文摘

阿苯达唑(ABZ)是一种有效的广谱驱虫剂剂已被广泛应用于人类和动物。先前的研究已经报道,ABZ展品抗肿瘤效应对黑色素瘤和其他不同的癌症类型;然而,未知是否ABZ施加对黑色素瘤转移的抑制作用。在这项研究中,我们旨在调查ABZ对黑色素瘤细胞的抑制作用。通过体外研究中,我们发现低剂量ABZ治疗显著地抑制迁移和入侵,但不扩散,A375和B16-F10细胞的剂量依赖性的方式。进一步分析显示,ABZ治疗减少了蜗牛的表达水平家庭转录抑制因子1(蜗牛)在细胞质和细胞核通过减少的水平磷酸化AKT Ser473 / GSK-3 (pAKT)β(pGSK-3β)Ser9并增加pGSK-3β/ Tyr216,导致钙粘蛋白的一个重要upregulation N-cadherin并最终反转差别和对这些epithelial-mesenchymal过渡(EMT)黑色素瘤细胞的过程。相比之下,连续激活一种蛋白激酶通过转染质粒蛋白水平升高的pAKT Ser473 / pGSK-3βSer9和蜗牛也得罪ABZ的抑制作用。我们还证实,ABZ治疗有效地抑制黑色素瘤肺转移的裸小鼠体内。随后的免疫组织化学分析验证了减少pAKT Ser473 / pGSK-3βSer9和增加pGSK-3β/ Tyr216水平ABZ-treated皮下肿瘤。因此,我们的研究结果表明,ABZ治疗可以抑制黑色素瘤的EMT的进步通过增加pGSK-3β/ Tyr216-mediated退化的蜗牛,这可能是作为一个潜在的治疗策略用于转移性黑素瘤。

1。介绍

来自黑色素细胞黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤,主要发生在皮肤但也可以发现在粘膜和内脏。作为一个最致命的皮肤癌(1],黑色素瘤的发病率不断增加全球(2)以每年3%的速度(3]。此外,约230000人被诊断为原发性黑色素瘤在世界范围内,每年造成近55500人死亡(4]。当地可以有效治疗黑色素瘤在早期手术切除,> 90%的5年存活率(5]。相比之下,转移性黑色素瘤预后很差,5年生存率小于10%。因此,早期手术切除只是适合当地黑色素瘤和转移发生后几乎是无效的6]。

先前的研究已经报道,恶性黑色素瘤的高死亡率显著相关的高转移率(7]。由于黑色素瘤是一种上皮恶性肿瘤,epithelial-mesenchymal过渡(EMT)过程起着至关重要的作用在黑色素瘤转移8]。EMT是必要程序正常的胚胎发育和损伤修复(9];然而,它也发生在恶性肿瘤进展(10]。EMT过程使迁移和入侵上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞,这是伴随着mesenchymal-like变化(11),包括损失的细胞极性,降低细胞间粘附,改变细胞表面蛋白的表达(12]。异常表达特定的标记是一个典型的EMT过程的特性,如upregulation N-cadherin,蜗牛家族转录抑制因子1(蜗牛)、波形蛋白,Occludin,纤连蛋白1的差别(FN1)和对这些钙粘蛋白(13),最终导致黑色素瘤转移(14]。EMT过程中作为一种重要的转录因子,蜗牛,能进入细胞核磷酸化后Ser246和确定的相对表达下游N -钙粘蛋白(15,16),直接由上游信号通路RAC-alpha丝氨酸/ threonine-protein激酶(激酶)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)在肿瘤进展17,18]。GSK-3β/ Tyr216(活性形式)可以调节核出口和退化的蜗牛,而GSK-3β/ Ser9(活动形式)磷酸化通过pAKT可以保持其稳定性。因此,Tyr216 / Ser9的比率的变化可能是非常重要的蜗牛和肿瘤细胞侵袭和转移的能力16,18,19]。虽然已经在癌症医学最新进展,免疫疗法,和有针对性的药物发现,癌症患者的快速耐药性的发生通常会导致疾病复发(20.]。目前,没有黑色素瘤转移的长期、有效的治疗方法。因此,识别所需的EMT的潜在抑制剂是抑制肿瘤的进展和治疗干预黑色素瘤的发展(8]。

最近,药物重新定位已经成为一个越来越有吸引力的选择医学治疗由于现有药物的药物动力学和安全,这可以减少临床试验的难度和风险在一定程度上(21,22];此外,这一战略经济优势而完整的新药开发(23]。一个例子是阿苯达唑(ABZ),一种苯并咪唑衍生物与已知的抗肿瘤和抗寄生虫药物的属性可以被重新定位为一种抗癌药物(22,24]。尽管现有研究关于ABZ可能通过抑制增殖有antimelanoma影响(25)或促进细胞凋亡26),它仍然是未知ABZ是否也能表现出抑制作用与黑色素瘤的转移。在这项研究中,我们旨在确定的影响ABZ治疗A375和B16-F10黑色素瘤细胞的迁移和入侵期间EMT和识别相关的信号通路和潜在的未来的研究目标。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化

人类黑色素瘤A375和B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系来自美国类型文化收集(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯),而B16-F10-luciferase (B16-F10-luc)细胞购自上海生物模型中心(上海,中国)。B16-F10-luc和A375细胞培养在杜尔贝科的修改鹰中葡萄糖(美国UT SH30243.01 HyClone,洛根)含10%胎牛血清(的边后卫;青霉素SH30084.03 HyClone), 1% / 1%链霉素(P1400, Solarbio,北京),1%谷酰胺(G0200 Solarbio), 1%不重要的氨基酸(N1250 Solarbio)。细胞培养在孵化器37°C公司为5%2(沃尔瑟姆福马3111,热费希尔科学硕士,美国)。

2.2。质粒构建

人类AKT1编码序列被放大和克隆成pcDNA3.1(+)质粒。持续活跃AKT质粒(CA-AKT;T308D / S473D)是通过使用QuikChange野生型人类AKT1突变®定点诱变工具包(美国Stratagene拉霍亚,CA),然后通过测序验证。Endotoxin-free CA-AKT质粒(用于转染)使用Endo-Free提取质粒Midi Kit-fast(美国GAωBio-tek, Norcross)。GSK-3β/ Tyr216野生型(WT)和GSK-3βY216F突变pLenti质粒编码WT或Y216F cDNA买来Obio科技有限公司(上海,中国)。VSV-G质粒pMD2。G和psPAX2包装质粒是Wenyue徐教授的礼物(军队医科大学)。

2.3。细胞转染和转导

大约80%的A375和B16-F10黑色素瘤细胞confluency转染的选择。Opti-MEM™介质(Gibco,热费希尔科学沃尔瑟姆,妈,美国)被用来稀释Lipofectamine™3000试剂(L3000008热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)和质粒主含有质粒和混合P3000™试剂,而随后根据制造商的指示和混合添加到细胞培养基。HEK293T细胞(捐赠的胸外科的实验室,新桥医院,军队医科大学)是与GSK-3转染β野生型(WT)或GSK-3βY216F pLenti质粒与pMD2相结合。G和psPAX2收集慢病毒质粒通过Lipofectamine 3000 (L3000008热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)根据制造商的指示。GSK-3β野生型黑色素瘤A375细胞和GSK-3β/ Y216F黑色素瘤A375细胞生成使用慢病毒转导和选择面前杀稻瘟菌素(5 ug /毫升)(美国圣地亚哥ant-bl-05, InvivoGen)。

2.4。细胞生存和增殖试验

ABZ(美国新泽西州蒙茅斯HY-B0223、多国评价结)溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;最终浓度< 0.1%)的最终浓度10更易/ L和储存起来以备后续使用。细胞计数kit-8 (CCK-8;C0037 Beyotime,中国上海)分析是用来分析细胞生存和增殖。黑色素瘤细胞对数生长期(5×103播种、培养细胞)在96 -包含100孔板μL媒介。实验治疗组和DMSO ABZ在不同浓度(0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,和12.8μ米),空白组治疗。24小时后,10μL CCK-8试剂添加到每个好,盘子被孵化2 h的37°C。吸光度值随后被以490海里使用标仪(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。

2.5。伤口愈合实验

愈合测试用于检测的影响ABZ治疗黑色素瘤细胞的迁移。A375和B16-F10细胞接种在6-well盘子培养基含有10%的边后卫。后细胞覆盖率达到95%,t - 1000 b吸管提示被用来擦伤口的细胞。然后,板被洗两次磷酸盐(PBS;ZSGB-Bio zli——9061年,北京,中国)去除漂浮的细胞,细胞图像被随机使用一个倒置显微镜(徕卡倒置显微镜DMi8,位于德国)。最后,细胞治疗ABZ在不同浓度(0.1、0.2和0.4μ24 h M),和细胞图像得到再次使用相同的显微镜。ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达,美国)被用来量化细胞上的伤口愈合区域图像。

2.6。Transwell入侵检测

的底部transwells 8μm毛孔(662638年,他一一Bio-One Frickenhausen、德国)与基底膜基质预镀(356234年,康宁,贝德福德,妈,美国)。A375和B16-F10细胞缺乏使用中没有的边后卫12 h。细胞(6×104每口井)接种到含有不同浓度的无血清培养基ABZ(0.1、0.2和0.4μ通过8米),并允许入侵μ米孔下室包含中有10%的边后卫。24小时后,transwells与4%多聚甲醛固定(P0099 Beyotime) 20分钟,沾0.1%结晶紫(HY-B0324A, MCE) 20分钟。五个随机选择的职位获得的图像通过使用徕卡倒置显微镜使用ImageJ DMi8和分析软件(NIH)来确定细胞入侵的数量降低室。

2.7。西方墨点法

0.4 A375和B16F10细胞治疗μM ABZ仅24 h或per-transfected CA-AKT或pcDNA3.1(+)质粒和对待ABZ 24小时;对蛋白酶抑制A375细胞cotreated ABZ和10μM MG132 24 h;GSK-3β/ WT和GSK-3β0.4 / Y216F稳定表达A375细胞治疗μM ABZ仅24 h。然后,这些细胞细胞溶解在缓冲区里帕(89900年,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)提取总蛋白。核和胞质蛋白提取使用NE-PER分开™核和胞质提取试剂(78833年,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)和量化使用BCA蛋白质检测设备(P0012s Beyotime)。蛋白质样本解决10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(1610183,Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国),然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF);IPFL00010,默克公司,达姆施塔特,德国)使用电穿孔液膜。膜被封锁,没有蛋白质屏蔽解决方案(c510042 - 0500, Sangon生物科技、上海、中国)1 h 25°C。与Tris-buffered盐水洗涤三次后补间®20 (TBST;b548105 - 0500, Sangon生物技术),阻止了PVDF膜切成合适的形状,主要抗体孵育,一夜之间,保存在一个瓶在4°C。主要的抗体,即anti-phospho-AKT (Ser473)兔抗体(44 - 623 g), anti-AKT (44 - 609 g), anti-N-cadherin (13 - 2100), anti-E-cadherin (14-3249-82), anti-Snail (14-9859-82), anti-Vimentin (ma5 - 16409), anti-Occludin (33 - 1500), anti-FN1 (pa5 - 29578),β肌动蛋白(ma5 - 15452), anti-GSK3B (phospho-Tyr216)兔抗体(44 - 604 g), anti-GSK3B (phospho-Ser9)兔抗体(ma5 - 38235), anti-GSK-3β兔抗体(pa5 - 95845), anti-SNAI1 (phospho-Ser246)兔抗体(pa5 - 37739)和增殖细胞核抗原(PCNA);pa5 - 27214),从热费希尔科学购买。随后,PVDF膜的孵化与相应的二次抗体(zb - 2306, ZSGB-Bio) 1 h。与TBST洗涤三次后,蛋白质样本可视化使用融合独奏年代化学发光成像系统(VILBER、Collegien、法国)。获得的免疫印迹数据分析使用ImageJ软件(NIH)。

2.8。实时逆转录定量PCR (RT-qPCR)

从黑素瘤细胞总RNA提取使用试剂盒®试剂(15596026,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)和reverse-transcribed cDNA用PrimeScript RT试剂盒gDNA橡皮擦(RR047A、豆类、日本京都),根据制造商的指示。实时RT-qPCR分析调查EMT-related基因的mRNA表达的差异之前和之后ABZ治疗。PCR反应鸡尾酒(25μL)包含0.5μL正向和反向引物,12.5μL SYBR®预混前任Taq TM II (RR820A,豆类),10.5μL重蒸馏的水,1μL的互补。PCR循环条件如下:95°C 15年代,30年代60°C,放大了40周期。每个实验进行了三次。使用2的相对表达水平计算−ΔΔCt方法,β-肌动蛋白的内部控制规范化。使用的引物钙N-cadherin,蜗牛,波形蛋白,Occludin FN1,β-肌动蛋白补充表中列出1。

2.9。动物实验

裸体小鼠(4周)用于动物实验获得动物实验中心的解放军陆军医疗中心(中国重庆)和维护在SPF动物的房子。所有研究都是依法开展实验的实验动物伦理审查批准的协议解放军陆军医疗中心。首先,B16-F10-luc细胞(5×105)通过尾静脉注射。第二,1周后,小鼠麻醉和注射Xenolight™D-Luciferin盐钾(美国珀金埃尔默,波士顿,MA), 5分钟后,他们穿上成像板,曝光时间是20年代和计量单位是光子通量,体内荧光图像获得使用新腔三世成像系统(珀金埃尔默)。第三,确认肿瘤模型成功建立后,老鼠被随机分为三组,即50毫克/公斤,20毫克/公斤ABZ,和控制,不同浓度的实验小组用PBS ABZ(包含0.5%羧甲基纤维素钠+ 2% DMSO),和对照组用PBS(包含0.5%羧甲基纤维素钠+ 2% DMSO),剂量是100年μL,他们对待一旦通过胃内的日常管理。第四,之后连续胃内的强饲法为10天,体内荧光图像得到再次使用相同的方法。最后,老鼠,解剖和肺部被用PBS。肺表面上的黑色素瘤结节数,用4%多聚甲醛固定。

2.10。Hematoxylin-Eosin(他)染色

传统的方法后,肺组织是嵌入在石蜡,切成4μ部分因为他染色。与苏木精染色法染色的部分解决方案3分钟15秒用蒸馏水洗净,沾1%盐酸和乙醇为15秒。与蒸馏水洗涤后1分钟,50年代的部分与伊红染色,清洗用蒸馏水再次15 s。的部分被梯度乙醇脱水,浸泡在二甲苯,最后与中性密封胶。

2.11。免疫组织化学(包含IHC)测定和得分

包含IHC检测关键EMT的蛋白质进行使用FLEX + Dako设想系统(Dako,柏林,德国)。石蜡切片是deparaffinized。抗原检索是由加热样品微波在柠檬酸缓冲(pH值6.0)15分钟,然后返回样品室温,紧随其后的是洗涤与磷酸盐(PBS)。样品被封锁的Dako真正Peroxidase-Blocking 15分钟的解决方案。幻灯片在一夜之间被孵化在4°C的兔抗体anti-N-cadherin,兔子ant-E-cadherin, anti-phospho-AKT (Ser473) anti-GSK3B (phospho-Tyr216)和anti-GSK3B (phospho-Ser9),其次是孵化(30分钟),二级抗体。幻灯片是沾3 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 2分钟。的百分比呈阳性标记细胞都得分如下:0 - 5%,阳性细胞;1、< 25%的阳性细胞;2、25 - 50%阳性细胞;3,50 - 75%阳性细胞; 4, 75–100% positive cells. The staining intensity was scored as follows: 0, no positive cells; 1, weak staining; 2, moderate staining; and 3, strong staining. The immunohistochemical staining score was obtained by multiplying the percentage score by the intensity (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, or 12). The X-tile v3.6.1 statistical package [27)是用于分析IHC检测结果。

2.12。统计分析

数据被表示为意味着±标准差(SD)的三个独立的实验。单向方差分析被用于比较两组如果数据是正态分布,如果没有,Mann-WhitneyU测试使用。Tukey-Kramer统计用于多个正态分布的比较;如果不是,Dunnett使用的测试。统计分析是由使用SPSS 25.0统计软件(IBM SPSS)。

3所示。结果

3.1。低剂量ABZ治疗显著抑制体外黑素瘤细胞的迁移和入侵

ABZ是苯并咪唑氨基甲酸酯药物(图1(a))。确定ABZ对黑色素瘤细胞的迁移和入侵的能力,我们进行了对黑色素瘤细胞CCK-8化验ABZ处理在不同浓度,发现低剂量ABZ (< 0.4μM / L)治疗没有显著影响A375和B16-F10细胞的增殖(数字1(b)和1(c))。然而,伤口愈合化验表明,低剂量ABZ治疗24小时显著抑制A375的迁移(图1(d)和B16-F10(图)1剂量依赖性的方式(e))细胞。此外,基底膜基质入侵分析显示低剂量ABZ治疗显著抑制入侵能力的两个黑素瘤细胞系剂量依赖性的方式(数字1(f) -1(g))。这些发现表明,低剂量ABZ可以显著抑制迁移和入侵,但不扩散,黑色素瘤细胞体外。

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图1
低剂量的阿苯达唑(ABZ)治疗有效地抑制黑色素瘤细胞的迁移和入侵。(一)ABZ的化学结构。(c) A375 B16-F10细胞治疗有或没有ABZ不同浓度。CCK-8分析来检测细胞活力和增殖。(d e) A375 B16-F10细胞治疗与不同浓度的ABZ(0.1、0.2和0.4μ米)。伤口愈合面积和相对伤口闭合率(%)在黑色素瘤细胞进行了测量和分析治疗后24小时。(做减法)的抑制作用ABZ A375和B16-F10细胞的入侵检测使用transwell实验。数据表示为±SD方法。所有实验进行三次。 ; 。
3.2。低剂量ABZ治疗抑制体内黑色素瘤细胞的肺转移

由于体外实验表明低剂量的抑制性影响ABZ黑色素瘤细胞的迁移和入侵,然后我们调查的影响ABZ治疗黑色素瘤细胞体内使用裸鼠模型的肺转移。经过10天的连续20 - 50毫克/公斤ABZ胃内的管理,这是远低于使用的剂量皮下肿瘤(28),体内荧光图像显示从ABZ-treated小鼠肺转移性标本的荧光强度明显低于对照组(数字2(一)和2(b)),这表明肺转移的黑素瘤细胞ABZ-treated组极大地抑制。此外,黑色素瘤肺结节在ABZ治疗组小,减少对肺部的肿瘤形成(图2(c))。此外,数量和规模后黑色素瘤结节数和得分,ABZ-treated老鼠被发现的结节得分明显低于对照小鼠(图2(d)),它证实了他对小鼠肺部分(图染色2(e))。剂量依赖性的方式,这些结果表明,ABZ-treated小鼠肺转移率明显低于正常。综上所述,我们的研究结果表明,低剂量ABZ可以显著抑制黑色素瘤细胞的转移和入侵在体外和体内。

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图2
ABZ治疗抑制小鼠黑色素瘤肺转移。(一)代表形象和(b)统计分析发光强度在B16-F10-luc肿瘤的裸鼠ABZ不同浓度处理(n= 5)。(c)上,中间,和降低电池板代表了黑色素瘤结节在小鼠的肺表面控制,20毫克/公斤ABZ,分别和50毫克/公斤ABZ团体。(d)的分数在每个实验组黑色素瘤结节。肿瘤结节直径的评分标准如下:1级:< 0.5毫米;2级:> 0.5毫米,< 1.0毫米;3级:> 1.0毫米,< 2.0毫米;四级:> 2毫米。(e)代表他的图像彩色小鼠肺部分从控制和ABZ-treated组。圈出部分显示肺转移性结节。所有动物实验重复三次。 。
3.3。ABZ抑制黑色素瘤细胞的转移通过逆转EMT过程

自从EMT过程被认为是负责黑色素瘤的转移和复发,我们也调查了影响ABZ治疗黑色素瘤细胞的EMT过程。关键EMT的mRNA水平蛋白质,即N-cad, E-cad,波形蛋白,Occludin和FN1检测到实时RT-qPCR分析ABZ治疗后24小时。与对照组相比,E-cad表达显著调节ABZ-treated组,虽然N-cad的相对表达水平,波形蛋白,FN1, Occludin不同程度表达下调(数据3(一)和3(b))。此外,这些变化被证实在蛋白质水平通过免疫印迹分析(数据3(c)和3(d))。确定的影响ABZ EMT-related蛋白质在体内的表达,我们也分析了从ABZ-treated E-cad和肺N-cad水平部分和控制老鼠。IHC检测结果表明,E-cad和N-cad B16-F10转移焦点的表达水平ABZ-treated小鼠肺部分显著调节和表达下调,分别与控制老鼠(图3(e))。这些发现表明,ABZ可以抑制黑色素瘤细胞的转移通过逆转EMT过程。


图3
ABZ治疗抑制黑色素瘤细胞的转移通过逆转EMT过程。(a - b)的相对表达水平N-cadherin,钙粘蛋白、波形蛋白,Occludin, FN1 ABZ-treated(0.4之间μ米)和对照组被RT-qPCR测量β肌动蛋白基因作为参考。(c - d)关键EMT蛋白质的表达水平被免疫印迹检测。直方图显示N-cad的相对密度,E-cad,波形蛋白,Occludin, FN1。(e)的定位和表达水平N-cad和E-cad小鼠肺癌组织测定使用免疫组织化学(包含IHC)测定。图像显示IHC染色标本(100×;左)。黑色虚线框放大区域对应于图像(右)。规模酒吧= 100和20μm。每一点每组的统计图表计算作为五个选择领域的平均得分在一个肺片,是一个包含IHC指数鼠标。数据表示为±SD方法。RT-qPCR和免疫印迹实验进行三次。 ; ; 。
3.4。ABZ会使通过增加磷酸化GSK-3蜗牛黑色素瘤细胞中表达β/ Tyr216积累

阐明ABZ-mediated背后的分子机制抑制EMT过程,我们进一步研究了蜗牛的表达和分布,主要的转录因子调节EMT标记物的表达。qPCR结果表明,蜗牛的相对表达水平并没有显著改变A375 B16-F10细胞ABZ治疗后24 h(图4(a))。然而,ABZ治疗显著降低蛋白质含量的蜗牛在黑色素瘤细胞的细胞质蛋白质印迹分析(图4(b))。这些结果表明,ABZ潜在调节蜗牛通过转录后的而不是平移修改。因为蜗牛是需要输入细胞核启动转录活动,我们后来发现的蜗牛在细胞核ABZ治疗。正如所料,ABZ治疗也减少了蜗牛的磷酸化水平/ Ser 246 (pSnail / Ser246)在黑色素瘤细胞的细胞核(数字4(c)和4(d))。我们也调查了GSK-3的磷酸化水平β负调节蜗牛,及其上游激活一种蛋白激酶(29日]。有趣的是,ABZ治疗显著降低pGSK-3的水平β/ Ser9(不活跃的形式)和pAKT / Ser473但极大地增强了pGSK-3的积累β/ Tyr216(活性形式)在黑色素瘤细胞的细胞质(数字4(c)和4(d)),增加的比率Tyr216 / GSK3 Ser9表示ABZ治疗可能激活β激酶(补充图1)。为了进一步确认是否ABZ-mediated pGSK-3增加β/ Tyr216能促进黑色素瘤细胞的蜗牛蛋白质的降解,MG132被用来抑制蛋白酶体。免疫印迹分析表明,MG132并不影响蛋白质水平的一种蛋白激酶和pGSK-3β/ Tyr216但ABZ治疗后显著抑制了蜗牛的退化,随后导致下游靶基因的upregulation N-cadherin钙粘蛋白表达的差别,对这些基因的表达(图4(e))。此外,IHC B16-F10结果在小鼠肺转移病灶部分揭示了pGSK-3的表达下降β/ Ser9和pAKT / Ser473和增加pGSK-3的表达式β(图/ Tyr216 ABZ-treated组4(f))。总的来说,这些发现表明ABZ能促进核出口和蜗牛通过激活pGSK-3细胞质降解β/ Tyr216和抑制pGSK-3β/ Ser9,导致EMT的抑制黑色素瘤细胞的进展。


图4
蜗牛ABZ治疗会使黑色素瘤细胞中表达增加磷酸化GSK-3的积累β/ Tyr216。(一)相对转录水平的蜗牛ABZ-treated (0.4μ米)和对照组的A375(左)和B16-F10(右)黑色素瘤细胞被RT-qPCR测量,β肌动蛋白作为内部控制。(b)转录因子的表达在A375蜗牛(左)和B16-F10(右)细胞免疫印迹分析,探测到β肌动蛋白作为内部参考蛋白质。(c - d)胞质蛋白的表达水平AKT, pAKT GSK-3β,pGSK-3β(Ser9 / Tyr216)和蜗牛,核蛋白质pSnail A375 B16-F10细胞也由西方墨点法,β肌动蛋白和PCNA的内部控制细胞质和核蛋白质,分别。直方图显示的相对密度AKT / pAKT GSK-3β/ pGSK-3β(Ser9 / Tyr216),和蜗牛/ p-Snail。(e) A375细胞cotreated有或没有MG132和0.4μM ABZ 24 h免疫印迹()是用于检测一种蛋白激酶的表达水平,pGSK-3β/ Tyr216、蜗牛、N-cadherin和钙粘蛋白A375细胞的细胞质中。直方图(底部)显示AKT的相对密度,pGSK-3β/ Tyr216、蜗牛、钙和N-cadherin。(f)直方图显示pGSK-3的相对表达强度β(Ser9 / Tyr216)和免疫组织化学染色后pAKT鼠标转移性肺癌组织。规模酒吧= 100和20μm。每一个点计算每组的平均得分在一个肺片五个随机选择的领域,代表了一个包含IHC指数一个鼠标。所有的数据都表示为±SD方法。所有实验进行三次。 ; ;ns,不重要。
3.5。CA-AKT显著逆转的抑制性影响ABZ黑色素瘤细胞的迁移和入侵

确定一种蛋白激酶/ GSK-3之间的关系β信号通路和ABZ-mediated EMT过程的逆转,我们是暂时性CA-AKT质粒转染B16-F10和A375细胞或pcDNA3.1(+)质粒。免疫印迹分析证明了转染CA-AKT pAKT / Ser473蛋白质水平的升高,导致pGSK-3增加β/ Ser9表达式和pGSK-3下降β(图/ Tyr216表达式5(一)和5(b))。相比之下,CA-AKT转染的差别显著逆转ABZ-mediated对这些蜗牛在细胞质中,在黑素瘤细胞(EMT的恢复进展数据5(一)和5(b))。此外,后续伤口愈合(数字5(c)和5(d))和transwell入侵实验(数字5(e)和5(f))显示,CA-AKT转染的抑制作用显著逆转ABZ治疗黑色素瘤细胞的迁移和入侵。这些发现证实ABZ可以抑制黑色素瘤细胞的EMT提高pGSK-3β/ Tyr216-mediated退化的蜗牛。

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图5
持续活跃的一种蛋白激酶(CA-AKT)的抑制作用显著逆转ABZ治疗黑色素瘤细胞的迁移和入侵。(a - b) CA-AKT质粒是暂时性的转染到A375 B16-F10细胞,而对照组转染与pcDNA3.1(+)向量。0.4治疗后24 hμM ABZ,免疫印迹分析用于检测N-cadherin的表达水平,钙pAKT pGSK-3β(Ser9 / Tyr216)和蜗牛A375和B16-F10细胞的细胞质中。直方图(底部)的相对密度检测的蛋白质。伤口愈合区域(c - d)和相对伤口闭合率(%)在黑色素瘤细胞进行了量化和分析0.4治疗后24小时μM ABZ。直方图(底部)显示每组相对伤口闭合率。(e-f) transwell入侵实验的结果对A375和B16-F10细胞在不同条件下。直方图(底部)在每组显示入侵细胞的数量。数据表示为±SD方法。所有实验进行三次。 ; ; 。
3.6。过度的GSK-3β/ Y216F ABZ治疗后不能促进蜗牛的退化

我们已经通过先前的实验证实了ABZ能促进蜗牛的核和胞质退化通过抑制pGSK-3出口β/ Ser9,从而抑制EMT在黑色素瘤细胞的发展。然而,我们的研究也显示,ABZ增强pGSK-3的积累β/ Tyr216(活性形式)黑色素瘤细胞的细胞质中。为了进一步阐明pGSK-3的功能作用β/ Tyr216 A375细胞表达野生型GSK-3稳定β(GSK-3β/ WT)和GSK-3β/ Y216苯丙氨酸(F)突变(GSK-3β/ Y216F)被构造成以前的报告30.]。ABZ治疗后24 h, GSK-3的磷酸化水平的蛋白质含量β/ Tyr216在所有三个细胞的细胞质和DMSO组相比显著增加。与ABZ-treated控制细胞相比,可以促进更多GSK-3 ABZ治疗β磷酸化后Tyr216 GSK-3超表达β/ WT,但不是在GSK-3β/ Y216F overexpressing细胞。与此同时,我们发现蜗牛的表达,N-cadherin, ABZ治疗后三组和钙粘蛋白;正如我们所料,GSK-3β/ Y216F超表达的蛋白质含量并没有改变蜗牛,N-cadherin,相比ABZ-treated控制细胞粘附。此外,后续的伤口愈合(图6 (b)(图)和transwell入侵实验6 (c))表明,抑制A375细胞的入侵和迁移ABZ-mediated在GSK-3变得更加显著β/ WT超表达细胞;然而,GSK-3β/ Y216F超表达不能改善这个效果。这些结果证实pGSK-3的至关重要的作用β/ Tyr216 EMT过程中黑素瘤细胞,这表明upregulation pGSK-3β/ Tyr216抑制黑色素瘤细胞的EMT过程。也证明了ABZ能促进核输出和胞质退化的蜗牛通过增加pGSK-3的积累β/ Tyr216,从而抑制黑色素瘤细胞的EMT过程。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图6
过度的GSK-3β/ Y216F ABZ治疗后不能促进蜗牛的退化。(一)控制,GSK-3β/ WT, GSK-3β0.4 / Y216F A375细胞治疗μM ABZ 24 h;免疫印迹分析(左)是用于检测一种蛋白激酶的表达水平,pGSK-3β/ Tyr216、蜗牛、N-cadherin和钙粘蛋白在细胞质中。直方图(右)的相对密度检测的蛋白质。(b)伤口愈合面积和相对伤口闭合率(%)在A375量化和分析0.4治疗后24小时μM ABZ。直方图(右)显示相对伤口关闭率为每个组。(c)的结果transwell入侵A375细胞在不同条件下的实验。直方图(右)在每组显示入侵细胞的数量。数据表示为±SD方法。所有实验进行三次。 ; ; ;ns,不重要。

4所示。讨论

黑色素瘤是一种最危险的皮肤癌负责> 90%的患者死亡率(31日出现),特别是在转移,这使得在迅速缩短生存期和黑色素瘤患者的预后很差32]。因此,抑制转移进展是黑色素瘤治疗的主要焦点31日]。有越来越多的证据表明,苯并咪唑可作为抗肿瘤药物的来源作为癌症治疗的药物重新定位(22]。最佳抗剂,ABZ已经验证几个肿瘤模型(22]。然而,没有可用的报告是关于ABZ对黑色素瘤的EMT过程的影响。在目前的研究中,我们的研究结果表明,低剂量ABZ治疗显著下调N-cadherin的表达波形蛋白,Occludin, FN1和调节钙粘蛋白的表达,表明低剂量ABZ能有效逆转的EMT过程体内和体外黑素瘤细胞。

先前的研究显示,ABZ促进活性氧的过量生产的肿瘤细胞(24),导致高氧化应激,伯灵顿激活,细胞凋亡33),从而抑制肿瘤细胞的增殖34]。此外,ABZ抑制胰腺癌细胞的迁移能力28)和HIF-1α端依赖糖酵解在肺癌细胞(35]。有趣的是,以前的体内实验中使用的剂量的ABZ非常高(例如,每天两次(300毫克/公斤28),这表示担忧潜在的细胞毒性和副作用。在这项研究中,我们的研究结果显示,20毫克/公斤ABZ口头(每天一次)的数量显著减少肺部转移性黑色素瘤细胞的焦点,表明低剂量ABZ可以有效地抑制肿瘤转移的小鼠没有预期的毒性和副作用。此外,我们的体外实验的结果表明,低剂量的ABZ (0.4μ米,远低于2μ米(33)),它没有对扩散的影响,显著地抑制黑色素瘤细胞的迁移和入侵能力。综上所述,我们的体外和体内实验数据表明,低剂量ABZ可能是一个有前途的干预策略,防止复发和转移的黑素瘤。

蜗牛,EMT过程中一个重要的转录因子,已被观察到的高表达在恶性黑色素瘤的发展和恶化36,37]。因此,蜗牛的规定表达假设是一个有效的战略控制和预防黑色素瘤转移。一种蛋白激酶/ GSK-3β信号通路是肿瘤细胞生存的主要途径之一(38与异常高的激活在许多恶性肿瘤);具体来说,其失调的发生密切相关,迁移和入侵恶性肿瘤(39,40]。几项研究表明pGSK-3β/ Ser9(活动形式)是显著增加小鼠表皮致癌作用模型,而pGSK-3β/ Tyr216(活性形式)明显降低(41,42或失活GSK-3差别),表明对这些β发生在皮肤致癌作用[43]。我们的研究结果证实ABZ治疗抑制黑素瘤的EMT体外和体内通过抑制一种蛋白激酶/ GSK-3β通路,导致pGSK-3下降β/ Ser9 (GSK-3的活动形式β)表达式。同时,ABZ GSK-3的活性形式的积累增加β(pGSK-3β/ Tyr216)在黑素瘤细胞和改变Tyr216 / Ser9的比率。这种变化的比率可能导致蜗牛的核出口和退化。此外,当与ABZ-treated控制细胞相比,GSK-3β/ Y216F超表达的蛋白质含量并没有改变蜗牛,N-cadherin, ABZ-treated后和钙粘蛋白;这进一步证实pGSK-3β/ Tyr216蜗牛可能下调的蛋白质。然而,ABZ-induced抑制性影响迁移和入侵没有完全颠覆CA-AKT转染,表明pAKT-mediated GSK-3磷酸化β在磷酸化GSK-3 Ser9不是唯一的机制β/ Tyr216 ABZ-treated后积累。我们假设,这可能与改变相关的表达可以使GSK-3磷酸化的激酶β在Tyr21644]。但两GSK-3转换的机制β形式仍然是未知的。因此,ABZ之间的关系和这些特定激酶将在我们未来的探索工作。

有趣的是,GSK-3β似乎在各种癌症中扮演不同的角色。类似于黑色素瘤,先前的研究表明GSK-3β可能作为肿瘤抑制乳腺癌[45]。相比之下,一些研究表明,GSK-3β可能促进肿瘤发生和肿瘤发展。例如,GSK-3β据说蛋白过表达在人类卵巢(46),结肠(47),胰腺(48癌症。因此,ABZ-mediated抑制肿瘤通过一种蛋白激酶/ GSK-3迁移和入侵β/蜗牛通路可能只适用于某些类型的肿瘤。此外,GSK-3的功能的差异β在各种癌症可能会阻碍研究ABZ作为潜在的广谱癌症转移抑制剂。然而,对于黑色素瘤,观察到抑制作用的ABZ EMT过程重要数据,和潜在的临床应用ABZ仍然需要进一步的研究。

5。结论

总之,我们发现低剂量ABZ治疗可以显著抑制黑色素瘤细胞的迁移和入侵的能力。我们验证通过体外和体内实验,发现ABZ可能减少pGSK-3的水平β在Ser9下调pAKT / pGSK-3β。此外,pGSK-3的蛋白质水平β/ Tyr216显著调节,这促进了蜗牛不稳定和pGSK-3β/ Tyr216-mediated退化,最终逆转的EMT黑色素瘤细胞。因此,我们的研究结果提供新颖的见解如何抗寄生虫药物ABZ可以在抑制黑色素瘤转移函数,验证其潜力作为癌症治疗的antimelanoma转移抑制剂。

数据可用性

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为潜在的利益冲突。

确认

作者要感谢徐教授Wenyue提供质粒和实验室支持和Editage (http://www.editage.cn)英语编辑。本研究支持的军队医科大学的优秀人才项目(b - 3253)和中国国家自然科学基金81702443。

补充材料

补充表1:RT-qPCR引物列表。补充图1:pGSK-3的相对比例变化β/ Tyr216和pGSK-3β/ Ser9 A375 ABZ后和B16-F10细胞治疗。(补充材料)