N乙酰转移酶1基因敲除提升乙酰辅酶A的水平,减少Anchorage-Independent增长在人类乳腺癌细胞系

文摘

高的表达N乙酰转移酶1 (NAT1)与入侵和小叶乳腺癌癌骨转移后epithelial-to-mesenchymal过渡。我们调查的影响NAT1基因缺失在三个不同的人类乳腺癌细胞株mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1。人类NAT1淘汰使用CRISPR / Cas9 rna技术和两种不同的指南。没有NAT1淘汰赛(KO)细胞系表现出可检测NAT1活动当用其选择性衬底p氨基苯酸(PABA)。内源性乙酰辅酶A的水平(乙酰化路径代数余子式)在NAT1 KO细胞系mda - mb - 231显著升高( )和MCF-7 ( )但不是zr - 75 - 1 ( )。尽管NAT1 KO cell-doubling时间的影响是不一致的在三个乳腺癌细胞系,NAT1 KO细胞系的能力形成anchorage-independent殖民地在软琼脂显著并持续减少的乳腺癌细胞系。NAT1 KO克隆的mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1和减少大于20 -,6 - 7 -折叠anchorage-independent细胞生长,分别,而他们的父母细胞系( , ,和 ,分别)。结果表明,NAT1可能是细胞的重要调节器乙酰辅酶A水平,强烈建议NAT1表达升高乳腺癌导致anchorage-independent增长特性并最终转移潜能。

1。介绍

人类的芳基胺N乙酰转移酶1 (NAT1)催化的转移的乙酰基乙酰辅酶A (AcCoA)芳基胺和肼基板1,2]。人类NAT1也催化水解的AcCoA叶酸的存在(3,4]。NAT1有无处不在的表达受多种机制(5]。高架NAT1表达式与入侵和小叶乳腺癌癌(6]。额外的研究报道高架NAT1表达雌激素受体阳性肿瘤(7- - - - - -9)以及与骨转移后epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT) [10,11]。

最近的一份报告表明,句老鼠表达高水平的老鼠N乙酰转移酶2 (NAT2;直接同源人类NAT1)活动表现出更多的乳腺肿瘤,这个发现是独立的致癌物质代谢(12]。抑制的影响或超表达人类NAT1先前的研究的焦点(13- - - - - -17]。有趣的是,mda - mb - 231细胞与NAT1活动增加显示内生AcCoA水平较低,而父母的细胞系(17]。这些观察,连同NAT1的广泛组织分布和其在几乎所有物种18]AcCoA及其催化水解的能力,建议NAT1在癌形成的作用可能与AcCoA的监管。

在目前的研究中,我们利用CRISPR / Cas9调查的影响NAT1淘汰赛(KO)内源性AcCoA水平和细胞生长特性在人类乳腺癌细胞系来源于三个单独的胸膜腔积液的恶性乳腺癌患者乳腺癌研究中经常使用。

2。材料和方法

2.1。建设NAT1 KO细胞系

mda - mb - 231、MCF-7和zr - 75 - 1乳腺癌细胞系来源于写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。mda - mb - 231是雌激素受体阴性,孕激素受体阴性,her2阴性。MCF-7是雌激素受体阳性、孕酮受体阳性和her2阴性。zr - 75 - 1是雌激素受体阳性、孕酮受体阳性,her2阳性。乳腺癌mda - mb - 231细胞与一个单一的FRT位点(生活技术,大岛,纽约)和一个非特异性炒shRNA插入FRT位点作为父mda - mb - 231细胞系。建设这个细胞系是前面描述的16]。mda - mb - 231和MCF-7细胞在DMEM培养媒体,高葡萄糖(4.5 g / L)的胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(2毫米),和笔/喉炎的症状(1%)。zr - 75 - 1在rpmi - 1640细胞培养的胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(2毫米),和笔/喉炎的症状(1%)。细胞系的生长在一套湿润孵化器在37°C公司为5%₂。地平线发现集团(英国剑桥)设计了5种不同gRNAs NAT1、和DNA 2.0公司(美国Menio公园,CA)克隆gRNAs Cas9表达向量表达dasher-GFP标签。最初,每个5 gRNA / Cas9向量在每个瞬变转染细胞系使用Amaxa Nucleofector II (Lonza Allendale,新泽西,美国)。48小时后,转染细胞收获和DNA分离。土地测量员突变检测设备(美国Transgenomics,奥马哈市)是用来确定每个gRNA有效性的有效诱导DNA链断裂的能力。gRNAs # 2和# 5是最有效地诱导DNA链断裂,分别选择KO NAT1如下所述。所选gRNA序列如下:gRNA # 2,CCAGATCCGAGCTGTTCCCTTTG(protospacer临近主题加粗字体所示;职位,93 - 112年从开始斜体字体所示)或gRNA # 5, GAAAGAATTGGCTATAAGAAGTCTgg(protospacer临近主题加粗字体所示;职位26-45从头斜体字体所示)。

父mda - mb - 231细胞系上面描述的转染# 2和# 5 gRNA / Cas9向量分别转染细胞排序后48小时以上GFP荧光(MoFlo XDP,贝克曼库尔特公司。肯德尔,FL,美国)。MCF-7 zr - 75 - 1细胞转染和# 2和# 5 gRNA / Cas9分别Lipofectamine 3000(表达载体、钙、美国),48小时后转染细胞GFP荧光如前所述排序。镀GFP-positive细胞收集和低细胞密度,这样个人独特的克隆可能被孤立。几周后,单个细胞发展成足够大殖民地利用胰蛋白酶细胞克隆缸板和转移96孔培养板。大约25到50分离克隆,随机抽取的,每个细胞gRNA,通道,直到近汇合的6-well板,然后测试PABA NAT1活动。GFP-positive克隆与察觉PABA NAT1活动被选作进一步鉴定。NAT1开放阅读框被测序。我们选择的瞬时转染gRNA / Cas9蛋白质脱靶效应降到最低;因此;gRNA / Cas9质粒只存在于细胞在短时间内(48 - 96小时),而不是稳定的长期的表达gRNA / Cas9编辑机械将存在下去。

2.2。NAT1基因的测序gRNAs # 2和# 5 KO克隆

基因组DNA mda - mb - 231隔绝,MCF-7, zr - 75 - 1 NAT1 KO细胞系。NAT1开放阅读框放大了PCR克隆到pcDNA™3.1 / V5-His-TOPO®(表达载体、钙、美国)遵循制造商的建议。威尼斯平底渔船的每个细胞克隆反应变成了一个全球化学主管大肠杆菌。对于每个NAT1 KO细胞系,五个转变大肠杆菌殖民地被选中,一夜之间长大。文化质粒纯化的细菌被收获。纯化质粒和引物DNA测序(欧陆坊,路易斯维尔,肯塔基州,美国)来确定基地gRNA / Cas9导致的变化。

2.3。细胞系验证

转基因mda - mb - 231 MCF-7和zr - 75 - 1细胞系验证了上述写明ATCC短串联重复序列(STR)分析验证服务。

2.4。原位体外和N乙酰化作用

体外N进行了乙酰化化验使用NAT1-selective衬底PABA,和N-acetyl-PABA由高效液相色谱法分离和测定的数量(高效液相色谱)如前所述16]。简单地说,包含50酶反应μL适当稀释细胞溶解产物,PABA (300μM), AcCoA 37°C(1毫米)孵化出了10分钟。三个独立的测量(n= 3)一式三份完成后执行每个细胞株。在体外N乙酰化作用分析使用NAT2-selective衬底磺胺甲嘧啶酶进行分析如前所述[19]。简单,反应包含从父母和NAT1 KO细胞溶解产物线细胞系,300μM磺胺甲嘧啶,1毫米AcCoA孵化在37°C的120分钟。反应被终止的1/10体积的1 M醋酸。反应管离心去除沉淀蛋白。磺胺甲嘧啶和N-acetyl-sulfamethazine被反相高效液相色谱分离和量化。三个独立的测量(n= 3)一式三份完成后执行每个细胞株。这个试验的条件下,检测极限是0.005 nmol /分钟/毫克的蛋白质。

测量NAT1-catalyzedN乙酰化作用原位是由强化媒体用已知浓度的PABA如前所述[20.]。简单地说,这些细胞被孵化的37°C与媒体包含500 48小时μM PABA。N-acetyl-PABA由高效液相色谱分离和测定的数量(如前所述)(16]。单独决定的数量对mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1是3、4和4分别。

2.5。NAT1和NAT2 sensing西方染色

细胞(1.5×10⁵)被镀成96 -黑/明确的底板块(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和隔夜37°C和5%孵化有限公司₂。一旦附加到板,细胞用PBS然后用3.7%甲醛固定在板在室温下在PBS为20分钟。修复后,细胞permeabilized使用0.1% Triton-X100 PBS和恒定搅拌5分钟,这个过程重复了4次。细胞被封锁在PBS奥德赛®阻断缓冲区(美国东北LI-COR生物科学,林肯)与恒定搅拌1.5小时。与兔anti-NAT1阻塞后,细胞被孵化(ab109114 (1:200) Abcam,剑桥,英国)或兔子NAT2 (ab194114 (1:10 0) Abcam)β肌动蛋白(A2228 (1:200), Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)一夜之间在4°C不断搅拌。由于高人类NAT1和NAT2之间的相似性,我们评估主要抗体的特异性人类NAT1和NAT2。特异性ab109114人类NAT1大于NAT2是4倍,和特异性ab194114人类NAT2是7倍大于NAT1准备(手稿)。主要抗体孵育后,盘子洗了5次,0.1%在PBS渐变20 5分钟。二次检测进行了使用IRDye®800 cw山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(1:1200)或IRDye®680山羊anti-Mouse免疫球蛋白(1:1200),(美国东北LI-COR生物科学,林肯)孵化为60分钟。最后,细胞用0.1%渐变20在PBS。NAT1、NAT2β肌动蛋白同时可视化使用奥德赛红外成像扫描仪(LI-COR生物科学)使用680纳米和800纳米通道频道。相对荧光单位(RFUs)允许一个定量分析。相关蛋白表达计算除以RFU NAT1、NAT2 RFU的通道(800海里)β肌动蛋白通道(680海里)。蛋白表达在NAT1 KO细胞分裂的蛋白质表达父母的细胞系来确定褶皱的变化。生成的数据从4独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母及其NAT1 KO细胞系。

2.6。内源性AcCoA水平

内源性AcCoA内mda - mb - 231水平,MCF-7, zr - 75 - 1父母和用高效液相色谱检测NAT1 KO细胞系如前所述[16与一些细微的修改。mda - mb - 231、MCF-7和zr - 75 - 1细胞系镀是一式三份的密度1×10⁶细胞板每10厘米,允许成长。镀后七十二小时,细胞被洗一次1 x PBS和分离从板1.0毫升胰蛋白酶。细胞从3,10厘米板结合,resuspended完全媒体和统计。后续步骤中所有细胞和溶菌产物保存在冰。收集细胞被洗一次冰冷的PBS和转移到1.5毫升微型离心机管。离心收集的悬浮细胞和上层的丢弃。删除任何剩余PBS,这些细胞被完全resuspended 50μL冰冷的1 x PBS,然后立即通过添加50个细胞溶解μL冷10% 5-sulfosalicylic酸与涡流15秒。细胞溶解细胞孵化冰上前10分钟在13000×g离心10分钟。上层清液注入在C18反相高效液相色谱柱(250 mm×4毫米;5μ孔隙大小)(默克公司,达姆施塔特,蒙古包)。高效液相色谱法分离和定量的AcCoA实现如前所述[16]。生成的数据从8、12和3个独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系,分别。

2.7。细胞倍增时间

倍增时间为每个父母和NAT1 KO细胞系是由镀每个细胞株融合水平的细胞系充足的发展空间会给至少7天或168小时。相同数量的细胞被镀对父母和为每个细胞株NAT1 KO细胞系。细胞被镀在6-well盘子一式三份,并允许增长为7天(168小时)。细胞计数和倍增时间计算使用在线计算器(http://www.doubling-time.com/compute.php)。单独的数量倍增时间决定对mda - mb - 231, MCF-7,和zr - 75 - 1细胞是3,3和4分别。

2.8。安克雷奇,依赖安克雷奇,独立的增长分析

安克雷奇,依赖增长进行了化验如前所述[16]。短暂,细胞(300 /)在6-well盘子镀一式三份,并允许增长了2周。可见殖民地与结晶紫染色后手动计算。生成的数据从6 3和3独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系,分别。安克雷奇-独立的增长进行了化验如前所述[16]。短暂,anchorage-independent增长化验是由镀细胞(6000细胞/)在1.5毫升的低熔点的温度琼脂糖(0.3%)在完成媒体1.5毫升的基础层高贵琼脂完全媒体(0.5%)。总体积是3毫升每个6-well板。细胞被镀一式三份,增长了2周。殖民地(包含> 4单个细胞)与结晶紫染色后手动计算。生成的数据从3独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系。

2.9。统计分析

差异mda - mb - 231和MCF-7父母和NAT1 KO细胞株进行分析的意义方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。差异zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系进行了分析,供学生的意义t以及。所有统计分析使用GraphPad棱镜v6.0c(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。NAT1基因和氨基酸序列

NAT1基因测序的mda - mb - 231 gRNA # 2(三分之一的克隆)KO细胞系显示删除单个胞嘧啶在96基地(bp)的翻译起始密码子(表1)。这单核苷酸缺失导致移码突变导致氨基酸49后过早终止密码子290(表2)。mda - mb - 231 gRNA # 5(克隆5-50)KO细胞系有两个核苷酸删除在43和44 bp从翻译起始密码子表1)。这个删除导致过早终止密码子氨基酸密码子290年14后,立即终止NAT1翻译(表2)。

的NAT1基因测序MCF-7 gRNA # 2(克隆2 - 4)KO细胞系表现出34 bp删除开放阅读框,跨度从95年到129年英国石油公司(表1)。这个删除段DNA导致移码突变导致过早停止密码后38氨基酸(表2)。的MCF-7 gRNA # 5(克隆5 - 20)KO细胞系有两个不同的删除(表1)。第一个删除是单核苷酸删除42岁英国石油(bp),另一是43至48 bp的删除与插入额外的腺苷在同一地区。删除和插入这些导致过早停止密码后氨基酸密码子序列(表232)。

NAT1基因测序的zr - 75 - 1 gRNA # 2(2 - 10)克隆KO细胞系显示一个腺苷插入在开放阅读框(表95个基点1)。这插入导致移码突变造成37氨基酸(表后过早终止密码子2)。

3.2。在体外和原位PABAN乙酰化作用

的体外N乙酰化作用的PABA父母细胞系为14.4±2.8,39.0±5.9,和121±19 nmol /分钟/ mda - mb - 231毫克,MCF-7,分别和zr - 75 - 1细胞系(图1(一))。gRNA # 2和# 5克隆细胞系的活动水平降低到低于检测极限(0.05 nmol /分钟/毫克;图1(一))。的N乙酰化作用的PABA原位为遵循相同的模式在体外活动。N乙酰化作用的活性PABA亲本细胞株为1.13±0.01,2.20±0.35,6.56±0.87 nmol /人力资源/百万对mda - mb - 231细胞,MCF-7,分别和zr - 75 - 1细胞系(图1 (b))。gRNA # 2和# 5的克隆,PABAN乙酰化作用原位被减少到低于检测极限(0.20 nmol /人力资源/百万细胞图吗1 (b))。

3.3。人类NAT1和NAT2蛋白质水平

相对NAT1和NAT2蛋白表达是评估在西方染色- sensing协议中描述的材料和方法。NAT1蛋白表达明显(方差分析, )减少mda - mb - 231 gRNA # 2和gRNA # 5的MCF-7 gRNA # 2和gRNA # 5,和zr - 75 - 1 gRNA # 2 NAT1 KO细胞相比,各自父母的细胞(图2(一个))。相对NAT2蛋白表达在mda - mb - 231 gRNA # 2和gRNA # 5 MCF-7 gRNA # 2和gRNA # 5 NAT1 KO细胞显著增加(方差分析, )相比各自父母的细胞系而无显著变化( )在NAT2在zr - 75 - 1蛋白表达观察gRNA # 2 NAT1 KO细胞相比,父母(图2 (b))。NAT2增加蛋白质的检测后,磺胺甲嘧啶NAT2酶化验在材料和方法进行了描述,但NAT2活动低于检测极限(0.005 nmol /分钟/毫克蛋白)在所有的细胞系进行测试。

3.4。内源性AcCoA水平

内源性的细胞内mda - mb - 231父母AcCoA线是17.8±1.1 pmoles /百万细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆为33.1±1.8,35.5±2.6 pmoles /百万细胞,分别,这两个相比明显升高父母细胞系mda - mb - 231 (n= 8;方差分析, )(图3)。

MCF-7父母细胞系有内生AcCoA 18.7±0.9 pmoles /百万水平细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆分别为27.6±2.6,27.0±2.7 pmoles /百万细胞,分别,这两个明显升高MCF-7相比,他们父母的细胞系(n= 12;方差分析, )(图3)。

zr - 75 - 1父母的细胞系有内生AcCoA 43.2±3.6 pmoles /百万水平细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2 NAT1 KO为33.6±8.4 pmoles /百万细胞(n= 3;学生的t以及, )(图3)。

3.5。细胞倍增时间

翻倍的mda - mb - 231父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系分别为24.8±0.3,30.3±0.4,30.9±0.3人力资源,分别为(n= 3)。同时mda - mb - 231 NAT1 KO细胞系有显著(方差分析, )增加一倍时间比父母的mda - mb - 231细胞系(图4(一))。

的翻倍MCF-7父母的细胞系和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞株分别为41.4±0.4,45.3±6.2,38.8±8.5人力资源,分别为(n= 3),没有显著差异(方差分析, )而父母MCF-7细胞系(图4(一))。

翻倍的zr - 75 - 1父母的细胞系和gRNA # 2 NAT1 KO细胞系分别为37.0±2.8,63.1±2.9人力资源,分别为(n= 4)。zr - 75 - 1的倍增时间gRNA # 2 NAT1 KO细胞系明显(学生的t以及, )父母相比升高zr - 75 - 1细胞系(图4(一))。

3.6。安克雷奇,依赖集落形成

安克雷奇,依赖集落形成试验允许癌细胞能力的确定形式殖民地当附加到表面。安克雷奇——的结果依赖集落形成试验显示殖民地形成的数量对mda - mb - 231父母的殖民地,gRNA # 2,和gRNA # 5 NAT1 KO细胞系为40.7±2.5,51.3±1.6,54.8±6.8殖民地,分别。安克雷奇,依赖殖民地的mda - mb - 231和NAT1 KO细胞系互相没有统计学差异(方差分析, ;n=(图6)4 (b))。

MCF-7父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系安克雷奇-依赖集落形成为68.2±8.6,86.2±9.9,96.7±9.1殖民地,分别互相没有统计学差异(方差分析, ;n=(图3)4 (b))。

zr - 75 - 1父母和gRNA # 2 NAT1 KO细胞安克雷奇-依赖集落形成是102±5和39.4±6.5殖民地,互相不同统计(学生的t以及, ;n=(图3)4 (b))。

3.7。安克雷奇,独立的集落形成

安克雷奇,独立的“软琼脂集落形成试验(也称为分析”)允许形成菌落测定癌细胞能力缺乏细胞表面的附件。父母mda - mb - 231细胞系安克雷奇——形成的独立的殖民地的水平明显高于NAT1 KO克隆(图4 (c))。殖民地的数量由mda - mb - 231父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系1070±76,48.3±17.2,23.4±7.0殖民地,分别(方差分析, ;n= 3)。殖民地的数量由两个NAT1 KO细胞系并没有统计上的不同( )。

MCF-7父母细胞系形成安克雷奇-独立的殖民地在更高的级别上比MCF-7 NAT1 KO克隆(图4 (c))。殖民地的数量由MCF-7父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系195±9,33.7±6.8,13.8±6.6,分别。安克雷奇,独立的形成的殖民地MCF-7父母细胞系均明显高于gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆(方差分析 ;n= 4)。的MCF-7 gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆没有统计( )不同于彼此。

父母zr - 75 - 1细胞系形成安克雷奇-独立的殖民地在更高的级别上比NAT1 KO细胞系克隆(图4 (c))。殖民地的数量由zr - 75 - 1父母和gRNA # 2 NAT1 KO细胞系为45.6±13.4,6.00±1.84,分别。安克雷奇,独立的殖民地形成的zr - 75 - 1亲本细胞系均明显高于gRNA # 2 NAT1 KO克隆(学生的t以及, ;n= 3)。

4所示。讨论

我们调查的影响NAT1基因缺失在三个不同的人类乳腺癌细胞株mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1。人类NAT1淘汰使用CRISPR / Cas9 rna技术和两种不同的指南。没有NAT1 KO细胞系表现出可检测NAT1活动当测量使用选择性衬底PABA。内源性AcCoA水平(乙酰化路径代数余子式)在NAT1 KO细胞系mda - mb - 231显著升高( )和MCF-7 ( )但不是zr - 75 - 1 ( )。虽然NAT1 KO的影响细胞倍增时间不一致在三个乳腺癌细胞系,NAT1 KO细胞系的能力形成anchorage-independent殖民地在软琼脂显著并持续减少的乳腺癌细胞系。NAT1 KO克隆的mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1和减少大于20 -,6 - 7倍anchorage-independent细胞生长,分别,而他们的父母细胞系( , 和 ,分别)。

CRISPR / Cas9被用于制造稳定NAT1人类mda - mb - 231 KO, MCF-7, zr - 75 - 1乳腺癌细胞系。我们使用两种不同gRNA允许我们区分具体NAT1 KO影响而引起的脱靶效应gRNA绑定和变异在特异性的网站(s)。我们也用一个乳腺癌mda - mb - 231细胞与一个单一的FRT位点和非特异性炒shRNA插入FRT位点为mda - mb - 231父母细胞系。该细胞系转染gRNA # 2和# 5,以方便比较的结果与前所述NAT1 KO NAT1击倒[16]。

我们孤立单一的克隆从mda - mb - 231和MCF-7细胞行gRNA # 2和# 5。我们不能孤立NAT1 KO克隆使用gRNA # 5 zr - 75 - 1细胞系,可能是因为增长率下降zr - 75 - 1 NAT1 KO细胞系。其他团体也调查了NAT1 KO mda - mb - 231和其他细胞系CRISPR / Cas9 [21,22]。淘汰赛策略的先前的研究不同于我们在以下方面:(1)不同gRNA序列使用导致DNA断裂和(2)先前的研究使用了一个线性供体DNA质粒携带选择标记稳定整合到破损的网站。我们选择瞬时转染脱靶效应降到最低,所以gRNA / Cas9质粒存在于细胞在短时间内(72 - 96年人力资源)。我们也试图评估的影响NAT1拯救gRNA # 2和# 5 NAT1 KO mda - mb - 231和MCF-7细胞。虽然我们最初测量PABA NAT1 NAT1救援活动确认成功,NAT1活动不再是可检测在实验测量AcCoA水平或细胞生长特性,因此我们不能描述NAT1救援的效果。

NAT1 mda - mb - 231 KO, MCF-7, zr - 75 - 1 PABA水平降低N乙酰化作用的限制以下检测两种在体外和原位。尽管这个NAT1 KO的功能验证,对内源性AcCoA水平和癌症细胞生长的影响并没有完全一致的跨不同的细胞系。NAT1活动的KO gRNA # 2和gRNA # 5在乳腺癌mda - mb - 231细胞引起温和但显著( )海拔在倍增时间但无论是gRNA # 2或gRNA # 5造成显著( )海拔的倍增时间MCF-7乳腺癌细胞系。NAT1 KO zr - 75 - 1细胞使用gRNA # 2导致了1.7倍( )海拔在倍增时间。之前的研究在我们的实验室发现,击倒的NAT1 mda - mb - 231约40%没有显著改变倍增时间(16]。击倒HT-29 NAT1 85%的细胞显示出类似的指数增长;然而,NAT1击倒细胞达到饱和密度比控制细胞(15]。NAT1 KO细胞,细胞死亡增加细胞融合时(15]。王等人证明了低增长HT29细胞葡萄糖(1毫米)增强后NAT1 KO (21]。我们进行实验与mda - mb - 231和zr - 75 - 1父母和NAT1 KO在存在低(1 g / L或5.5毫米)或没有葡萄糖补充10毫米半乳糖NAT1 KO是否会改变这些营养条件下细胞倍增时间。细胞生长在低的存在(1 g / L或5.5毫米)或没有葡萄糖补充10毫米半乳糖增长更慢;然而,父母之间的关系和NAT1 KO细胞系并没有从细胞生长在不同标准的媒体。

NAT1显著和显著水平( )减少每个NAT1 KO细胞线。在mda - mb - 231和MCF-7细胞,NAT1 KO显著增加( )在NAT2蛋白质。然而,NAT2酶活性在父母或NAT1 KO细胞系低于检测极限。

人类NAT1水解能力AcCoA [3,4)和部分击倒NAT1 mda - mb - 231细胞据报道增加内源性AcCoA水平(16]。在目前的研究中,我们测量了内生的AcCoA mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系。mda - mb - 231和MCF-7 NAT1 KO gRNA # 2和gRNA # 5显示显著( )增加AcCoA水平相对于各自父母的细胞系。然而,zr - 75 - 1 NAT1 KO细胞系没有显示相同的增加AcCoA比亲本细胞系mda - mb - 231和MCF-7细胞系。结果对mda - mb - 231和MCF-7 NAT1 KO细胞系类似于观察到当NAT1是撞倒了mda - mb - 231细胞成分(16]。

AcCoA被认为是中央代谢中间物的水平反映了细胞的一般精力充沛的状态(23]。此外,AcCoA浓度不仅影响多个活动或特异性的酶也影响蛋白质的乙酰化概要,包括组蛋白。例如,众所周知,N^ε赖氨酸残基的氨基可以转译后的修改通过乙酰化作用的过程许多重要的细胞过程,包括能量代谢,有丝分裂,和自噬(规定23,24]。值得注意的是,许多赖氨酸乙酰转移酶相对较高K_D(低亲和力)AcCoA [25],因此细胞AcCoA水平变化可能影响酶活性和随后的乙酰化作用底物蛋白质。有趣的是,在两个细胞系的测试在当前的研究中,NAT1不足导致显著增加AcCoA的细胞水平,这表明细胞水平AcCoA,至少部分取决于NAT1活动在这些细胞系。支持这一点,之前我们也有报道,鼠胚胎成纤维细胞从快速乙酰化器句老鼠(高水平的老鼠NAT2同源人类NAT1)较低水平的比来自AcCoA慢乙酰化器句老鼠,有低水平的老鼠NAT2 [12]。NAT1使用AcCoA期间N乙酰化作用的内源性和外源性底物,而且催化的水解AcCoA叶酸辅酶a的存在(3,4]。可能是细胞水平的AcCoA NAT1负面影响的活动。在此基础上,我们可以推测,NAT1反过来可能导致损耗增加水平的AcCoA,发生在两三个癌症细胞系的调查在我们的研究中。损耗的NAT1 zr - 75 - 1细胞并没有导致增加AcCoA水平尽管他们表现出最高的NAT1活动三个乳腺癌细胞系中测试。或者,高浓度的AcCoA两KO细胞系(即。,mda - mb - 231和MCF-7)may not be a direct effect of NAT1 depletion but rather reflect changes in their metabolic status. Whether or not elevated levels of AcCoA in NAT1 KO cell lines translate into alterations in protein acetylation profile within these cells remains unknown. Furthermore, the significant reductions in cell growth rate as well as anchorage-dependent and anchorage-independent growth observed in NAT1 KO ZR-75-1 cells occurred in the absence of concomitant changes in AcCoA levels. Thus, the relationship of AcCoA levels to alterations in cancer growth properties observed in NAT1 KO cells requires further investigation.

Anchorage-dependent集落形成人类mda - mb - 231和MCF-7没有显示显著差异( )和父母之间NAT1 KO细胞系。这些结果与先前的研究相同,击倒NAT1 mda - mb - 231细胞的成分并没有改变细胞的能力形成anchorage-dependent殖民地(16]。尽管NAT1 KO zr - 75 - 1细胞系殖民地形成少于父母zr - 75 - 1,这种差异可能是由于这样的事实,zr - 75 - 1 KO细胞增长慢于zr - 75 - 1的细胞系。

NAT1 KO细胞系的能力形成anchorage-independent殖民地在软琼脂显著并持续减少的mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1乳腺癌细胞系。这个数据与以前的结果一致后击倒NAT1的shRNA mda - mb - 231 (16]和HT-29 [14,15)细胞。虽然明显下降的能力zr - 75 - 1 NAT1 KO细胞形成anchorage-independent殖民地可能部分归因于其增长率(即慢。,更高的细胞倍增时间;图4(一)),下降的幅度(从45.6±13.4殖民地在亲代细胞6.00±1.84殖民地NAT1 KO细胞;一个大约7.6倍减少)大于与anchorage-dependent观察集落形成(102±5殖民地的亲代细胞39.4±6.5殖民地NAT1 KO细胞;一个大约2.6倍减少)。在此基础上,似乎zr - 75 - 1细胞的能力,形成殖民地anchorage-independent地缺乏NAT1进一步受损。

Anchorage-independent增长是转移性肿瘤的特点之一。肿瘤细胞通常失去上皮特性和通过一个复杂和动态EMT获得间充质属性。通过EMT,肿瘤细胞被认为获得能动性和抗细胞凋亡增加,最终导致转移(26]。Savci-Heijink专门和他的同事们分析了基因表达特征与乳腺癌的骨转移的发展主要使用乳房肿瘤样本和报告NAT1的三个基因的表达水平增加高度相关,EMT-activated乳腺肿瘤(27]。在后续的研究中,他们也表现出积极的高相关性免疫染色NAT1、EMT签名基因的表达在乳腺癌(10),这表明NAT1表达增加可能导致乳腺癌和随后的EMT转移潜能。支持这一概念,我们发现NAT1 KO减少anchorage-independent增长三个乳腺癌细胞系进行测试。同样,为牛羚等人曾报道,RNAi-mediated击倒的NAT1结肠恶性腺瘤细胞系,HT-29,导致增加增长通过信息接触抑制和衰减anchorage-independent增长的软琼脂(15]。在以后的研究中,同一组沉默NAT1三阴性乳腺癌细胞系,检测细胞的侵袭性在体外和在活的有机体内。重要的是,NAT1击倒在mda - mb - 231细胞导致显著减少的能力转移至肺部和殖民当注入裸鼠14),这表明NAT1水平增加乳腺癌细胞可以促进他们的转移特性在活的有机体内。

总之,我们摧毁了人类NAT1 CRISPR / Cas9技术使用两种不同的gRNA乳腺癌细胞在三个不同的线。我们验证完成NAT1 KO PABA的测量N乙酰化作用在体外和原位和测量的NAT1-specific免疫反应性的蛋白质。KO NAT1引起显著降低mda - mb - 231细胞生长和zr - 75 - 1,但不是MCF-7 NAT1 KO细胞相对于各自父母的细胞系。NAT1 KO导致显著增加细胞AcCoA mda - mb - 231和MCF-7细胞而不是zr - 75 - 1细胞相对于父母的细胞系。每个NAT1 KO细胞系显示数量的急剧减少的殖民地形成anchorage-independent方式相对于各自父母的细胞系。虽然看来NAT1 KO可以影响细胞的形态,和癌症细胞系的相互作用,需要进一步调查到NAT1损耗是否最终改变转移潜能在活的有机体内。

缩写

AcCoA:	Acetyl-Coenzyme一
NAT1:	N乙酰转移酶1
NAT2:	N乙酰转移酶2
PABA:	帕拉氨基苯酸
EMT:	Epithelial-to-mesenchymal过渡
gRNA:	指导RNA
柯:	基因敲除
PBS:	磷酸盐
EDTA:	乙二胺四乙酸
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
RFU:	相对荧光单位
高效液相色谱法:	高效液相色谱法。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

信息披露

部分这项工作组成部分实现由马库斯·w·Stepp路易斯维尔大学的药理学和毒理学博士学位,其目前的地址是查尔斯河,亚什兰,俄亥俄州44805。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

马库斯·w·Stepp劳尔·a . Salazar-Gonzalez Kyung香港,Mark a .娃娃,和大卫·w·海因参与研究设计。马库斯·w·Stepp劳尔·a . Salazar-Gonzalez和马克·a·娃娃进行实验。马库斯•Stepp (george w . bush)和马克·a·贡献新试剂或分析工具。马库斯•Stepp (george w . bush)和马克·a·娃娃进行数据分析。马库斯·w·Stepp劳尔·a . Salazar-Gonzalez Kyung香港,Mark a .娃娃,和大卫·w·恩写或导致了写作的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作的部分支持由国家环境科学研究所(批准USPHS T32-ES011564)。

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