jpath. 病原体杂志 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi出版公司 781652 10.1155 / 2012/781652 781652 研究文章 快速检测和识别 yersinia pestis.利用免疫磁分离和焦磷酸测序从食物中提取 amoako. Kingsley K. 1 盾牌 迈克尔J. 1 Goji. Noriko. 1 pa 幼儿园 2 托马斯 马修C. 1 Janzen. 蒂莫西W. 1 滨Kingombe Cesar I. 3. 凯尔 阿诺德J. 2 哈恩 克里斯汀R. 1 ukuku. 堤防O. 1 Lethbridge实验室 国家动物疾病中心 加拿大食品检验机构 P.O.盒子640. 乡路9-1 莱斯布里奇 ab 加拿大 T1J 3 z4 ars.usda.gov. 2 新兴技术部门 国家研究理事会 100苏塞克斯驱动器 渥太华 在 加拿大 K1A 0R6 nationalacademies.org 3. 班廷爵士研究中心 健康加拿大 251 Frederick Banting博士爵士 唐尼尼的牧场 渥太华 在 加拿大 K1A 0K9 gc.ca. 2012年 3. 10. 2012年 2012年 01. 06. 2012年 01. 08. 2012年 2012年 版权所有©2012皇冠。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放获取的文章，允许在任何媒体中不受限制的使用、发布和复制，只要原始作品被正确引用。

最近在可能使用中续签的兴趣 Y. Pestis.，瘟疫的致病因子，作为恐怖分子的生物武器。食物与故意污染的脆弱性联系在通过食用感染的动物获得瘟疫的人类报道，这些动物没有充分烹饪或处理来自受感染的动物的肉可以使用 Y. Pestis.在食物中的生物恐怖主义攻击现实中。快速，有效的食物样品制备和检测系统，有助于克服与​​不同矩阵的复杂性相关的问题，并且还可以消除结果中的任何模糊性，这将使能够彻底了解与生物重复蛋白的食物污染。我们开发了一种快速检测测定，结合了使用免疫磁性分离和焦肉测序在产生明确识别的结果时使用 Y. Pestis.从牛奶（0.9 cfu / ml），袋装沙拉（1.6 cfu / g）和加工肉（10 cfu / g）。在该测定中证明的低检测限提供了一种用于快速检测和确认的新型工具 Y. Pestis.在不需要营养的食物中。结合使用 一世裁剪系统和辐射测序，用于有效捕获和检测 Y. Pestis.在食品生物防御方面具有潜在的应用前景。

 1.介绍

瘟疫,造成的 yersinia pestis.，升高了三大大熊病，被认为是人类历史最毁灭性的疾病之一[ 1]．它仍然对人类健康构成了重大威胁，仍然是世界上许多地区的当前威胁，每年报告了约2-3000例[ 2]．由于易于传播和悬浮在几个国家的瘟疫，最近被分类为重新分泌疾病[ 3.]．此外，兴趣已经在可能的使用中更新 Y. Pestis.作为恐怖分子的生物武器，如果分散为气溶胶，可能会导致大规模伤亡[ 4.]． Y. Pestis.通常是通过动物的跳蚤叮咬，并且这种疾病表现为沸腾，血管血糖或肺炎疫苗[ 2那 5.]．然而，人类瘟疫也通过吃没有充分烹饪或通过从受感染动物的肉处理的感染动物来获得[ 6.- 13.]．这些报告表明，人类鼠疫可以通过口咽途径获得，因此对公共卫生构成重大风险。食品的脆弱性已经被美国故意污染的沙拉吧所证明 Salmonella typhimurium.，这使得可能使用更多致命的代理，例如 Y. Pestis.一个潜在可能 [ 14.]．多药抗性菌株的报告加剧了这种担忧[ 15.他们在人口中对生物恐怖主义的潜在用途。为了最大限度地减少这种风险，快速检测系统的开发将能够同时检测和确认存在 Y. Pestis.是必不可少的。样品制备和检测系统将有助于克服与​​不同矩阵的复杂性相关的问题，并且还可以消除结果中的任何模糊性，这将使能够在生物重组污染食物污染的快速明智的决定。

最近的下一代测序平台的发展已经开辟了新的机会，并帮助改变了微生物基因组学的方向及其对病原体检测的应用[ 16.]．基于测序的技术正在变得迅速、具有成本效益，并产生大量的遗传信息，这有助于对食源性疾病暴发迅速作出知情决定。这是最近看到的 大肠杆菌欧洲爆发，其中含有牵连的应变在几个小时的记录时间中测序[ 17.]．它还为鉴定病原体提供了一个额外的置信层，并为食物载生物恐怖主义反应等生物缺陷应用提供明确的检测系统。焦点是一种逐合合成方法，其通过在核苷酸掺入期间释放的催化磷酸盐酶的酶促转化后，定量监测核苷酸的掺入核苷酸的掺入[ 18.]．该技术生成类似的数据，以桑格排序，是一种快速，可重复的，高吞吐量，用户友好和成本效益的方法[ 19.]．

我们最近开发了一种免疫分离（IMS）测定以获得有效浓度 芽孢杆菌炭疽病来自不同食物矩阵的孢子[ 20.使用焦磷酸测定的基于新的基于序列的测定，用于特异性检测和抗微生物抗性基因谱 Y. Pestis.[ 21.]．在这里，我们介绍了基于IMS和焦肉测序的应用，以获得快速，特异性和敏感的检测和鉴定 Y. Pestis.从食物矩阵，如牛奶，袋装沙拉和加工肉。这个试验 Y. Pestis.检测是通过使用Pathatrix样品制备系统和实时PCR的先前作品的显着改进[ 22.并证明了不经过浓缩步骤的更好的检测限度。高效的免疫磁浓缩生物威胁剂与基于焦序列的检测系统的结合是一种新颖的方法，是首次用于生物威胁剂的检测和鉴定 Y. Pestis.在食品中具有潜在的生物防御应用。

 2。材料和方法 2.1。细菌培养

yersinia pestis.Kim5-从胰甘油大豆琼脂板（Difco，Becton Dickinson，Sparks，MD，USA）的甘油库存培养，补充有5％绵羊血液（Tsbap），并在28℃下生长48小时。在37℃下将单个菌落转移到脑心脏输注（BHI）肉汤中培养24小时。在BHI中连续稀释培养物，使用TSBAP列举，并用于食物和焦磷酸盐的IMS。

 2.2。磁珠官能化用抗-<斜体> y。菌</斜体>抗体

两种不同大小和表面化学性质的微珠，包括市售的Pathatrix微珠(~1 μ.M直径，寿命，Carlsbad，CA，USA）和NRC-珠（直径300纳米，国家研究委员会，渥太华，加拿大）用于功能化。通过抗 - 的官能填充和NRC磁珠官能化 Y. Pestis.抗体多克隆兔抗 - Y. Pestis.（四轮车，罗克维尔，MD，美国）或 Y. Pestis.单克隆克隆#m996145（Fitzgerald International，Acton，Ma，USA），使用Pathatrix定制涂装套件的浓度为1 mg / ml，具有微小的修改[ 20.]．将官能化珠粒调节至终浓度为20mg / mL并在4℃下储存直至使用。

 2．3．用于捕获<斜体>y的IMS方法、抗体和免疫磁珠的比较。鼠疫菌</斜体> in缓冲蛋白胨水(BPW)

捕获的两种方法 Y. Pestis.，Pathatrix自动系统（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）和 一世裁剪系统（FiltaFlex Ltd.，Almonte，On Canada），如前所述使用[ 20.]．比较每种机器以获取捕获效率 y. pestis，用兔抗 - 1毫克的Pathatrix免疫磁珠（IMBs）官能化。 Y. Pestis.含有〜5 cfu / ml的50ml BPW（pH7.2） Y. Pestis.混合1小时，之后将珠子从溶液中磁性捕获。两种不同的抗体（单克隆和多克隆）用于官能化病例珠粒并研究敏感性 一世裁剪系统。

用兔子抗的Pathatrix珠子和NRC珠子官能化 Y. Pestis.将抗体与与上述抗体比较相同的方式互相进行彼此进行比较。将一毫克的官能化珠与含50ml的BPW混合 Y. Pestis.（〜2.5 cfu / ml）和捕获。

将所有实验的捕获的珠子在洗涤缓冲液中洗涤3次，重悬于PBS缓冲液中，在胰蛋白酶血液琼脂平板（TSBAPS）上铺设，并在28℃下孵育48小时以进行菌落枚举。实验/测定以一式三份进行，并一式两份地镀。

 2.4。数据分析

用于IMS试验的数据除以总数分析 Y. Pestis.通过添加到BPW的细胞总数捕获的细胞，并表示为恢复百分比。总数 Y. Pestis.添加的细胞是通过在每次运行前的备料平板计数来确定的。根据重复实验的平均结果计算标准偏差。

 2.5。尖刺食品样品的制备

全牛奶（3.25％牛奶脂肪），加工的肉（黑色森林火腿）和采购袋装沙拉（Romaine Lettuce）购自当地杂货店，并用于前面描述的食品尖峰实验[ 20.]．简要地， Y. Pestis.培养物生长至10的浓度7. CFU/mL and serially diluted to 102-104. CFU/mL. Cells were added to 50 mL of whole milk to achieve a cell inoculation of 0.1–7 CFU/mL of Y. Pestis.。对于固体食物中的细菌捕获，将50克切片的黑森林火腿和50克袋装沙拉分开放入毛巾袋中。用0.3-1150 cfu / g接种样品 Y. Pestis.细胞和手按摩以均匀地分布整个食物的细菌。加入50毫升的BPW（1：1稀释w / v），并将混合物用Stomacher 400循环器（Seward Ltd.，West Sussex，UK）饱和。进一步通过海绵过滤器和50的液体  μ.使用使用真空泵和滤液的M不锈钢网眼过滤器进行分析。

 2.6。<italic> y的ims。Pestis </ Italic>来自尖刺食品样本

在制备尖刺食品样品后，将50ml制备的食品样品与1毫克混合（50℃  μ.l）用兔子官能化的Pathatrix珠子 Y. Pestis.多克隆抗体。这些珠子是混在一起并被捕获的 一世裁剪方法如前所述[ 20.]．涉及每个食物基质和细菌浓度的实验一式两份完成。

 2.7。从添加的食物样本中提取DNA

从不同食物捕获的样品中的DNA的制备如前所述进行[ 22.]．简而言之，50  μ.通过剧烈涡旋并在95℃下在热循环仪中加热从食物中捕获的珠子样品。在短暂的离心之后，3.5  μ.上清液的L用作PCR扩增的模板，然后用焦塞进行分析。PCR引物和反应条件在我们之前的工作中表明[ 21.]．

 2.8。焦点正分析

基因组DNA来自 Y. Pestis.从食物中分离出来的样本使用我们先前描述的焦磷酸测序分析[ 21.]．简而言之，生物素化的PCR产物与链霉抗生物素蛋白涂覆的琼脂糖珠（GE Healthcare，Piscataway，NJ）结合，然后重新悬浮在含有0.3的退火缓冲液中的珠子  μ.测序引物的m。使用基于Pyromark Q24系统的靶序列使用的分配使用Pyro Gold Q24试剂进行焦点。原始数据文件被导入Pyromark Q24软件（版本2.0; Qiagen Inc. [ http://www.qiagen.com/products/pyromarkq24.aspx.)用于焦磷酸测序后的分析。通过质量检查的序列数据，由软件自动确定，与GenBank数据库( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）使用遗传中的序列搜索功能（5.3.5版; BioMatters Inc. [ http://www.geneious.com/]）验证身份。

 结果 3.1。<斜视> y的免疫磁捕获。BPW中的Pestis </斜体>细胞

多克隆抗体显示出更好的恢复 Y. Pestis.，效率为46-56％，与40-48％的单克隆抗体相比（图 1（a））.这 一世庄稼系统显示出更好的恢复 y. pestis，与具有26-38％的效率的Pathatrix自动系统相比（图 1（a））.两种念珠的比较表明，Pathatrix念珠的回收率更高 Y. Pestis.细菌细胞比NRC珠子（图 1（b））.与多克隆兔抗的官能化珠子 Y. Pestis.抗体，结合了 一世裁剪方法，显示最敏感的IMB /抗体组合（图 1）.

不同恢复方法，抗体和免疫磁珠进行恢复的比较 Y. Pestis.。（a）与多克隆和单克隆抗体官能化的病程珠比进行比较 Y. Pestis.恢复使用 一世裁剪。这 一世将裁剪和Pathatrix自动系统进行比较，用于使用用多克隆抗体官能化的Pathatrix珠子恢复。（b）使用具有多克隆抗体官能化的病程胎珠和NRC珠粒使用 一世裁剪。

3.2。<italic> y的焦点正版。菌</斜体>样品从食品捕获

焦点测序 Y. Pestis.从三种不同的食物矩阵捕获的细胞用于靶标YPC4，YPCAF1M1和YPPST1，产生与我们之前报告中观察到的那些相同的读取[ 21.)(图 2）.如前所述，它们产生了爆炸结果 Y. Pestis.因此证实了鉴定 Y. Pestis.。

Pyrosequence比对从 Y. Pestis.与食物样本隔离。发酵杆菌读取 Y. Pestis.包括YPC4（染色体），YPPST1（PPCP1质粒）和YPCAF1M-1（PMT1质粒）的靶标显示，来自牛奶，火腿和沙拉样品的检测限。

 3.3。食物样本中检测限制

三种食品基质的检测限采用焦磷酸测序法确定(表 1）.这些结果分别表示0.9cfu / ml，1.6 cfu / g和10 cfu / g的检测限，分别用于牛奶，袋装沙拉和加工肉。

检测限制 y。 Pestis.Kim5-在实验接种的食物基质中使用IMS和焦肌。

样本矩阵 YPC4. yppst1 YPCAF1M1
BPW（CFU / ml） 0.4 0.4 0.4
牛奶（CFU / ml） 0．9 0．9 0．9
沙拉（CFU / G） 1.6 1.6 1.6
火腿（CFU / G） 10. 10. 10.
4。讨论

新型测序技术的出现，例如焦点测序，为生成序列信息提供了有助于检测病原体的工具，并且能够快速确认/识别。通过提供了全基因组序列的可用性，进一步增强了这些新颖工具的使用，该序列提供了前所未有的遗传信息，用于产生诊断应用的特定分子标记。如果精心选择的话可以使用这些标记来区分密切相关的致病菌株，并且可用于食物中微生物污染的特异性检测和鉴定。检测 Y. Pestis.在食物基质中使用实时荧光定量PCR的研究已经有报道[ 22.然而，检测的限制报告需要进一步改进。食物基质中具有非常低的细菌数的污染潜力需要开发用于从食物基质的有效捕获的方法。目前的工作探索了使用一种新型IMS作为一种有效的捕获方法和焦点测序，用于检测和确认 Y. Pestis.直接从食物没有浓缩。

IMS用于有效捕获食物的病原体已得到广泛的关注[ 22.- 26.]．关于捕获和探测的资料有限 Y. Pestis.在食物[ 22.因此，需要进一步探索这一点。在最近的出版物中[ 20.，我们描述了使用 一世农作物系统作为一种新型免疫抑制方法，用于食物中炭疽孢子的浓度。使用相同的捕获方法，我们研究了使用不同的磁珠和抗体进行捕获 Y. Pestis.细胞。在这里，我们表明，最高的捕获效率与使用Pathatrix珠与多克隆抗体组合使用（图 1（a））.这种高捕获效率在观察到的检测限度中反映。珠粒尺寸和不同抗体对捕获效率的影响已经讨论了[ 20.那 27.- 30.]．研究结果表明，即使小尺寸的磁珠具有较大的比表面积和体积比，但由于磁芯较小，捕获效率可能会降低。因此，Pathatrix珠(更大)可能比NRC珠具有更大的磁芯(图 1（b）因此，反映了与该珠粒类型相关的捕获效率。因此，珠子尺寸有折衷;太小对磁效果有害，而过大似乎有一些降低的捕获效率。在我们以前的研究中 炭疽杆菌，我们发现多克隆抗体在捕获炭疽孢子方面比单克隆抗体的效率要高得多[ 20.然而，在目前的研究中获得的结果 Y. Pestis.表明与两种抗体相关的回收率是可比的（图 1（a））.差异可能是由于用于产生抗体的抗原靶。证明这一点的信息缺乏，因为它们都是商业和专有问题，不允许披露使用的抗原靶标。进一步的研究使用 Y. Pestis.需要在F1抗原等表面标记物上具有不同突变的菌株来描述抗体的捕获特异性。

食物很容易受到故意污染的污染和美国沙拉酒吧的污染 Salmonella typhimurium.突出危险[ 14.]．在检测之前，有很少的样品制备方法不依赖于富集。IMB混合和恢复系统也在IMS中发挥着关键作用。混合和恢复的两种方法 Y. Pestis.比较了具有IMB的细胞。Pathatrix Auto System是目前来自食物矩阵的磁浓度的常用方法之一[ 22.那 31.，然而，它的恢复相对较低 一世CropTheBug系统(图 1）.这与其他研究中看到的情况相似[ 20.那 32.]．

焦肉测序已被用于检测和打字几种微生物[ 33.- 35.]．本研究中观察到的焦磷酸读数显示到预期序列的始终如一的高序列同一性，因此增强了作为确认工具的测定的可靠性。典型的跑步在大约60分钟内完成，因此提供了一种基于快速的序列检测方法，具有前所未有的检测限制 Y. Pestis.在食品载体中（表 1）[ 22.]．In this study, all liquid matrices showed detection limits of 0.4–0.9 CFU/mL Y. Pestis.而固体基质在1.6-10 CFU/g之间(表 1）.以前的工作完成了 Y. Pestis.牛奶和碎牛肉的检测水平为101 CFU/mL in milk and 102 CFU/g in ground beef without enrichment [ 22.]．以前的报告表明检测限是103.CFU/mL用于IMS和检测 芽孢杆菌嗜热嗜热疗法来自食物和环境样本的孢子[ 36.[盾牌等。显示恢复 炭疽杆菌孢子低至1 CFU/mL，从食物中不富集。本研究中显示的检测下限较低，与我们之前使用实时荧光定量PCR的方法相比有了显著的改进[ 22.]，为快速检测和确认 Y. Pestis.在不需要营养的食物中。

这项研究进一步证实，焦磷酸测序是基于序列的识别和technologyhas前所未有的一系列属性，使得它特别适合于和，生物防御应用十分强大的工具，一个成熟的技术。该技术较便宜，耗时和劳动密集，以及比传统的桑切尔测序更容易执行[ 19.那 37.]．据我们所知，这是第一份使用焦磷酸测序技术直接检测食品样品的报告。结合使用 一世具有焦点测序的裁剪系统是新颖的 Y. Pestis.在食物中捕获和检测，并为新工具提供了一个新的生物缺点应用层的置信层。

 致谢

作者感谢Fanliang Kong的技术援助。他们还感谢Joseph Hinnebusch（NIH，Hamilton，Montana，USA）的Joseph Hinnebusch博士，请诚挚地提供 Y. Pestis.金5-菌株。作者承认DRS的有用建议。关于手稿的奥利弗肺和索伦阿列德德森。这项工作由加拿大防御研究开发加拿大安全科学，化学，生物，放射，核和爆炸研究技术倡议（CRTI）赠送CRTI 08-0203RD。

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