JPATH 杂志的病原体 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi 10.1155 / 2017/3256952 3256952 研究文章 分析氨基糖苷类修饰酶基因负责高层氨基糖苷类肠球菌的分离株之间的电阻 http://orcid.org/0000 - 0002 - 6202 - 8784 雨水 Vishal所在 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 4083 - 761 x 格罗弗 纳文 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 1656 - 1649 库马尔 马哈德文 1 梅西 Patrizia 微生物学系 武装部队医学院 浦那 印度 afmc.nic.in 2017年 24 12 2017年 2017年 14 08年 2017年 17 10 2017年 24 12 2017年 2017年 版权©2017 Vishal雨水等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

酶改性导致高级耐氨基糖苷类(HLAR),这样可以排除相结合的协同杀菌效果接触细胞wall-active代理和一个氨基糖苷类。所以这项研究的目的是确定患病率HLAR肠球菌的分离和研究氨基糖苷类修饰酶基因的分布。总共100 nonrepeat隔离enterococci从各种临床样本进行了分析。根据临床和实验室标准协会指南enterococci筛选为HLAR Kirby-Bauer纸片扩散法。最低抑制浓度的分离株对庆大霉素、链霉素是取决于电性能测试。多重聚合酶链反应(PCR)进行了HLAR肠球菌的分离识别氨基糖苷类修饰酶基因负责抵抗。60%隔离被认为是高级耐庆大霉素(HLGR)而45%隔离是高层链霉素耐药(HLSR)。多重PCR 80% HLGR隔离进行双官能氨基糖苷类修饰酶基因 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)而18 45高层链霉素耐药,即40%,隔离 aph (3′ )iii a。然而, aph (2′′ aph) ib (2′′ )",aph (2′′ )身份证,和 ant (4′ ia)基因编码其他氨基糖甙类修改酶没有检测到。双官能氨基糖苷类修饰酶基因 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)是主要的基因HLAR负责。

 1。介绍

Enterococci是自然的居民许多温血动物的肠道。结果,他们被释放大量的粪便,可能成为主要的污染物微生物群在许多食物 1]。Enterococci第三感染性心内膜炎的主要原因,占6 - 7%的人工瓣膜心内膜炎和5 - 20%的病例的本地阀即[ 2]。院内监测数据从1986年10月到1997年4月列表enterococci第三医院内菌血症的主要原因,占所有的12.8%隔离( 3]。抗生素的使用之间的联系在畜牧业和抗生素耐药性的崛起已经证明。enterococci阻力的食用动物非常类似于所描述的enterococci隔绝院内感染(包括耐氨基糖甙类、lincosamides、大环内酯类、硝基呋喃类、青霉素、喹诺酮类,streptogramins,四环素,和很少万古霉素)( 4]。

目前,在 肠球菌属有28种( 5]。大多数这些物种在人类并不常见。 粪肠球菌是最常见的隔离,与80 - 90%的人类肠球菌的感染有关。 肠球菌都有效排名第二和孤立于10 - 15%的感染。其他肠球菌的物种,包括 e . casseliflavus鸟结核大肠,大肠杜兰,e . cecorum e . gallinarum e . hirae e . raffinosus e . malodoratus e . dispar e .刺蛾和 e . mundtii从人类感染很少是孤立的 6]。

所有enterococci内在低级耐氨基糖甙类,以最小抑制浓度(麦克风)从4 μ高达256 g / mL μ克/毫升。的兼性厌氧代谢enterococci被认为产生低级抵抗所有氨基甙类抗生素通过限制药物吸收,这是相关的蛋白质参与电子传递。添加一个代理干扰细胞壁的合成,如氨苄青霉素(或万古霉素),显著增加氨基糖苷类的摄取,大大提高造成的 肠球菌( 3]。氨基糖甙类、庆大霉素、链霉素是唯一两种化合物推荐在临床实践中实现这一协同效应。其他氨基甙类抗生素的使用为这个目的是气馁。高层阻力(HLR)浓度的氨基糖甙类被定义为增长2000 mg / L和500 mg / L(链霉素、庆大霉素,分别在脑心浸液(BHI)琼脂或1000 mg / L(当使用链霉素BHI汤( 7]。

酶改性是最常见的一种氨基糖苷类耐药性。超过50个不同的酶已确定。酶改性导致高层电阻( 8],它消除了接触单元相结合的协同杀菌效果wall-active代理和一个氨基糖苷类 9]。假设,酶是来源于生物体,使氨基糖苷类或突变的基因编码的酶参与细胞呼吸( 10]。有三种类型的氨基糖苷类修饰酶:(1)N-Acetyltransferases (AAC)催化acetyl-CoA-dependent氨基的乙酰化作用;(2)O-Adenylyltransferases (ANT)催化ATP-dependent腺苷酸的羟基;(3)O-Phosphotransferases (APH)催化ATP-dependent羟基磷酸化。这项研究的目的是确定患病率HLAR肠球菌的分离和研究氨基糖苷类修饰酶基因的分布。

 2。材料和方法

这项研究是进行三级护理中心2013年1月和2016年1月之间。本研究进行了连续100年,nonrepeat隔离enterococci孤立的从各种临床微生物实验室的样品收到三级护理中心。标本像脓、血、尿、中央线,和不同的人收集和运输/标准协议。

2.1。表型鉴定

enterococci的隔离是识别和扩展的基础上,菌落形态、革兰氏染色剂,和各种生化反应,如过氧化氢酶试验、胆汁七叶灵测试(如图 1),增长6.5%氯化钠,PYR测试,甘露醇发酵,精氨酸dihydrolase测试中,蔗糖发酵、阿拉伯糖发酵生长在丙酮酸、乳糖发酵和色素生产。

胆汁七叶灵琼脂扩散介质的变黑 肠球菌spp。

肠球菌都有效和 粪肠球菌经聚合酶链反应分析进一步证实了使用特定的 d d l E 。 f 一个 e c 我 u 米 和 d d l E 。 f 一个 e c 一个 l 我 年代 基因,分别 11]。所有肠球菌的分离检测他们对各种抗生素对enterococci活性物种Kirby-Bauer方法按照CLSI指南2013。

 2.2。测试HLAR

筛选HLGR的回龙观120 μg盘和HLSR HLS 300 μg盘(如图 2)。两个国家委员会对临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的QC菌株, 粪大肠写明ATCC 29212感性品系, 粪大肠写明ATCC 51299耐药菌株。

120年测试HLGR的回龙观 μg盘和HLSR HLS 300 μg盘。

HLGR的麦克风和HLSR肠球菌的分离是由电性能测试(Epsilometer测试;-1024 - 0.064 μg / ml)(如图 3)。

电性能测试显示麦克风庆大霉素耐药菌株 肠球菌都有效(MIC > 1000 μg / ml)。

 2.3。氨基糖苷类修饰酶基因(AMEs)鉴定

QIAamp DNA试剂盒迷你包,德国,是用于DNA提取。所有HLAR隔离受到使用6集多重PCR引物。寡核苷酸引物见表使用 1。

引物中使用多重PCR ( 9]。

氨基糖苷类耐药基因 产品尺寸(bp) 序列类型 引物序列( 5 ′ → 3 ′ )
aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia) 369年 弗兰克-威廉姆斯 CAGGAATTTATCGAAAATGGTAGAAAAG
R CACAATCGACTAAAGAGTACCAATC
aph (2′′ ib) 867年 弗兰克-威廉姆斯 CTTGGACGCTGAGATATATGAGCAC
R GTTTGTAGCAATTCAGAAACACCCTT
aph (2′′ )" 444年 弗兰克-威廉姆斯 CCACAATGATAATGACTCAGTTCCC
R CCACAGCTTCCGATAGCAAGAG
aph (2′′ )身份证 641年 弗兰克-威廉姆斯 GTGGTTTTTACAGGAATGCCATC
R CCCTCTTCATACCAATCCATATAACC
aph (3′ )iii a 523年 弗兰克-威廉姆斯 GGCTAAAATGAGAATATCACCGG
R CTTTAAAAAATCATACAGCTCGCG
ant (4′ ia) 294年 弗兰克-威廉姆斯 CAAACTGCTAAATCGGTAGAAGCC
R GGAAAGTTGACCAGACATTACGAACT

弗兰克-威廉姆斯:正向引物;接待员:反向引物。

在目前研究的基因分析 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ )ia aph (3′ )iii a aph (2′′ aph) ib (2′′ )",aph (2′′ )身份证,和 ant (4′ ia)负责高级enterococci氨基糖苷类耐药性。

进行了PCR反应体积的50 μl与下列反应管:5 μMgCl2 l的DNA模板,1.5毫米,0.1毫米(每个)deoxynucleoside三磷酸,1 x PCR缓冲和2.5 U TaqDNA聚合酶,每个引物PCR的数量是如下:25 pmol aac (6) -Ie-aph ia (2),25 pmol aph ib (2),3.5 pmol aph (2) ",5 pmol aph (2) id,3 pmol aph (3) iii a,2 pmol 蚂蚁ia (4)( 9]。PCR(2400年优秀基因Amp)中进行热循环的初始变性步骤3分钟在94°C;35周期40年代在94°C, 40年代在55°C,三、四十年代在72°C;和最后一个扩展的一步,在72°C(2分钟 9]。在100 V PCR电泳分析的产品1 - 1(1/2)小时1%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。

Post-amplification与凝胶电泳分析了100碱基对分子量标记。下的凝胶被紫外线透照器,并记录在数码相机上的帮助下透照器和电脑。经过多重PCR,扩增子被测序来确认。使用的测序方法是桑格的毛细管测序。爆炸序列分析与程序的国家生物技术信息中心(NCBI)。

 3所示。结果

100年的隔离,52 (52%) 粪大肠48 (48%) 大肠都有效通过传统的表型和PCR分析。最常见的临床样本enterococci被孤立的尿(60%),其次是血(15%)、脓(17%)、气管吸入(4%)、精液(2%),和漏液(2%)。

Kirby-Bauer纸片扩散法分离显示抗氨苄青霉素(10 50% μg),隔离显示对环丙沙星的耐药性(5 64% μg), 12%的分离株耐万古霉素(30 μg)和teicoplanin (30 μg)。

60隔离被认为是高级耐庆大霉素使用120 μ45 g盘Kirby-Bauer纸片扩散法而隔离也发现高级抗链霉素300 μg盘Kirby-Bauer纸片扩散法按照CLSI指南。37(77%)48隔离 大肠都有效和23(44%)52隔离 粪大肠被发现是抵抗HLGR而25(52%)48隔离 大肠都有效和20(38%)52隔离 粪大肠被发现是抵抗HLSR。

60隔离,被发现是高级耐庆大霉素Kirby-Bauer纸片扩散法显示麦克风> 500 μg / ml电性能测试。所有45高层链霉素抗性分离Kirby-Bauer纸片扩散法显示麦克风> 1000 μg / ml电性能测试。

48 60 HLGR的,80%,隔离进行双官能AME基因 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)而18的45 HLSR, 40%,隔离 aph (3′ )iii a(如图 4) 。然而 aph (2′′ aph) ib (2′′ )",aph (2′′ )身份证,和 ant (4′ ia)基因编码其他艾姆斯并不在我们的研究中发现。30 HLGR 大肠都有效隔离了 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)基因和18 HLGR 粪大肠带双官能 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)基因。十一HLSR 大肠都有效隔离了 aph (3′ )iii a和07年HLGR 粪大肠进行 aph (3′ )iii a。

代表图像的PCR凝胶电泳检测氨基糖苷类修饰酶基因(AME)。巷1:积极的控制( 大肠都有效写明ATCC 51299)。雷恩N:消极的控制( 大肠都有效写明ATCC 29212)。车道4、6、7、8、9、10、13、14、16、17日,18日和19日:积极;乐队在523个基点 aph (3′ )iii a基因和369个基点 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ )ia基因。雷恩L:分子标记(100个基点)。

爆炸的结果序列在NCBI网站显示,100%身份与双官能团的氨基糖苷类修饰酶。

 4所示。讨论

在目前的研究中,最常见的临床样本enterococci被孤立的尿(60%),其次是脓(17%)、血液(15%)、气管吸入(4%)、精液(2%),和漏液(2%)。类似的结果也获得在其他的研究中,如Mathur et al。 12)获得49%的enterococci尿液样本。

在不同的研究中, 粪大肠一直主要肠球菌的物种占80 - 85%的临床分离株,其次是吗 大肠都有效约占10 - 15%的临床分离株 13]。但近年来 大肠都有效可能变得更加普遍,因为它的更大的抗生素耐药性。在目前的研究中,100例孤立,52 (52%) 粪大肠48 (48%) 大肠都有效这是类似于其他研究Elango Padmasini等人得到了谁 粪大肠86/178 (48.3%) 大肠都有效这是80/178 (44.9%) 14]。

Enterococci传统上被认为是低级的病原体,但已成为一个日益在1990年代院内感染的重要原因。这些感染是公认的3 t的:坚韧,顽强,和麻烦 13, 15]。此外,enterococci承担更大的重要性,因为他们的许多抗菌药物耐药性增加,尤其是氨基糖苷类,包括庆大霉素、链霉素。

单一疗法为心内膜炎 β内酰胺抗生素(许多enterococci宽容)产生了令人失望的结果,治愈率较低的疗法。然而,添加一个细胞wall-active代理(氨基糖苷类 β内酰胺或糖肽)增加治愈率和根治生物;此外,这种组合是协同和体外杀菌。因此,联合治疗与细胞wall-active代理和一个氨基糖苷类的护理标准血管内enterococci[引起的感染 16]。这种协同效应可以解释说,至少部分的增加渗透氨基糖苷类细菌细胞,可能由于细胞壁的改变归因于 β内酰胺或糖肽。尽管如此,实现协同杀菌活动严重肠球菌的感染的治疗变得越来越困难,因为发展的阻力几乎所有抗生素用于这一目的( 16]。

在 β内酰胺代理,最活跃的是aminopenicillin(氨苄西林,阿莫西林)和ureidopenicillin(即。哌拉西林);下一个最活跃的是青霉素和imipenem。对 大肠都有效,大剂量氨苄青霉素(30 g / d)和一个氨基糖苷类已经建议即使对氨苄青霉素耐药菌株是否< 64麦克风 μ克/毫升血浆氨苄青霉素浓度> 100 μ在高剂量(g / mL可以实现 16]。

100隔离,60例(60%)显示高级耐庆大霉素通过纸片扩散法和庆大霉素电性能测试类似于其他像Randhawa等人的研究报告68% HLGR [ 17];在伊朗最近的研究( 18)报道约60.45% HLGR菌株在他们的地区。100隔离,只有45(45%)显示高层链霉素抗性由阀瓣扩散法和链霉素电性能测试类似于其他研究像Randhawa et al。 17]。报告HLSR 43%。除了盘扩散,CLSI建议两个HLAR检测方法,即琼脂稀释法和肉汤采用。

在不同的研究发现 大肠都有效占更高层庆大霉素、链霉素阻力。在本研究HLGR 大肠都有效显著提高( P 值< 0.05)相比 粪大肠和HLSR 大肠都有效高于 粪大肠但不是统计学意义( P 值> 0.05)。

高层氨基糖苷类耐enterococci是因为生产中氨基糖苷类修饰酶(AMEs)等2′磷酸转移酶、3′磷酸转移酶,6′乙酰转移酶,和6′-adenyltransferase。48 60 HLGR,在我们的研究中,80%,分离株进行双官能AME基因 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)这是符合Padmasini et al。 14],Hasani et al。 1868.4%和100%),报告存在双官能AME基因,分别。其他的研究也表明, aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)是最普遍的基因中耐庆大霉素enterococci [ 19, 20.45 HLSR],而18岁,也就是说,40%,隔离 aph (3′ )iii a。Padmasini et al。 14报道,77% HLSR隔离 aph (3′ )iii a基因。然而 aph (2′′ aph) ib (2′′ )",aph (2′′ )身份证,和 ant (4′ ia)还发现的基因编码高级耐庆大霉素(> 500 g / mL) ( 14没有在我们的研究中发现。

 5。结论

之间的高层庆大霉素耐药率enterococci隔离在这个研究高层链霉素的耐药率为60%,为45%。 大肠都有效和 粪大肠数量几乎相等,但阻力被发现更常见 大肠都有效比在 粪大肠。电性能测试得到的结果类似于阀瓣扩散试验。多重PCR检测艾姆斯基因具有高敏感性和特异性HLAR负责。双官能AME基因 aac (6′ )-Ie-aph (2′′ ia)是主要的基因负责HLAR消除了组合的协同杀菌作用细胞暴露于wall-active代理和一个氨基糖苷类。

 信息披露

目前Vishal雨水的所属国家流行病学研究所(),印度钦奈。当前所属Naveen Grover地中海坳,印度拉达克。目前马哈Kumar的归属部门实验室科学和分子医学,军队医院R & R,德里,印度。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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