷类药物。对氨基糖苷的高水平耐药(HLR)定义为在2000 mg/L和500 mg/L的链霉素和庆大霉素浓度下，在脑心灌注(BHI)琼脂或使用BHI肉汤时，在1000 mg/L的链霉素浓度下的生长[7］．

酶促改性是最常见的氨基糖苷类抗性。已经确定了超过50种不同的酶。酶改性导致高液位阻力[8]，消除了同时接触细胞壁活性剂和氨基糖苷的协同杀菌作用[9］．假设酶源自制备氨基糖苷类的生物或编码参与细胞呼吸的酶的基因突变[10］．氨基糖苷修饰酶有三种类型:(1)n -乙酰转移酶(AAC)，催化乙酰辅酶a依赖的氨基乙酰化;(2) o - adenyylltransferases (ANT)，催化atp依赖的羟基腺苷酸化;(3) o -磷酸转移酶(APH)，催化atp依赖的羟基磷酸化。本研究的目的是确定hla肠球菌分离株的患病率和氨基糖苷修饰酶基因的分布。

2.材料和方法

该研究在2013年1月至2016年1月至2016年1月至2016年1月进行。该研究是在初级护理中心中的微生物学实验室中收到的各种临床样本中分离的肠球菌的100个连续的，非批量分离株。像脓液，血液，尿液，中央线尖端等标本，无菌地收集并根据标准方案运输。

2.1。表型鉴定

通过菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶试验、胆汁胆碱试验等各种生化反应对肠球菌分离株进行鉴定和形态鉴定(如图所示)1），在6.5％NaCl，Pyr试验，甘露醇发酵，精氨酸二氢醇酶试验，蔗糖发酵，阿拉伯糖发酵，丙酮酸盐，乳糖发酵和颜料生产中的生长。

肠球菌粪便和粪肠球菌特异性和基因分别[11］．根据2013年CLSI指南，采用Kirby-Bauer法检测所有肠球菌分离株对多种肠球菌活性抗生素的敏感性。

2.2。测试Hlar.

用hlg120筛选HLGRμG盘和HLSR与HLS 300 μ(如图所示)2)．两个国家临床和实验室标准协会(CLSI)委员会推荐QC菌株，粪大肠ATCC 29212易感应变，和粪大肠ATCC 51299抗性菌株。

采用e试验测定HLGR和HLSR肠球菌的MIC (Epsilometer Test;-1024 - 0.064μg / ml）（如图所示）3.)．

2．3.氨基糖苷修饰酶(AMEs)基因特征

DNA提取采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA迷你试剂盒。采用6套引物对所有hla分离株进行多重PCR检测。使用的寡核苷酸引物见表1．

在本研究中分析的基因是AAC（6.”) -Ie-aph (2'') ia aph (3”) iii a aph (2''）-ib，雅彻（2'') ", aph (2''）-ID，和ant (4”）-ia，负责肠球菌中的高水平氨基糖苷抗性。

PCR反应量为50μL在反应管中有以下内容：5 μl DNA模板，1.5 mM MgCl2, 0.1 mM(每个)三磷酸脱氧核苷，1个PCR缓冲液，2.5 U的TaqDNA聚合酶，PCR中各引物的量为:25pmolAAC（6）-ie-APH（2）-IA，25 pmol foraph ib (2)，3.5 pmol foraph (2) "， 5 pmolaph (2) id，3 pmol for雅彻（3）-iiia， 2 pmol蚂蚁（4）-ia［9］．PCR在（Perkin-Elmer Gene AMP 2400）中进行热循环仪，在94℃下具有3分钟的初始变性步骤;35循环在94°C，40秒的55°C，40秒，40秒，72℃。并且在72°C时2分钟的最终延伸步骤[9］．在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上通过电泳通过电泳分析PCR产物1至1 [1/2]小时。

扩增后分析是用100碱基对分子量标记的凝胶电泳完成的。在紫外线透照器下观察凝胶，并在附在透照器和电脑上的数码相机的帮助下进行记录。多重PCR后，将扩增产物送测序确认。测序方法为Sanger毛细管测序法。采用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST程序对序列进行分析。

3.结果

在100个分离物中，52（52％）是粪大肠48（48％）是大肠都有效通过常规表型和PCR分析。将分离出肠球菌的最常见的临床样本是尿液（60％），然后是血液（15％），PU（17％），气管吸出（4％），精液（2％）和排水液（2％）．

通过Kirby-Bauer光盘扩散方法50％分离物显示对氨苄青霉素的抗性（10 μG），64％分离物显示对环丙沙星的抗性（5 μG)， 12%的菌株对万古霉素耐药(30μG)和替考拉宁(30μg)。

发现总共60个分离物是使用120的高水平庆大霉素抗性 μ45株菌株对链霉素300有高水平耐药μ根据CLSI准则，采用Kirby-Bauer圆盘扩散法。48株结核分枝杆菌中37株(77%)大肠都有效和23（44％）的52个分离物粪大肠被发现对HLGR有耐药性，而在48株大肠都有效52株分离株中有20株(38%)粪大肠被发现对HLSR有抗药性。

通过Kirby-Bauer纸片扩散法检测到的60株庆大霉素高水平耐药菌株均表现为MIC > 500μg / ml电性能测试。45株链霉素高水平耐药株均表现为MIC > 1000μg / ml电性能测试。

60 hlg中的四十八个，即80％，分离株携带双官能ame基因AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia而45株HLSR中有18株，也就是40%，携带病毒雅彻（3.”) iii a（如图所示4）．然而雅彻（2''）-ib，雅彻（2'') ", aph (2''）-ID，和ant (4”）-ia在我们的研究中未检测到编码其他AMEs的基因。30 HLGR大肠都有效隔离了AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia基因和18 HLGR粪大肠带双官能AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia基因。十一HLSR.大肠都有效隔离了雅彻（3.”) iii a和07年HLGR粪大肠进行雅彻（3.”) iii a．

NCBI位点序列爆炸的结果显示100％同一性与双官能氨基糖苷改性酶。

4.讨论

在目前的研究中，最常见的肠球菌分离的临床样本是尿液(60%)，其次是脓液(17%)，血液(15%)，气管抽吸物(4%)，精液(2%)和引流液(2%)。其他研究也得到了类似的发现，如Mathur等[12从尿液样本中获得49%的肠球菌。

在不同的研究中,粪大肠已占临床分离株80-85％的主要肠球菌物种，其次是大肠都有效占临床分离株约10-15％的账户[13］．但近年来大肠都有效已经变得越来越普遍，可能是因为它对抗生素有更强的耐药性。在目前的研究中，在100个分离株中，52个(52%)是粪大肠48（48％）是大肠都有效这与其他研究类似于elango padmasini等。谁获得了粪大肠86/178 (48.3%)大肠都有效是80/178 (44.9%)[14］．

肠球菌传统上被认为是低级别病原体，但在20世纪90年代已成为医院感染的一个日益重要的原因。这些感染是通过三个t来识别的:坚韧的、顽强的和麻烦的[13，15］．此外，肠球菌具有更大的重要性，因为它们对许多抗菌药物，特别是氨基糖苷，包括庆大霉素和链霉素的耐药性日益增加。

单药治疗心内膜炎β-内酰胺类抗生素(许多肠球菌耐药)的结果令人失望，治疗结束时治愈率很低。然而，将氨基糖苷加入细胞壁活性剂(aβ内酰胺或糖肽）增加治愈率并消除生物体;此外，这种组合在体外是协同和杀菌剂。因此，用细胞壁 - 活性剂和氨基糖苷的组合治疗是肠球菌引起的血管内感染的护理标准[16］．该协同效应可以至少部分地解释氨基糖苷进入细菌细胞的渗透，这可能是由于占该细胞壁改变的结果β内酰胺或糖肽。然而，在治疗严重肠球菌感染中获得协同杀菌活性已变得越来越困难，因为对几乎所有可用于这一目的的抗生素产生了耐药性[16］．

之间β-内酰胺类药物中，活性最强的是氨青霉素(氨苄西林、阿莫西林)和脲青霉素(即哌拉西林);其次最有效的是青霉素和亚胺培南。对大肠都有效，如果MIC为<64，则已经提出了高剂氨酸氨苄青霉素（高达30g / d）和氨基糖苷的组合，即使是氨苄青霉素抗性菌株 μ由于血浆氨苄青霉素浓度为> 100 μ可以在高剂量下实现g / ml [16］．

在100个分离株中，60个(60%)通过盘扩散法和庆大霉素e试验显示出高水平的庆大霉素耐药，这与Randhawa等人的其他研究类似，他们报告了68%的HLGR [17];最近在伊朗进行的研究[18]在其所在地区报告了约60.45%的HLGR菌株。通过圆盘扩散法和链霉素e试验(类似于Randhawa等人的其他研究)，在100株分离株中，只有45株(45%)显示出高水平的链霉素耐药性。[17］．谁报告了43％的HLSR。除了光盘扩散外，CLSI建议更多的方法对HLAR检测，即琼脂稀释和肉汤微脱离。

各种研究都发现大肠都有效对高水平庆大霉素和链霉素有更大的耐药性。在本研究中大肠都有效明显偏高(值< 0.05)粪大肠和hlsr in.大肠都有效高于粪大肠但没有统计学意义（价值> 0.05）。

肠球菌之间的高水平氨基糖苷类抗性是由于产生氨基糖苷酱改性酶（AME），例如2'-磷酸转移酶，3'-磷酸转移酶，6'-乙酰转移酶和6'-腺苷转移酶。在我们的研究中，60 HLGR中的48个，即80％，分离株携带双官能AME基因AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia这与Padmasini等人的观点一致[14， Hasani等[18，分别报道了68.4%和100%的双功能AME基因。其他研究也表明aac (6') -Ie-aph (2''）-ia是耐庆大霉素肠球菌中最普遍的基因[19，20.]，而45个HLSR中的18个，即40％，分离株雅彻（3.”) iii a。Padmasini等人[14报道，77％的HLSR分离株雅彻（3.”) iii a基因。然而雅彻（2''）-ib，雅彻（2'') ", aph (2''）-ID，和ant (4”）-ia还发现基因对庆大霉素（>500μg/ ml）编码高液晶抗性[14在我们的研究中没有发现。

结论

本研究中肠球菌分离株中庆大霉素高水平耐药的流行率为60%，链霉素高水平耐药的流行率为45%。大肠都有效和粪大肠数量几乎相等，但发现抵抗更常见大肠都有效而不是粪大肠．e检验与圆盘扩散试验结果相似。多重PCR可检测与hla相关的AMEs基因，敏感性和特异性较高。双官能AME基因AAC（6.”) -Ie-aph (2''）-ia是负责hla的主要基因，它消除了联合暴露于细胞壁活性剂和氨基糖苷的协同杀菌效应。

信息披露

目前隶属于印度金奈的国家流行病学研究所(ICMR)。Naveen Grover目前隶属于印度拉达克的Col Med。Mahadevan Kumar目前隶属于印度德里陆军医院研发实验室科学和分子医学系。

的利益冲突

作者宣布关于本文的出版物没有利益冲突。

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