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娜娜孟,赵,春和史,雷州夏, ”抑制人类视网膜母细胞瘤细胞的差别,对这些基因的进展MMP-2 / MMP-9使用短发卡rna(成分)体外”,眼科学杂志》, 卷。2020年, 文章的ID4912347, 10 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/4912347
抑制人类视网膜母细胞瘤细胞的差别,对这些基因的进展MMP-2 / MMP-9使用短发卡rna(成分)体外
娜娜孟
,1,2
智赵,1,2
春和史,1
和
雷州夏3
1眼科学系、附属人民医院、江苏大学、镇江212002年,中国
2镇江Kangfu眼科医院,212002年镇江,中国
3附属人民医院普通外科学系,212002年镇江,江苏大学,中国
文摘
客观的。调查的效果表达下调基质金属蛋白酶(MMPs)基因增殖,细胞凋亡、细胞周期、迁移和入侵人类的视网膜母细胞瘤(RB)细胞株体外。方法。小发夹RNA(成分)针对MMP-2 / MMP-9设计并转染成WER1-Rb-1细胞。转染后48小时,存在和免疫印迹技术被用来研究MMP-2的抑制作用和MMP-9成分。细胞生存能力检查了3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。细胞周期阻滞使用流式细胞分析仪检测细胞凋亡检测时膜联蛋白V /π工具包。Transwell室试验进行检测WER1-Rb-1细胞的迁移和入侵的能力。结果。转染后MMP-2 / MMP-9成分,显著降低mRNA和蛋白表达的shRNA组相比,消极和矢量控制。MTT试验的结果表明,细胞生存能力显著减少shRNA组( )。细胞凋亡也显著增加shRNA组较消极和矢量控制( )。流式细胞分析仪分析证明,G1期的比例增加,G0期的比例显著降低的转染MMP-2 / MMP-9成分( )。迁移和入侵能力也显著减少组MMP-2 / MMP-9成分( )。结论。细胞生存能力、迁移和入侵RB细胞抑制的能力,和细胞凋亡诱导的差别后,对这些MMP-2 / MMP-9通过RNA干扰。MMP-2和MMP-9 RB基因治疗的潜在目标。
1。介绍
发展的不成熟细胞视网膜、视网膜母细胞瘤(RB)作为主要最常见的眼内恶性肿瘤的童年,是一种罕见的眼部恶性肿瘤1- - - - - -3)的发病率全世界大约1/15,000 - 20000活产(4]。如果早期诊断,RB等合理治疗可以有效地治疗静脉化疗和局部治疗(激光冷冻疗法)。然而,最先进的情况下将参与一个遥远的侵犯或转移由于有限的可用的诊断方法,这可能导致死亡率升高(5]。因为RB的治疗主要是针对生存和全球救助和视力的保护是次要的目标,是一个重要的需要开发新的靶向治疗减少RB的浸润和转移。
基质金属蛋白酶(MMPs)可以降低基膜,这是一个关键的一步在肿瘤入侵和远处转移6]。基质金属蛋白酶属于一个家庭的锌ion-dependent肽链内切酶其中MMP-2和MMP-9被认为是必不可少的降解细胞外基质(ECM)的主要组件(7]。最近,MMP-2的高表达和MMP-9已被证实在各种恶性肿瘤,包括胰腺癌(8)、口腔鳞状细胞癌(9],宫颈癌[10),和RB (11- - - - - -13]。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)负责调节基质金属蛋白酶的酶的活动(14]。的差别,对这些MMP-2 / MMP-9基因的表达可能是有利于抑制RB的发展和入侵。然而,研究如何抑制RB细胞MMP-2 / MMP-9基因沉默是有限的。在目前的研究中,MMP-2 / MMP-9基因的表达被小发夹RNA表达下调(成分)来研究其影响RB细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、迁移和入侵,而且探索阻断MMP-2的潜在临床意义和MMP-9基因表达作为一种抗肿瘤治疗的目标。
2。材料和方法
2.1。视网膜母细胞瘤细胞
WER1-Rb-1人类RB细胞系,购自上海生命科学研究院细胞银行(上海,中国)。rpmi - 1640年所有细胞培养介质(美国纽约Gibco,大岛)10%胎牛血清(σ的边后卫,圣路易斯,密苏里州,美国),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升,维持在37°C / 5%的股份有限公司2。每3天中被改变,细胞亚文化每2 - 3天,每天观察。
2.2。沉默MMP-2 / MMP-9 WER1-Rb-1细胞中表达
抑制MMP-2 / MMP-9 RB细胞中表达,一个强大的gene-specific沉默技术利用RNA干扰(RNAi)机制使用。sequence-verified质粒向量(很多GFP雪茄烟)基于短发卡RNA图书馆针对人类MMP-2 / MMP-9 (MMP-2 / MMP-9-shRNA)购买GenePharma有限公司(上海,中国)。短发卡rna(成分)加工成siRNAs细胞,导致特定损失的有效MMP-2 / MMP-9基因的功能。在转染实验,WER1-Rb-1细胞被播种到24-well板和培养rpmi - 1640年没有抗生素。然后,转染了使用Lipofectamine 2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。
2.3。RNA提取和定量实时PCR(存在)
总RNA与试剂盒从WER1-Rb-1细胞分离试剂(Ambion)根据制造商的协议。使用M-MLV1逆转录工具包(豆类,大连,中国),相反总RNA转录cDNA、然后量化与环球SYBR绿色Ι检测化验(Bioteke公司)使用一个应用生物系统公司7900 HT系统(Funglyn生物技术公司)。本研究中使用的引物如下:MMP-2, 5-TGATGGCATCGCTCAGATCC-3 5-GGCCTCGTATACCGCATCAA-3;MMP-9, 5-GGACAAGCTCTTCGGCTTCT-3 5-TCGCTGGTACAGGTCGAGTA-3;GAPDH、5-CTCCTCCTGGCCTCGCTGT-3 5-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3。
2.4。西方墨点法
WER1-Rb-1细胞收获和细胞溶解里帕缓冲区(Beyotime、江苏、中国)。蛋白质浓度测定BCA蛋白质化验设备(Beyotime)根据制造商的指示。蛋白质分离使用12% SDS-polyacrylamide凝胶和从凝胶转移到硝化纤维膜。膜被封锁5%脱脂牛奶然后暴露于以下主要抗体:MMP-2 (sc - 13594 1: 1000年,Santa Cruz), MMP-9 (sc - 6841 1: 1000年,Santa Cruz),和anti-GAPDH (sc - 365062 1: 1000年,Santa Cruz)。TBST墨迹冲洗了0.1%,孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭相应二级抗体(1:5000)在室温下1 h。GAPDH是用作控制和所有的抗体购自圣克鲁斯生物技术。
2.5。细胞生存能力
5-Dimethylthiazol-2-yl 3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析应用于确定细胞的可行性。总之,3103转染WER1-Rb-1细胞被镀成96 -孔板和培养24 - 72 h。在指定的时间,20μl MTT的解决方案(3毫克/毫升,Beyotime)被添加到每个,紧随其后的是一个额外的文化4 h。中被删除,和150年μSigma-Aldrich l二甲亚砜(DMSO)被添加到每个对肝癌和溶解甲瓒晶体。光密度(OD)检测的波长490 nm使用酶标仪(美国沃尔瑟姆热科学)。
2.6。细胞周期分布和凋亡的分析
WER1-Rb-1细胞收获和PBS转染48 h后洗。然后,5104细胞被resuspended在200年μ包含5 l的绑定缓冲μl的膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和5μl (propidium碘(π)。细胞周期进行测试使用一个FACS-Calibur™流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)和被CellQuest分析软件(BD生物科学)。细胞凋亡测定的膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(Beyotime)。数据分析与FlowJo v5.7.2软件(BD生物科学)。
2.7。迁移和入侵检测
Transwell室是用于执行迁移和入侵检测。基底膜基质用于预涂膜transwell模拟矩阵屏障的入侵检测。日志中的转染细胞生长阶段被播种上香槟色的密度1105细胞/。刺激细胞入侵,600年μl中添加了20%的边后卫是众议院。孵化24小时后,细胞迁移到众议院与多聚甲醛固定30分钟和沾0.1%结晶紫为15 - 30分钟。细胞与倒置显微镜拍摄的图像(奥林巴斯)×100放大,和细胞数量统计五个随机领域/膜。
2.8。统计分析
GraphPad棱镜6 (GraphPad软件公司、圣地亚哥、钙、美国)软件应用统计分析。对比双尾学生的组织进行了分析t以及或单向方差分析。一个值< 0.05被认为是在所有分析具有统计学意义。所有数据被表示为均值±SEM(平均数标准误差)从至少三个独立的实验,表明重要性评分( ; ; ; )图中传说。
3所示。结果
3.1。MMP-2 / MMP-9通过RNA干扰在WER1-Rb-1细胞表达下调
MMP-2 / MMP-9的shRNA序列融合与绿色荧光蛋白(GFP)的互补利用质粒在这项研究中。因此,转染WER1-Rb-1细胞荧光显微镜下表现出强烈的绿色荧光,而对照组没有荧光(图1(一))。此外,最重要的时间点转染效果是本研究转染后48小时。得到最佳的RNA干扰效果,三个不同的序列定位MMP-2 / MMP-9构造,分别(MMP-2: CCCTTCTTGTTCAATGGCA、ACACTAAAGAAGATGCAGA AGGTGATCTTGACC-AGAAT;MMP-9: CCGAGCTGACTCGACGGTG TGGTGCGCTACCACCTCGA ACGC-ACGACGTCTTCCAGT)。调查MMP-2 / MMP-9 WER1-Rb-1细胞表达与不同的成分,转染后存在。如数据所示1 (b)和1 (c),shRNA-1 MMP-2 (shMMP2-1)和shRNA-2 MMP-9 (shMMP9-2)是最有效的。此外,我们得到了一致的结果的表达式MMP-2 / MMP-9蛋白质从世行转染后(图1 (d))的结果。同时,信使rna和蛋白质水平的MMP-2 / MMP-9几乎相同的对照组和向量组(数据之间的关系1 (b)- - - - - -1 (d))。因此,shMMP2-1和shMMP9-2选择进一步的实验。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。Downregulation MMP-2 / MMP-9抑制WER1-Rb-1细胞生存能力
MTT试验表明,细胞生存能力在任何没有区别显示对照组和向量组之间的时间点,这表明空白向量没有对细胞增殖的影响。MMP-2 / MMP-9通过差别不过,对这些基因的shRNA转染显著降低了WER1-Rb-1细胞生存能力(24 h,向量和shMMP-2 / shMMP-9, ;48 h,向量和shMMP-2 / shMMP-9,两个;72 h,向量与shMMP-2 / shMMP-9, ;图2(一个))。此外,抑制率MMP-2 / MMP-9转染后出现时间的方式来增加(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。抑制MMP-2 / MMP-9影响WER1-Rb-1细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡增加
流式细胞仪进行确定的影响表达下调MMP-2 / MMP-9 WER1-Rb-1细胞的细胞周期。如图3(一个)和3 (b)向量转染不影响细胞周期,而转染shMMP-2 / shMMP-9 48小时后显著降低G1期细胞的比例与向量组(向量与shMMP-2,相比 ;向量与shMMP-9, )。同时,G2期细胞的比例显著提高转染后48小时(向量与shMMP-2, ;向量与shMMP-9, ;数据3(一个)和3 (c))。此外,流式细胞仪分析显示,细胞凋亡率的影响在向量组与对照组相比,虽然击倒MMP-2 / MMP-9显著增加细胞凋亡率(向量与shMMP-2, ;向量与shMMP-9, ;数据4(一)和4 (b))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.4。MMP-2 / MMP-9击倒抑制WER1-Rb-1细胞的迁移和入侵
检测的效果MMP-2 / MMP-9 WER1-Rb-1细胞迁移和入侵,transwell化验。数据5(一个)和5 (b)证明WER1-Rb-1细胞转染MMP-2 / MMP-9成分显著抑制细胞迁移能力(向量与shMMP-2, ;向量与shMMP-9, )。同样,我们有平行的结果减少MMP-2 / MMP-9成分转染后细胞入侵能力(向量与shMMP-2, ;向量与shMMP-9, ;数据5 (c)和5 (d))。正如所料,没有差别的细胞之间的迁移和入侵阴性对照组和向量组。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
摘出术是关键的治疗眼内RB (1),已被证明是一个单边RB病例的治疗标准。目前,越来越多的先进的RB的新管理层正在测试最小化摘出术,因为儿童生存的需要仍然是优先级最高的治疗目标并迅速去除影响眼球肿瘤显示了减少潜在的风险传播(1,2,15]。肿瘤的扩散和转移的发病机制涉及一系列复杂的步骤,其中ECM的降解应该是关键性的一年(16,17]。基质金属蛋白酶是主要的蛋白酶,负责在基膜和ECM降解大部分的蛋白质。ECM组件中,白明胶酶A和B白明胶酶主要降解凝胶和几种类型的基底膜胶原蛋白与MMP-2和MMP-9密切正相关,分别为(18]。除了ECM的变性,MMP-2 MMP-9也影响依从性和运动性的肿瘤细胞(19]。长H的研究表明,MMP-2的表达和MMP-9与视神经入侵密切相关,临床阶段的RB,暗示抑制MMP-2和MMP-9将有利于RB的入侵和转移12]。
先前的研究已经证明,MMP-2和MMP-9出现在RB细胞,和RB组织中表达水平显著高于正常视网膜(7,11- - - - - -13]。在这项研究中,我们处理的效果表达下调MMP-2 / MMP-9基因增殖,细胞凋亡,细胞周期,迁移和入侵WER1-Rb-1细胞系。除此之外,我们可以画,RB属性的减少细胞增殖凋亡率升高的细胞周期和细胞凋亡分析的结果。我们所知,我们第一次击倒MMP-2 / MMP-9 RB细胞体外稳定的shRNA基因沉默技术,它不同于韦伯等人2017年的研究(13]。在过去的几十年,核糖核酸干扰(RNAi)已成为一个令人信服的工具在哺乳动物细胞基因沉默的函数。RNAi技术中,成分可以应用于生成可拆卸的稳定细胞系,免去了重复的转染和显著提高结果的再现性与小干扰rna (siRNAs) [20.]。与一些先前的报道一致12,13),我们的研究结果也表明,细胞生存能力,迁移,RB细胞和入侵能力被抑制,和RB细胞的凋亡诱导MMP-2 / MMP-9差别由于对这些建议MMP-2和MMP-9可能防止RB的恶化的潜在目标。
然而,目前的研究仍然有其局限性。的分子机制MMP-2 / MMP-9施加其影响RB肿瘤细胞的生物学行为并不在本研究中发现。得到更深的理解MMP-2 / MMP-9影响RB,字符串数据库(11.0版)是应用于探索潜在的蛋白质相互作用(PPI)。PPI网络演示的数据6(一)和6 (b),许多蛋白质(详细图传说中描述)与MMP-2 / MMP-9密切相关。此外,可能coexpression共存、代谢途径和信号转导途径与其他蛋白质MMP-2 / MMP-2从数据库中获得。
(一)
(b)
的差别综上所述,我们的研究结果显示,对这些MMP-2 / MMP-9诱发细胞凋亡和损害可行性,移民,和RB肿瘤细胞入侵,RB患者提供一个潜在的MMP的目标治疗。
缩写
| ECM: | 细胞外基质 |
| 流式细胞仪: | Fluorescence-activated细胞分类 |
| MMP的: | 基质金属蛋白酶 |
| 麻省理工: | (3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子 |
| PPI: | 蛋白质相互作用 |
| RB: | 视网膜母细胞瘤 |
| RNA: | 核糖核酸 |
| rt - pcr: | 逆转录聚合酶链反应 |
| 成分: | 小发夹RNA |
| 核: | 小干扰RNA |
| 白平衡: | 西方墨点法。 |
数据可用性
所有生成的数据或分析在这个研究包含在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
NNM LZX, ZZ设计研究;NNM和ZZ进行实验和贡献同样这项工作;CHS LZX分析实验数据;NNM、ZZ和LZX写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢那些参与了这项研究。
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