文摘
介绍。皮肌炎(DM)是一种以淋巴细胞浸润为主的慢性自身免疫性疾病主要包括横肌。其发病机理仍未知。本研究旨在调查皮肌炎的潜在的发病机制,识别潜在的生物标记物,并通过信息生物学分析揭示了皮肌炎的发病机理的基因芯片。方法。在这项研究中,我们利用GSE14287 GSE11971基因表达数据集基于综合(GEO)数据库,其中包括总计62 DM样本和正常样本。数据集相结合,和差异表达基因集受到加权基因coexpression网络分析,和中心基因筛选利用基因的蛋白质相互作用网络模块和皮肌炎发展高度相关。结果。总共3关键genes-myxovirus resistance-2(第二),oligoadenylate合成酶1 (OAS1)和oligoadenylate合成酶2 OAS2已经确定结合细胞系样本,分别和3基因的表达被验证。结果表明,第二,OAS1, OAS2 LPS-treated中高度表达的细胞系相比正常细胞系。通路富集分析的结果表明,所有3基因的基因丰富的胞质DNA信号、细胞因子和细胞因子受体相互作用的信号通路;功能富集分析的结果表明,所有3都浓缩在干扰素-α响应和干扰素-γ响应函数。结论。这是重要的发病机制的研究和客观的治疗皮肌炎和皮肌炎的靶向治疗提供了重要的参考信息。
1。介绍
皮肌炎(DM)是一种相对少见特发性多系统炎性疾病发生率小1和100000年的发生率明显高于女性比男性成人患者(1- - - - - -3]。皮肌炎难以准确诊断没有特有的皮肤或肌痛的存在条件(4]。典型的皮肌炎患者通常有一个非常不正常的皮肤表面,伴随着进步,对称的近端肌肉无力。30 - 50%患皮肤疾病患者的肌炎的出现前3 - 6个月,而约10%出现肌肉症状出现之前的皮肤疾病(5,6]。约20%的糖尿病病例分为临床amyopathic皮肌炎(CADM),急性间质性肺损伤密切相关,间质纤维化,有很高的死亡率。接受研究的291名患者CADM [7),70%被诊断出患有nonamyopathic皮肌炎和13% amyopathic皮肌炎。临床上,完全缓解皮肤的病变是很难达到的,它反映了缺乏理解皮肌炎皮肤病变的发病机制(8]。作为传统观点认为,自身免疫性疾病的发病机制主要是由于过度激活效应T细胞,糖皮质激素和免疫抑制药物目前主要治疗皮肌炎(9]。这些药物的使用削弱了体液免疫和细胞免疫,也减少固有免疫的免疫功能,如巨噬细胞和NK细胞,减少身体的抵抗病原体和机会性感染的发生率增加,比如eb病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)血液疾病(10]。
此外,常见的糖尿病皮肤病变,病理因素通常包括空泡的血管周的炎症,接口皮炎,皮肤粘蛋白,增加和keratinised keratin-forming异常细胞(11,12),也出现在皮肤的红斑狼疮(CLE)病变。这可以使它更难区分皮疹与DM从一个涉及蜡烛,使DM的诊断更加困难。此外,皮肌炎与几种类型的癌症密切相关。大多数病人患癌症后1年内皮肌炎的诊断,因此,皮肌炎被认为是多种条件(13]。因此,迫切需要寻找新的诊断治疗皮肌炎的概念和方法,信使rna生物标记物的鉴定和研究相关皮肌炎是必要的。
这个手稿的目的是调查DM的可能的分子机制。通过识别有效的生物标记物通过微阵列分析,然后通过体外实验,验证它们可以阐明糖尿病的发病机制以及寻找靶向治疗DM。
2。方法
2.1。数据源
皮肌炎基因数据集GSE142807 [8)(43 DM样本和正常样本5日)和GSE1197114)(19 DM样本和正常样本4日)是植根于基因表达综合(GEO)数据库,和原始文档处理和解释R包“affy”bioconductor处理和注释(http://www.bioconductor.org)。
2.2。细胞培养和细胞的刺激
人类骨骼肌成肌细胞(HSkM)从ScienCell购买研究实验室,位于美国。成肌细胞培养在杜尔贝科的修改鹰中含4.5毫克/毫升葡萄糖+ MEM 199(比4:1)与20%胎牛血清,100 IU青霉素,100μg链霉素。肌原性的细胞培养在6-well板块5×104 /毫升的浓度在37°C公司5%2孵化器,媒介是重新当细胞融合到60%。脂多糖(LPS) [15)被用来刺激肌原性的细胞准备皮肌炎细胞模型,之后RNA-seq收集细胞。
2.3。RNA提取方法和记录库的形成
我们第一次使用试剂盒试剂从细胞中提取总RNA,然后构造的RNA样品通过RNA质谱使用Nanodrop显微分光光度计。浓缩后的真核mRNA聚(反面通过磁珠低聚糖(dT),信使rna与缓冲打断。我们首先合成cDNA第一链M-MuLV使用分散的信使RNA逆转录酶系统模板和随机寡核苷酸引物,然后用RNaseH退化的RNA链与核苷酸合成cDNA第二链DNA聚合酶I系统。净化双链cDNA end-repaired, A-tailed,测序,和大约200个基点的互补筛选AMPure XP珠子,然后PCR扩增,和PCR产品又净化了AMPure XP珠子,最后,最后的结果。
2.4。差异表达基因筛选
微分分析地理数据集的正常和皮肌炎样本都使用了“limma”在R v4.0.4包;微分分析正常和皮肌炎模型的细胞样本在R v4.0.4使用DEseq2方案执行。筛选标准是罗斯福< 0.05和log2 | FC |≥1。
2.5。加权基因Coexpression网络分析(WGCNA)
WGCNA在R v4.0.4使用WGCNA数据库执行如下。对所有基因之间的相关系数计算构建基因表达相关矩阵。这之后,相关系数与幂指数的加权,以便相关矩阵的表达式转换成邻接矩阵。拓扑矩阵(汤姆)是用来计算之间的关联基因,拓扑矩阵和邻接矩阵转换为基于汤姆值。节点的拓扑矩阵有一个规定的算法不同,和不同的基因模块集群使用节点不同。基因的表达模块eigengene(我)和意义(GS)计算了不同模块与表型联系起来。
2.6。蛋白质相互作用网络(PPI)
蛋白质相互作用的机理建立了在线分析网站,Metascape (https://metascape.org/gp/index.html /主/步骤1)。在Cytoscape MCODE算法用于提取中心基因和蛋白质相互作用网络的可视化。
2.7。KEGG富集分析
我们建立了基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)路径分析的基因在大卫6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。浓缩的结果< 0.05或罗斯福< 0.05表明它是统计学意义。
2.8。基因集富集分析(GSEA)
我们想知道基因表达如何影响疾病和样品分为高、低表达系列中值的基础上的基因表达值。GSEA工具植根于广大研究所(http://software.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp)被用来分析KEGG的浓缩和标志通路在高和低表达系列。分子描述了使标志基因的使用设置数据库(MsigDB,http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)。这些途径被认为是有意义的基因集,当他们满足| NES |≥1,罗斯福< 0.25,值< 0.05。
2.9。统计分析
统计分析使用R软件v4.0.3 (R统计计算的基础,维也纳,奥地利)。单向方差分析与统一的方差为样品,和样品的非参数检验被不均匀的方差。< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。差异表达基因在皮肌炎
GEO数据库被用来获得DM相关表达数据集GSE142807 (43 DM样本和正常样本5日)和GSE11971 DM样本和正常样本4 (19)。差异表达基因筛选后,所有2746个调节基因和382个表达下调基因获得GSE142807(图1(一));所有236个调节基因和663年GSE11971表达下调的基因了。随后,这两个微分基因数据集是结合使用R包“上海广电”的作战功能删除批处理效果,和925基因表达矩阵。功能和通路富集分析成立,结果表明,基因集明显丰富KEGG途径,包括志贺氏菌病、内吞作用、阿尔茨海默病(图1 (c))。去功能富集分析大大丰富了基因集,主要在蛋白结合,有机氮化合物代谢过程和细胞内的分数(数字1 (d)- - - - - -1 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。分析基因Coexpression加权网络
的表达信息结合GSE142807和GSE11971微分基因集作为输入文件,和样本分层集群消除离群样本。确定无标度网络,我们设置功率= 14作为软阈值参数,然后构造一个coexpression矩阵(图2(一个))。网络图是使用动态构造树削减和合并相似模块,我们可以获得3组的925个基因,和这些不同的部分用不同颜色标记符号(图2 (b))。接下来,皮尔逊相关性不同的模块和不同的临床特点进行了计算。
(一)
(b)
(c)
(d)
不同模块的皮尔森相关系数与不同的临床特征计算,获得了皮肌炎和最相关的模块:绿松石模块(图2 (c))。绿松石的基因之间的关联模块和皮肌炎的临床表型分别进行了分析,并与显著线性相关性很好,相关性(图2 (d))。
3.3。蛋白质相互作用网络分析(PPI)
通过在线分析网站Metascape,蓝绿色的基因模块进行分析获得PPI蛋白质交互网络,进一步的基因信息可视化和网络构造(图3)。我们使用MCODE插件在Cytoscape计算网络图中的每个节点的特点,和MCODE最大的分数值4被选中;基因MCODE 4(, 2英镑,OAS2, IFI6, IFIT2, BST2, OAS3, OAS1, IRF1, SAMHD1, RSAD2, EGR1, XAF1, IRF2,主要是丰富的干扰素信号通路和免疫系统的细胞因子信号通路,表中给出1。
3.4。细胞系RNA-Seq分析
基于FPKM价值观中每个基因的细胞系,我们展示不同的表达分布样本基因或转录的表达分布地图(图4(一))。一般来说,基因表达分布图可以用来评估样本之间的差异在图书馆在建筑方面,测序,比较,或量化。此外,根据每个样本的表达结果,我们使用PCA分析和计算样本之间的皮尔逊相关系数确定样本之间的重现性和协助排除异常值(图4 (b))。差异表达基因的细胞系样本火山地块(图所示4 (c)),和所有29得到的差异表达基因,包括27个不同调节基因的差异表达下调基因和2。覆盖差异表达基因的细胞系和样品前基因在MCODE4 3关键基因得到的名称(OAS1, OAS2。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。表达的验证(OAS1, OAS2
第二的表情,OAS1 OAS2在三种不同的数据集进行对比。结果表明,第二,OAS1 OAS2显著调节GSE11971和GSE142807数据集与正常样本相比在皮肌炎样本(数据5(一个)和5 (b))。细胞系样本,第二,OAS1, OAS2 LPS-treated中高度表达的细胞系相比正常细胞系(图5 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.6。基因组富集分析
KEGG信号通路和标志功能富集分析对于每个第二,OAS1, OAS2。KEGG信号通路分析表明,所有3丰富的胞质DNA信号、细胞因子和细胞因子受体相互作用的信号通路;标志功能富集分析的结果表明,所有3都浓缩在干扰素-α响应和干扰素-γ响应函数(图6)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
皮肌炎是由于自身免疫性结缔组织病变,通常包括自体抗体积极性和免疫异常等疾病。它有一个复杂的临床表现,所以几乎没有治愈的希望16,17]。皮肤入侵通常是可见的在所有皮肌炎亚型,和皮肤问题经常持续成功的治疗后的肌肉疾病,极大地影响了患者的生活质量(18]。前瞻性队列研究的74名糖尿病患者接受系统治疗,只有38%的患者缓解皮肤疾病3年随访期间(19]。因为很多医生有困难承认皮肌炎没有肌肉的入侵,这往往会导致误诊,延误治疗和初步调查,和延迟或误诊可以增加患癌症的风险的病人(20.,21]。因此迫切需要适当的生物标志物识别皮肌炎的临床实践。
在这项研究中,我们使用了一个多步的方法来识别差异表达基因在DM基因微阵列数据和执行加权coexpression网络和蛋白质相互作用网络分析。结合体外实验,我们最终确定了三个关键基因:第二,OAS1, OAS2。结果表明,这三个基因高表达在皮肌炎和KEGG途径丰富,包括胞质DNA信号通路和cytokine-cytokine受体信号通路相互作用。特征函数在干扰素-丰富α响应和干扰素-γ响应函数。
尽管皮肌炎的确切发病机理尚未完全阐明,研究表明,机制可能导致upregulation或异常通过干扰素通路转导信号(22,23]。有大量证据表明,干扰素(ifn)被认为是关键的皮肌炎患者皮肤疾病和肌肉疾病。增加I型干扰素信号在皮肤活检发现的病变从16皮肌炎患者(24成人皮肌炎)和皮肤活动已被证明与I型干扰素基因签名(25,26]。干扰素信号可以用来衡量疾病活动在成人和青少年受试者皮肌炎标记,和识别信号的外周血样本可能是另一种更侵入性肌肉活检技术(27]。eb病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)属于人类疱疹病毒(疱疹)家庭,和大多数成年人容易受到这些病毒(28,29日]。EBV感染导致的过度生产干扰素(ifn) T细胞,促炎细胞因子系统性自身免疫的关键。巨细胞病毒可以感染多种细胞类型,包括上皮细胞、造血细胞和结缔组织(30.]。巴尔病毒和巨细胞病毒被发现在自身免疫发挥作用,可能会引发一系列炎症因素加剧免疫系统疾病(31日]。尽管皮肌炎的发病机制目前不清楚,免疫失调被认为是疾病进展的核心。
干扰素(IFN)的抑制剂诱导,myxovirus resistance-2(第二)强力的抑制活性对hiv - 1以及疱疹和乙型肝炎病毒(32,33]。表达(减少允许各种各样的慢病毒,击倒(表达式使用RNA干扰已被证明会降低干扰素-αanti-HIV-1效力(34]。已经表明,第二是一个细胞自动anti-HIV-1阻力系数的有目的的动员可能作为一种新颖的方法治疗艾滋病毒/艾滋病(35]。在目前的研究中,(预计也将是一个潜在的目标治疗皮肌炎。
干扰素(IFN)双链RNA诱导激活酶是所谓的美洲国家组织蛋白质。美洲国家组织的病人包括4成员:OAS1 OAS2, OAS3, OASL [36]。美洲国家组织的表达基因家族在幼年皮肌炎患者高度监管,类似于dsRNA病毒感染的免疫反应(37]。几项研究表明,过度keratinised细胞可能是负责皮肌炎患者皮肤损伤的发展,美洲国家组织的基因可能激活凋亡细胞死亡的机制(38),导致美洲国家组织/ RNaseL通路是一个新的效应BRCA1和干扰素-γ介导细胞凋亡(39]。
目前的研究也有一些缺点,缺乏后续湿实验来验证3基因识别的机制加强的结果,除了这一事实的影响3基因在临床预后尚未研究。这应该是在将来的研究中分析了在临床样品和生存。
总之,总共3与dermatomyositis-MX2的发展,相关的基因OAS1,和OAS2-were确定在本研究中通过一系列的生物信息分析,预计将生物标记物或药物靶点在某种程度上为皮肌炎的诊断。还需要进一步的研究来阐明相关的机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
附加分
第一次探索皮肌炎的潜在发病机理通过生物学的基因芯片分析的信息。第一次识别诊断生物标记和基于WGCNA皮肌炎的生物学通路。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这个工作是由应用程序筛选差异表达基因的生物信息学皮肌炎和相关实验研究(S2019JJKWLH0028)。