文摘

背景。Ai-Tong-An-Gao-Ji (ATAGJ)已经被广泛应用于急性骨癌疼痛治疗有一个令人满意的疗效,但具体机制尚不清楚,需要进一步调查。方法。重叠基因ATAGJ和CIBP获得SwissTargetPrediction网站和GeneCards数据库提出了维恩图。网络图的drug-component-target进一步建立使用Cytoscape 3.6.0软件。非瑟酮沃克256细胞增殖的影响被克隆形成试验和EDU试验,观察到非瑟酮之间的交互和AKT使用免疫沉淀反应试验了。非瑟酮对AKT的影响/ HIF-1α在沃克256个细胞信号通路最终用免疫印迹检测和qPCR化验。结果。非瑟酮关键组件和核心目标基因AKT是解决使用drug-component-target网络与非瑟酮之间的结合能和AKT不到−5千卡每摩尔。克隆形成试验和EDU试验表明,非瑟酮显著抑制沃克256个细胞的扩散。免疫沉淀反应试验结果表明,非瑟酮和AKT AKT / HIF-1水平下降α沃克256细胞的信号通路。结论。沃克ATAGJ的非瑟酮能显著抑制256细胞,和机制可能非瑟酮和AKT紧密联系在一起。此外,非瑟酮p-AKT水平下降和抑制AKT / HIF-1的表达α信号通路。

1。介绍

是治疗癌症的技术进步,癌症患者的五年生存率已显著改善。然而,癌症骨痛(CIBP)正在进行和困扰患者严重,大大降低了他们的生活质量(1,2]。大量研究显示,55%的癌症患者和66%的晚期,患者转移,或者终端疾病受害者CIBP [3]。

CIBP代表最常见的癌症患者的疼痛。大约三分之二的晚期癌症患者骨转移倾向,这被认为是癌症疼痛的常见原因(4- - - - - -6]。目前,大多数CIBP治疗策略着重于阿片类药物,放疗和化疗7]。不幸的是,奥巴马政府阿片类药物引起严重的副作用,这常常变弱的治疗效果和癌症患者的生活质量。一群基于中医的治疗方法包括内部管理煎煮,外部应用程序,和针灸对癌症疼痛治疗取得了满意的临床效果。这些治疗方法的优势快速爆发,安全、无毒副作用,和容易接受患者(8,9]。

ATAGJ充当有效准备CIBP管理和ATAGJ的主要组件包括冰片,脊柱gleditsiae, pillworm,粪便trogopterori, resina天龙星座的,和精液strychni。包含在脊柱gleditsiae复合非瑟酮,它已被证明在抗肿瘤方面发挥作用通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,调节肿瘤细胞迁移(10- - - - - -13]。

低氧诱导因子- 1α(HIF-1α)是一个转录因子在一个广泛的出现在哺乳动物和人类在低氧水平。它对缺氧组织细胞通过提高低氧诱导基因的表达,代表适应缺氧的关键环节。HIF-1α蛋白高表达在大多数肿瘤组织和相应的转移。一种蛋白激酶通路是HIF-1的监管途径α。一种蛋白激酶主要调节HIF-1的变化α蛋白质(14- - - - - -16]。

我们预测活性成分和相关癌症疼痛的目标使用药膏在网络药理学的方法。活性成分的目标和目标基因的CIBP重叠识别核心目标;去分析和KEGG通路富集随后进行。的主要组件和核心目标是选择分子对接。此外,非瑟酮是否采取了沃克256细胞的增殖和迁移进行了克隆,EDU, transwell实验,在一种蛋白激酶/ HIF-1非瑟酮的影响α信号通路沃克256个细胞进行了免疫印迹和qPCR化验。

2。方法

2.1。实验草药配方

ATAGJ由冰片(BP)、脊柱gleditsiae (ZJC) pillworm (SF)、粪便trogopterori (WLZ) resina天龙星座的(XJ)和精液strychni (MQZ)。ATAGJ管理包括低剂量(10 g / d),中等(20 g / d),和高剂量(30 g / d)。雌性SD大鼠作为实验动物,他们被随机分为5组:一个虚假的组,模型组、低剂量ATAGJ集团中等剂量ATAGJ组,高剂量ATAGJ组,每组10个老鼠。建模过程描述如下:沃克256乳腺癌细胞系细胞被选为模型。老鼠用0.3%戊巴比妥钠麻醉(100 ml / g)。白色的髌韧带被暴露在皮肤上。的上部的白色髌韧带胫骨不如右后肢穿孔。渗透到骨髓腔后,4μL沃克256细胞悬液的浓度4×104细胞/毫升注入模型组。较低的老鼠管理(10 g /天),中等(20克/天),高剂量(30克/天)的ATAGJ 10 h和持续了14 d。

2.2。细胞培养和治疗

沃克256乳腺癌细胞系选择使用89%高葡萄糖中含有各种氨基酸和葡萄糖(H-DMEM高葡萄糖鹰杜尔贝科的修改中)+ 10%胎牛血清(的边后卫)+ 1%青霉素和链霉素(P / S) (17]。

文化条件设定在37°C, 95%的空气,和5%的二氧化碳。这些细胞与非瑟酮治疗(10μ米,20μ米,30μ米)、顺铂(5μ米)的阳性对照组24 h。

2.3。网络药理学分析

基于网络药理学的原则,ATAGJ的主要组件和目标预测。ATAGJ的活性成分(BP, ZJC,科幻,WLZ XJ,和MQZ)从TCMSP发现网站(https://tcmspw.com/tcmsp.php)。相关的目标是预测和出口SwissTargetPrediction网站。人类CIBP收集相关基因的基因疾病数据库,PPI蛋白质相互作用网络图构造使用字符串,和图drug-component-target成立网络使用Cytoscape 3.6.0软件。去分析和KEGG通路富集进行92目标Cytoscape ClueGO,最终和富集分析结果可视化。

2.4。分子对接

非瑟酮的3 d结构从TMMSP获得最初的网站。与此同时,三维结构的关键目标AKT和VEGFA收集从蛋白质数据银行(https://www.rcsb.org/pdb)。的AutoDock 4.2.6软件使用氢化受体蛋白质和计算费用处理。受体蛋白质之间的分子对接和配体小分子随后由AutoDock七弦琴1.1.2。确认是通过对接和结合能得分。最好的结合能获得和分析。PyMOL用于可视化受体之间的相互作用蛋白质和配体小分子。

2.5。爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)

每组大鼠的佩恩表的编制者是评估每7天。在这个过程中,老鼠放到一个有机玻璃笼子里配备了金属屏幕底部5分钟。中央皮肤后老鼠的爪子在成型端垂直刺激与冯·弗雷纤毛机械刺激探针,纤毛弯曲,老鼠有爪收缩反射。如果没有爪收缩反射,更强烈的纤毛取代机械刺激探针。从0.6克开始,每个5倍强度的刺激和机械刺激间隔15秒。最低纤毛虫刺激探针强度被记录为佩恩表的编制者的上限15.0 g当3爪收缩反射发生在5测试(18]。

2.6。Transwell化验

Transwell试验进行评估细胞入侵的能力。6×10的细胞4最初,后跟一个周期的洗涤与PBS和resuspended 200毫升的无血清培养基。上层Transwell室预镀前基底膜基质细胞补充。同时,众议院是补充中含有10%的边后卫在5%孵化有限公司2在37°C 24 h,其次是增加4%多聚甲醛(PFA)固定15分钟并使用结晶紫染色3分钟。量化最终使用Axio成像仪A2。

2.7。克隆形成实验

细胞1×103种植在每个6-well板块和培养在37°C的5%股份有限公司214 d。每3天中被刷新。两个周期后洗涤细胞的殖民地用PBS,细胞与4%多聚甲醛固定30分钟之前沾0.1%结晶紫为20分钟。细胞克隆是一式三份三次。

2.8。EdU化验

执行EdU化验,沃克256细胞接种24-well板。EdU工具包的指示后,2×EdU反应溶液制备和添加到24-well盘子。孵化后的反应解决方案2 h在黑暗中,这些细胞被固定在室温下用4%多聚甲醛和添加500 20分钟μL Triton x - 100年的0.3%。PBS随后添加洗涤3次,在室温下反应持续了10分钟。叠氮化反应555 -点击解决方案随后准备,200μL的解决方案是添加到每个好,在室温下,其次是在黑暗中孵化了30分钟。反应溶液被与PBS三周期的洗涤后,细胞核被赫斯特restained然后其次是免疫荧光技术。

2.9。Coimmunoprecipitation化验

这个工具包用于生物素标记非瑟酮EZ-Link TM Biotin-LC-Hydrazide(热科学)。所有的程序都按照操作规程进行。的biotin-labeled非瑟酮256细胞悬液接种到沃克,24小时后收集的细胞离心的文化。预冷coimmunoprecipitation试验增加了缓冲。细胞被收集和离心机。珠子与PBS洗两次,蛋白琼脂糖珠被添加和离心机。兔抗体是补充,抗原抗体混合物在慢慢动摇一夜之间在4°C。蛋白琼脂糖珠随后被添加,慢慢动摇一夜之间在4°C。琼脂糖bead-antigen抗体复杂最终离心机和电泳。

2.10。免疫印迹分析

收集细胞裂解和免疫沉淀反应测定溶菌产物。在13000转离心后20分钟4°C,上层清液的收集,和总蛋白sds - page分离利用10%。蛋白质被转移到PVDF膜,在室温下密封用脱脂牛奶1 h和TBST被用来洗3次。主要抗体是添加在4°C一夜之间,为孵化和第二抗体是孵化补充第二天1 h。最后,ECL显色。下面列出的主要抗体是:anti-AKT anti-p-AKT anti-HIF-1α、vegf和β肌动蛋白抗体来自细胞信号技术(上海,中国)。

2.11。qPCR化验

使用试剂盒试剂提取总RNA。再次转录的互补链是使用'可控硅进行免疫沉淀反应分析工具(19]。在确定基因的相对表达水平,反应系统和程序qPCR结核病的绿色预混料TaqII遵守指令。基因的相对表达水平测量,然后计算使用2−∆∆CT算法的方法。

2.12。统计分析

所有实验数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。学生的t测试是采用成对比较和单向方差分析(方差分析)为多个组比较。是使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析(美国CA LaJolla)和差异显著 值< 0.05。

3所示。结果

3.1。去KEGG CIBP被ATAGJ分析

ATAGJ已经被证明是有效的CIBP通过长期的临床试验在这一组。ATAGJ由BP ZJC,科幻,WLZ, XJ, MQZ。调查的影响ATAGJ CIBP,我们首次发现ATAGJ的活性成分和相关目标。ATAGJ有332的目标,198年CIBP目标,和28重叠目标(数字1(一)和1 (b))。阐明ATAGJ的功能目标和潜在目标的信号通路的作用,我们分析了28个目标利用去KEGG分析和可视化富集分析的结果。去富集分析显示,影响eux跨膜转运活动,ATPase-coupled异型生物质跨膜转运活动,NADPH作为供体,和一个氧原子结合在生物过程更重要。单氧酶活性的影响,核受体的活动,积极调节磷脂酶C活动分子功能更重要(数字1 (c)和1 (d))。KEGG通路分析的结果表明,28个潜在目标的ATAGJ CIBP HIF-1呈正相关α信号通路。接下来,我们验证了HIF-1 ATAGJ效果α信号通路(图1 (e))。

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图1
去KEGG通路富集分析;之间的交叉基因(a)维恩图解ATAGJ和骨癌疼痛的目标;(b)基因维恩图解冰片(BP)之间的交集,脊柱gleditsiae (ZJC) pillworm (SF)、粪便trogopterori (WLZ) resina天龙星座的(XJ)和精液strychni (MQZ)和骨癌疼痛的目标。(c, d)泡沫图通过生物过程和分子功能的分析。的Y轴左边的名称去频道,和X轴是 价值。圆越大,越基因进行比较。较暗的颜色,更多的基因进行了比较。(e) KEGG通路富集分析圆图,右边的最外层是信号通路的名字,左边是基因。左内圈代表意义重大 值相应通路的基因。
3.2。Component-Target网络映射和分子对接ATAGJ CIBP待遇

PPI蛋白质相互作用网络图(图2(一个)通过字符串)是解释平台。我们发现非瑟酮是ATAGJ的关键组件之一,和AKT1 VEGFA是核心目标基因与高度值(图2 (b))。结果表明,非瑟酮,一种蛋白激酶,VEGFA不到−5千卡每摩尔。氨基酸残基ALA-5、ILE-6 Glu-49 AKT和非瑟酮形成氢键相互作用和疏水作用与氨基酸残基VAL-4, LYS-30, LEU-28, ILE-36 ARG48, TYR38。氨基酸残基val - 216、LYS-48 SER-50, CYS-51 VEGFA和非瑟酮形成氢键相互作用和疏水作用与氨基酸残基ile - 215, - 197,酪氨酸- 165和PRO-49。分子对接结果表明,非瑟酮ATAGJ的关键组件,可能会影响CIBP通过调节AKT或VEGFA(数字2 (c)和2 (d))。HIF-1 KEGG通路分析显示α信号通路可能发挥关键作用在治疗CIBP ATAGJ政府后,和AKT通路HIF-1的监管途径α。因此,我们怀疑ATAGJ和非瑟酮是否可以调节HIF-1α结合一种蛋白激酶信号通路。

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图2
的关键组件和核心目标ATAGJ治疗骨癌疼痛分析网络药理学:(a) 28蛋白质的相互作用分析;(b) drug-component-target基因网络图。ZJC ATAGJ指复合MQZ, BP,科幻,WLZ, XJ。MQZ指冰片、脊柱gleditsiae pillworm,粪便trogopterori, resina天龙星座的,和精液strychni;(c)非瑟酮之间的分子对接和AKT;(d)分子对接非瑟酮和VEGFA之间。
3.3。AKT / HIF-1 ATAGJ减轻CIBP的老鼠α信号通路

尽管ATAGJ CIBP患者产生令人满意的临床疗效,其具体机制尚未明确。我们分析了患者CIBP AKT / HIF-1成为可能αATAGJ信号通路调节的网络药理学的方法。找出影响CIBP ATAGJ治疗的分子机制,选择SD大鼠分为假组,模型组、低剂量ATAGJ集团ATAGJ中剂量组和高剂量ATAGJ组。上午9点。,ATAGJ was applied at low (10 g/d), medium (20 g/d), and high (30 g/d) doses, respectively, for 10 h and lasted for 14 d. The PWT of the model group was markedly lower than that of the sham group at day 7 ,这表明,痛阈降低,CIBP模型构建成功。两组之间没有表现出显著差异 ,这表明ATAGJ可以大幅提高佩恩表的编制者和提高大鼠的痛阈(图3(一个))。在一种蛋白激酶/ HIF-1 ATAGJ的影响α信号通路随后被发现使用免疫印迹实验,表明p-AKT的水平,HIF-1α在模型中,VEGF明显升高组与虚假的组 。HIF-1 p-AKT的水平α,VEGF降低很大程度上与模型组相比 (数据3 (b)和3 (c))。结果qPCR建议HIF-1的水平α和VEGF在模型组相比涨了很多的骗局 。与模型组相比,HIF-1的水平α和VEGF明显减少 (图3 (d))。

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图3
ATAGJ影响AKT / HIF-1α信号通路在CIBP老鼠;(一)机械痛阈所有组的老鼠;(b, c)免疫印迹检测蛋白的表达p-Akt, HIF-1α和VEGF。β肌动蛋白表达被认为是内部控制。(d)中存在检测表明基因的信使rna表达水平。学生的t测试(两组)或采用单向方差分析,其次是图基的测试(两组以上)(n≥3)。 , ,和 。
3.4。ATAGJ的单体非瑟酮可以抑制肿瘤的生长

非瑟酮被视为关键组件(最连接)ATAGJ通过网络药理学分析。它是一个复合来源于天然植物,具有广泛的药理作用。调查是否ATAGJ单体非瑟酮沃克256细胞的增殖的影响,我们沃克256个细胞分为对照组,顺铂组,低剂量非瑟酮组,一个中等剂量非瑟酮组和高剂量非瑟酮组。沃克256细胞与非瑟酮治疗(10μ米,20μ米,30μ米)、顺铂(5μ米)的阳性对照组24 h。

集落形成试验的结果表明,顺铂组能够明显抑制沃克256个细胞的增殖培养基和高剂量非瑟酮组 (数据4(一)和4 (b))。进一步检测非瑟酮的影响进行识别Transwell沃克256个细胞的迁移能力的实验,表明顺铂组能显著抑制沃克256个细胞的迁移在低和高剂量非瑟酮组 (数据4 (c)和4 (d))。同时,EDU实验结果表明,顺铂组可以显著抑制沃克256细胞的增殖中、高剂量非瑟酮组 (数据4 (e)和4 (f))。

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图4
非瑟酮影响肿瘤细胞增殖;(一)每组细胞的集落形成试验;(b)量化的几个殖民地在图4(一);(c) transwell在每组实验的细胞;在图(d)量化的几个细胞4 (c);每组(e) EDU实验;EDU (f)量化+细胞在图4 (e)。我们把沃克256个细胞分为对照组、顺铂组,低剂量非瑟酮组,非瑟酮中剂量组和高剂量非瑟酮组。沃克256细胞与非瑟酮治疗(10μ米,20μ米,30μ米)、顺铂(5μ米)的阳性对照组24 h学生的t测试(两组)或采用单向方差分析,其次是图基的测试(两组以上)(n≥3)。 , , 。
3.5。ATAGJ单体通过一种蛋白激酶/ HIF-1非瑟酮可以抑制肿瘤的生长α信号通路

通过网络药理学,我们发现AKT1和VEGFA核心目标基因与高度。分析表明,HIF-1 KEGG途径α信号通路可能是非常重要的治疗由ATAGJ CIBP和AKT通路HIF-1的监管途径α。分子对接的结果表明,非瑟酮可能调节HIF-1α一种蛋白激酶信号通路的绑定。验证非瑟酮和AKT1之间的关系,我们用生物素标记为非瑟酮调查是否这个单体可以绑定到AKT1。Co-IP结果表明,非瑟酮可以结合AKT1(图5(一个))。调查是否通过一种蛋白激酶/ HIF-1非瑟酮抑制肿瘤的生长α信号通路,我们发现非瑟酮能显著降低p-AKT的水平,HIF-1α,VEGF (图5 (b))。与此同时,非瑟酮是大大地减少HIF-1的水平表示α和VEGFR (数据5 (c)和5 (d))。

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图5
非瑟酮影响Akt / HIF-1α信号通路在肿瘤细胞。(一)Coimmunoprecipitation化验显示fisetin-AKT沃克256细胞的相互作用。(b)蛋白的表达p-Akt HIF-1α和VEGF。HIF-1 (c, d)α和VEGF检测到免疫荧光测定。红色代表HIF-1α和VEGF。蓝色代表DAPI。

4所示。讨论

癌症疼痛被公认为常见并发症之一遭受一系列的癌症患者,大约25%(首次发生20.]。晚期癌症患者疼痛的发生率可达60∼80%,和1/3的病人遭受持续的剧烈疼痛。目前,大多数治疗方法首选西医在治疗癌症疼痛主要包括镇痛药物、神经阻滞,主要病变手术,放化疗9]。镇痛药物的治疗原则主要是基于“三阶阶梯”,世卫组织建议的(21]。尽管在临床实践中取得了一些效果,不良反应包括消化道反应,便秘,头晕,呼吸衰竭以及精神疾病也存在(22]。因此,迫切需要找到一个令人满意的治疗方法,能赢得癌症疼痛患者的信心。

ATAGJ函数作为一种有效的治疗选择CIBP救济和疼痛管理。它的主要组件由冰片、脊柱gleditsiae pillworm,粪便trogopterori, resina天龙星座的,和精液strychni。脊柱gleditsiae含有非瑟酮,它代表了一种黄色的生物活性颜料(23]。非瑟酮的分子式是C15H10O6,的摩尔质量286.2363克/摩尔和密度为1.688 g / mL。溶于乙醇、丙酮、醋酸、氢氧化基础解决方案(24,25]。一般来说,一些疼痛诱导介质包括肿瘤细胞和炎症细胞被认为是参与CIBP的发生和发展。同时,不断激活破骨细胞被认为是与此相关的疼痛。此外,肿瘤扩展神经压迫和伤害也痛苦的来源(26]。肿瘤不高度由感觉神经元。然而,肿瘤的快速增长有一个倾向结合和损伤神经,导致机械损伤,压缩,缺血,或直接的蛋白水解作用。肿瘤细胞的增殖,他们首先压缩然后破坏骨髓的造血细胞,正常情况下,感觉纤维通常在骨髓和矿化骨1]。

我们最初确定活性成分和相关目标的ATAGJ网络药理学。和去分析和KEGG通路分析进行使用Cytoscape ClueGO插件。KEGG通路的结果显示,ATAGJ治疗的28个潜在目标CIBP HIF-1主要是相关的α信号通路。HIF-1α是缺氧诱导基因和细胞内氧的核心监管环境修复,从而调节细胞生长,增殖,迁移,炎症和细胞凋亡。高表达的HIF-1α蛋白质是表示在大多数肿瘤组织和转移性网站14- - - - - -24,27- - - - - -29日]。然后张等人报道,CIBP是通过抑制HIF-1缓解的α/血管内皮生长因子信号通路(30.]。因此,我们得出结论,ATAGJ可能减少CIBP通过抑制HIF-1的表达α。然后构造CIBP模型验证了假设的老鼠。的机械痛阈值低,中,高剂量ATAGJ组高于模型组的21天 。两组之间没有表现出显著差异 ,这表明,在减少CIBP ATAGJ了令人满意的效果。此外,我们发现p-AKT的表达水平,HIF-1α,VEGF在模型组明显升高,而不是虚假的 。与模型组相比,那些p-AKT HIF-1α,在H-ATAGJ治疗组VEGF大大下降 。结果表明,ATAGJ可以减少CIBP通过减少AKT / HIF-1的老鼠α信号通路。我们可视化的药物、组件和目标使用Cytoscape 3.6软件,发现非瑟酮的关键组件ATAGJ(大多数连接)。它表明,非瑟酮组能显著抑制沃克256细胞的增殖在低和高剂量非瑟酮组 。此外,我们分析了非瑟酮是否采取了沃克256个细胞的迁移Transwell实验。能显著抑制非瑟酮组的沃克256个细胞的迁移是在中、高剂量非瑟酮组 。与此同时,EDU实验表明,非瑟酮组能显著抑制沃克256细胞的增殖中、高剂量非瑟酮组 。前面描述的结果表明,非瑟酮可以极大地抑制肿瘤细胞的扩散和转移。

AKT1和VEGFA核心目标基因与很高的分数。分子对接的结果表明非瑟酮,一种蛋白激酶,VEGFA不到−5千卡每摩尔。因此,我们推测,非瑟酮可能通过调节来影响CIBP AKT或VEGFA。然后我们与生物素标记为非瑟酮调查是否可以AKT1债券。Co-IP结果显示,可以结合AKT1非瑟酮。从这一点,我们假设非瑟酮可以调节HIF-1α一种蛋白激酶信号通路的绑定。此外,我们发现非瑟酮能显著降低HIF-1的水平α、p-AKT和VEGF 。这表明非瑟酮抑制一种蛋白激酶/ HIF-1α一种蛋白激酶信号通路在肿瘤细胞通过绑定。

5。结论

我们最初预测的潜在目标和途径ATAGJ CIBP管理使用网络药理学的方法。沃克256细胞的克隆形成和扩散后被检测到非瑟酮治疗。此外,实验检测一种蛋白激酶/ HIF-1α信号通路表达CIBP老鼠和沃克256个细胞。分子对接和IP实验验证非瑟酮和AKT的绑定。的影响结果表明ATAGJ CIBP老鼠和重要组成部分的非瑟酮会抑制沃克256细胞增殖和表达下调HIF-1的表达水平α通过针对AKT、p-AKT和VEGF。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

王静和赖co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

王静和赖Zonglang同样对本文有贡献。WJ构思的项目,规划实验,分析和解释数据。赖ZL进行体外实验,写论文。所有作者的贡献和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持的特殊项目的绩效激励和指导科研机构在重庆(没有。cstc2019jxj1130021)。