快速检测与鉴定yersinia pestis.从食物中使用免疫磁性分离和焦磷酸

摘要

最近在可能使用中续签的兴趣Y. Pestis.，瘟疫的致病因子，作为恐怖分子的生物武器。食物与故意污染的脆弱性联系在通过食用感染的动物获得瘟疫的人类报道，这些动物没有充分烹饪或处理来自受感染的动物的肉可以使用Y. Pestis.在食物中的生物恐怖主义攻击现实中。快速，有效的食物样品制备和检测系统，有助于克服与​​不同矩阵的复杂性相关的问题，并且还可以消除结果中的任何模糊性，这将使能够彻底了解与生物重复蛋白的食物污染。我们开发了一种快速检测测定，结合了使用免疫磁性分离和焦肉测序在产生明确识别的结果时使用Y. Pestis.牛奶(0.9 CFU/mL)、袋装沙拉(1.6 CFU/g)和加工肉类(10 CFU/g)。该方法的低检出限为快速检测和确认提供了一种新的工具Y. Pestis.在不需要营养的食物中。结合使用了我裁剪系统和辐射测序，用于有效捕获和检测Y. Pestis.在食品生物防御方面具有潜在的应用前景。

1.介绍

瘟疫，由yersinia pestis.，引发了三次大流行病，并被认为是人类历史上最具毁灭性的疾病之一[1]．它仍然对人类健康构成了重大威胁，仍然是世界上许多地区的当前威胁，每年报告了约2-3000例[2]．由于易于传播和悬浮在几个国家的瘟疫，最近被分类为重新分泌疾病[3.]．此外，人们对可能的使用也重新产生了兴趣Y. Pestis.作为恐怖分子的生物武器，如果分散为气溶胶，可能会导致大规模伤亡[4]．Y. Pestis.通常是通过动物的跳蚤叮咬，并且这种疾病表现为沸腾，血管血糖或肺炎疫苗[2，5]．然而，人类鼠疫也曾因食用未充分煮熟的受感染动物或因处理受感染动物的肉类而染上[6- - - - - -13]．这些报告表明，人类瘟疫可以通过口咽途径获得，因此构成了显着的公共卫生风险。通过有意的污染美国的沙拉酒吧的食物脆弱的脆弱性鼠伤寒沙门氏菌，这使得更致命的毒剂的使用成为可能，如Y. Pestis.一个可能性14]．对多药耐药菌株的报道加剧了这种担忧[15他们在人口中对生物恐怖主义的潜在用途。为了最大限度地减少这种风险，快速检测系统的开发将能够同时检测和确认存在Y. Pestis.是至关重要的。样品制备和检测系统将有助于克服与不同基质的复杂性相关的问题，并消除结果中的任何歧义，将使人们能够就生物威胁剂污染的食品迅速作出知情决定。

新一代测序平台的最新发展开辟了新的机遇，改变了微生物基因组学及其在病原体检测中的应用方向[16]．基于排序的技术正在变得快速，成本效益，并产生大量的遗传信息，有助于迅速对食源性疾病爆发做出明智的决定。这是最近看到的大肠杆菌在欧洲爆发的疫情中，该菌株在几小时的时间内被测序[17]．它还为病原体的识别提供了一层额外的信心，并为生物防御应用(如食源性生物恐怖主义反应)提供了一个明确的检测系统。焦磷酸测序是一种实时定量监测核苷酸掺入的测序方法，通过在核苷酸掺入过程中释放焦磷酸的酶转化后发出的光[18]．该技术生成类似的数据，以桑格排序，是一种快速，可重复的，高吞吐量，用户友好和成本效益的方法[19]．

我们最近开发了一种免疫磁分离(IMS)方法，用于有效的浓度芽孢杆菌炭疽病来自不同食物基质的孢子[20.使用焦磷酸测定的基于新的基于序列的测定，用于特异性检测和抗微生物抗性基因谱Y. Pestis.［21]．在这里，我们介绍了基于IMS和焦肉测序的应用，以获得快速，特异性和敏感的检测和鉴定Y. Pestis.从牛奶，袋装沙拉和加工肉类等食物基质中提取。这个试验Y. Pestis.检测是通过使用Pathatrix样品制备系统和实时PCR的先前作品的显着改进[22并证明了不经过浓缩步骤的更好的检测限度。高效的免疫磁浓缩生物威胁剂与基于焦序列的检测系统的结合是一种新颖的方法，是首次用于生物威胁剂的检测和鉴定Y. Pestis.在食品中具有潜在的生物防御应用。

2。材料和方法

2．1．细菌培养

yersinia pestis.KIM5-从甘油原液中培养，在Tryptic Soy Agar培养皿(Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)上添加5%羊血(TSBAP)，在28°C下培养48小时。将单个菌落在脑心灌注(Brain Heart Infusion, BHI)培养液中，37°C培养24 h。培养物在BHI中连续稀释，用TSBAP进行枚举，并用于食品和焦磷酸测序实验中的IMS。

2.2。磁珠官能化与抗 -Y. Pestis.抗体

两种类型的不同尺寸和表面化学物质，由市售的Pathatrix珠粒组成（〜1 μm直径，Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)和NRC-beads (300 nm直径，National Research Council，渥太华，ON, Canada)被用于功能化。Pathatrix和NRC磁珠被功能化Y. Pestis.此抗体为兔抗Y. Pestis.（四轮车，罗克维尔，MD，美国）或Y. Pestis.monoclonal Clone# M996145 (Fitzgerald Industries International, Acton, MA, USA)使用Pathatrix定制涂层试剂盒进行轻微修改，浓度为1 mg/mL [20.]．将官能化珠粒调节至终浓度为20mg / mL并在4℃下储存直至使用。

2.3。IMS方法，抗体和免疫磁珠用于捕获的比较Y. Pestis.缓冲蛋白胨水(BPW)

捕获的两种方法Y. Pestis.，Pathatrix自动系统（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）和我CropTheBug系统(FiltaFlex Ltd.， Almonte, ON, Canada)如前所述使用[20.]．比较各机器的捕获效率y. pestis，1 mg兔抗功能化的Pathatrix免疫磁珠(IMBs)Y. Pestis.含有〜5 cfu / ml的50ml BPW（pH7.2）Y. Pestis.混合1小时，之后将珠子从溶液中磁性捕获。两种不同的抗体（单克隆和多克隆）用于官能化病例珠粒并研究敏感性我CropTheBug系统。

用兔子抗的Pathatrix珠子和NRC珠子官能化Y. Pestis.将抗体与与上述抗体比较相同的方式互相进行彼此进行比较。将一毫克的官能化珠与含50ml的BPW混合Y. Pestis.（〜2.5 cfu / ml）和捕获。

所有实验捕获的珠粒在洗涤缓冲液中洗涤3次，在PBS缓冲液中重悬，镀于Tryptic Soy Blood Agar Plates (TSBAPs)上，28℃孵育48 h，进行菌落计数。实验/测定一式三份，一式两份镀制。

2．4．数据分析

IMS实验数据的分析方法是除以总数Y. Pestis.将捕获的细胞总数添加到BPW中，并以回收率表示。总人数Y. Pestis.添加细胞通过在每次运行之前通过制备的制备的储备的板估计测定。根据复制实验的平均结果计算标准偏差。

2.5。尖刺食品样品的制备

全脂牛奶(3.25%的乳脂)、加工肉类(黑森林火腿)和预洗袋装沙拉(长叶莴苣)都是从当地一家杂货店购买的，并如前所述用于食物添加实验[20.]．简要地，Y. Pestis.培养物生长至10的浓度⁷ CFU/mL and serially diluted to 10²-10⁴CFU /毫升。将细胞加入50 mL全脂牛奶中，获得0.1-7 CFU/mL的细胞接种Y. Pestis.．对于固体食物中的细菌捕获，将50克切片的黑森林火腿和50克袋装沙拉分开放入毛巾袋中。用0.3-1150 cfu / g接种样品Y. Pestis.细胞和手按摩以均匀地分布整个食物的细菌。加入50毫升的BPW（1：1稀释w / v），并将混合物用Stomacher 400循环器（Seward Ltd.，West Sussex，UK）饱和。进一步通过海绵过滤器和50的液体 μM不锈钢网过滤器采用真空泵和滤液收集分析。

2．6．IMS的Y. Pestis.来自尖刺的食物样本

在添加食品样品制备后，将50 mL的制备食品样品与1 mg (50μ兔抗体功能化的Pathatrix珠子Y. Pestis.多克隆抗体。将珠子混合并按照我裁剪方法如前所述[20.]．每一种食物基质和细菌浓度的实验都是重复进行的。

2.7。尖刺食品样品的DNA制剂

从不同食物捕获的样品中的DNA的制备如前所述进行[22]．简单地说,50μ通过剧烈涡旋并在95℃下在热循环仪中加热从食物中捕获的珠子样品。在短暂的离心之后，3.5 μ上清液的L用作PCR扩增的模板，然后用焦塞进行分析。PCR引物和反应条件在我们之前的工作中表明[21]．

2.8。焦点正分析

基因组DNA来自Y. Pestis.从食物中分离出来的样本使用我们先前描述的焦磷酸测序分析[21]．简而言之，生物素化的PCR产物与链霉抗生物素蛋白涂覆的琼脂糖珠（GE Healthcare，Piscataway，NJ）结合，然后重新悬浮在含有0.3的退火缓冲液中的珠子 μ测序引物的m。使用基于Pyromark Q24系统的靶序列使用的分配使用Pyro Gold Q24试剂进行焦点。原始数据文件被导入Pyromark Q24软件（版本2.0; Qiagen Inc. [http://www.qiagen.com/products/pyromarkq24.aspx)用于焦磷酸测序后的分析。通过质量检查的序列数据，由软件自动确定，与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）使用遗传中的序列搜索功能（5.3.5版; BioMatters Inc. [http://www.geneious.com/]）验证身份。

3.结果

3．1．Immunomagnetic捕获的Y. Pestis.BPW中的细胞

多克隆抗体显示出更好的恢复Y. Pestis.的效率为46-56%，而单克隆抗体的效率为40-48%(图1(一)）.的我CropTheBug系统显示了更好的恢复y. pestis，与具有26-38％的效率的Pathatrix自动系统相比（图1(一)）.两种念珠的比较表明，Pathatrix念珠的回收率更高Y. Pestis.与NRC珠粒相比(图1 (b)）.兔多克隆抗体功能化的Pathatrix珠子Y. Pestis.抗体，结合了我裁剪方法，显示最敏感的IMB /抗体组合（图1）.

3.2。焦点测序Y. Pestis.从食物中采集的样本

的焦Y. Pestis.从三种不同的食物矩阵捕获的细胞用于靶标YPC4，YPCAF1M1和YPPST1，产生与我们之前报告中观察到的那些相同的读取[21] （数字2）.如前所述，它们产生了爆炸结果Y. Pestis.并由此确认了身份Y. Pestis.．

3.3。食物样本中检测限制

三种食品基质的检测限采用焦磷酸测序法确定(表1）.结果表明，牛奶、袋装沙拉和加工肉类的检出限分别为0.9 CFU/mL、1.6 CFU/g和10 CFU/g。

4.讨论

新型测序技术的出现，例如焦点测序，为生成序列信息提供了有助于检测病原体的工具，并且能够快速确认/识别。通过提供了全基因组序列的可用性，进一步增强了这些新颖工具的使用，该序列提供了前所未有的遗传信息，用于产生诊断应用的特定分子标记。如果精心选择的话可以使用这些标记来区分密切相关的致病菌株，并且可用于食物中微生物污染的特异性检测和鉴定。检测Y. Pestis.在使用实时PCR的食物基质中已经报道了[22然而，检测的限制报告需要进一步改进。食物基质中具有非常低的细菌数的污染潜力需要开发用于从食物基质的有效捕获的方法。目前的工作探索了使用一种新型IMS作为一种有效的捕获方法和焦点测序，用于检测和确认Y. Pestis.直接从食物没有浓缩。

IMS用于有效捕获食物的病原体已得到广泛的关注[22- - - - - -26]．关于捕获和探测的资料有限Y. Pestis.在食品(22因此，需要进一步探索这一点。在最近的出版物中[20.，我们描述了使用我农作物系统作为一种新型免疫抑制方法，用于食物中炭疽孢子的浓度。使用相同的捕获方法，我们研究了使用不同的磁珠和抗体进行捕获Y. Pestis.细胞。在这里，我们表明，最高的捕获效率与使用Pathatrix珠与多克隆抗体组合使用（图1(一)）.这种高捕获效率在观察到的检测限度中反映。珠粒尺寸和不同抗体对捕获效率的影响已经讨论了[20.，27- - - - - -30.]．研究结果表明，即使具有小尺寸的珠子呈现大的表面积到体积比，也可以由于小磁芯而减小捕获效率。因此，Pathatrix珠子（哪个更大）可能具有比NRC珠子更大的磁芯（图1 (b))，从而反映出与这种珠子类型相关的更高的捕获效率。因此，珠粒大小需要权衡;体积过小不利于磁效应，体积过大则会降低捕集效率。在我们之前的研究中B.炭疽病，我们表明，多克隆抗体在捕获炭疽孢子的效率高于单克隆抗体[20.]，然而，在目前的研究中获得的结果Y. Pestis.表明两种抗体的恢复情况是可比较的(图1(一)）.这种差异可能是由于产生抗体所使用的抗原靶点。由于商业和专利问题都不允许披露所使用的抗原靶点，因此缺乏证实这一点的信息。进一步的研究使用Y. Pestis.需要在诸如F1抗原的表面标志物中具有不同突变的菌株来描绘抗体的捕获特异性。

食物很容易被故意污染，美国的沙拉棒也容易被污染鼠伤寒沙门氏菌强调此风险[14]．很少有样品制备方法在检测前不依赖富集。IMB混合和回收系统在IMS中也起着关键作用。两种方法的混合和回收Y. Pestis.比较IMB细胞。Pathatrix Auto系统是目前常用的磁浓缩食品基质中的病原体的方法之一[22，31然而，与...相比，它具有相对较低的恢复我CropTheBug系统(图1）.这与其他研究中看到的情况相似[20.，32]．

焦磷酸测序已被用于几种微生物的检测和分型[33- - - - - -35]．本研究中观察到的焦磷酸读数显示到预期序列的始终如一的高序列同一性，因此增强了作为确认工具的测定的可靠性。典型的跑步在大约60分钟内完成，因此提供了一种基于快速的序列检测方法，具有前所未有的检测限制Y. Pestis.在食源性应用程序(表1)[22]．在本研究中，所有液体基质的检出限为0.4-0.9 CFU/mLY. Pestis.而固体基质在1.6-10 CFU/g之间(表1）.之前在Y. Pestis.在牛奶和碎牛肉中显示出10的检测水平¹CFU/mL牛奶和10²未增肥碎牛肉中的CFU/g [22]．以前的报告显示检测极限是10^3. CFU/mL for the IMS and detection of芽孢杆菌stearothermophilus食物及环境样本的孢子[36，而谢尔兹等人显示恢复B.炭疽病孢子低至1 cfu / ml的食物没有富集。在本研究中显示的测定的低检测限是对使用实时PCR的先前作品的那些重大改善[22]，为快速检测和确认Y. Pestis.在不需要营养的食物中。

这项研究进一步证明焦磷酸测序是一种经过验证的基于序列的识别技术，该技术具有一套前所未有的特性，使其独特地适合生物防御应用，并成为一种强大的工具。与传统的桑格测序技术相比，该技术成本更低、耗时更少、劳动密集，而且更容易执行[19，37]．据我们所知，这是关于使用焦点进行食物样品直接检测的第一个报告。结合使用了我采用焦磷酸测序技术的CropTheBug系统是一种新技术Y. Pestis.在食物中捕获和检测，并为新工具提供了一个新的生物缺点应用层的置信层。

致谢

作者感谢孔凡良的技术帮助。他们也感谢Joseph Hinnebusch博士(NIH, Hamilton, Montana, USA)好意提供Y. Pestis.金5-菌株。作者承认DRS的有用建议。关于手稿的奥利弗肺和索伦阿列德德森。这项工作由加拿大防御研究开发加拿大安全科学，化学，生物，放射，核和爆炸研究技术倡议（CRTI）赠送CRTI 08-0203RD。

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