mda - mb - 231、MCF-7和zr - 75 - 1乳腺癌细胞系来源于写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。mda - mb - 231是雌激素受体阴性,孕激素受体阴性,her2阴性。MCF-7是雌激素受体阳性、孕酮受体阳性和her2阴性。zr - 75 - 1是雌激素受体阳性、孕酮受体阳性,her2阳性。乳腺癌mda - mb - 231细胞与一个单一的FRT位点(生活技术,大岛,纽约)和一个非特异性炒shRNA插入FRT位点作为父mda - mb - 231细胞系。建设这个细胞系是前面描述的 16]。mda - mb - 231和MCF-7细胞在DMEM培养媒体,高葡萄糖(4.5 g / L)的胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(2毫米),和笔/喉炎的症状(1%)。zr - 75 - 1在rpmi - 1640细胞培养的胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(2毫米),和笔/喉炎的症状(1%)。细胞系的生长在一套湿润孵化器在37°C公司为5%₂。地平线发现集团(英国剑桥)设计了5种不同gRNAs NAT1、和DNA 2.0公司(美国Menio公园,CA)克隆gRNAs Cas9表达向量表达dasher-GFP标签。最初,每个5 gRNA / Cas9向量在每个瞬变转染细胞系使用Amaxa Nucleofector II (Lonza Allendale,新泽西,美国)。48小时后,转染细胞收获和DNA分离。土地测量员突变检测设备(美国Transgenomics,奥马哈市)是用来确定每个gRNA有效性的有效诱导DNA链断裂的能力。gRNAs # 2和# 5是最有效地诱导DNA链断裂,分别选择KO NAT1如下所述。所选gRNA序列如下:gRNA # 2, CCA GATCCGAGCTGTTCCCTTTG(protospacer临近主题加粗字体所示;职位,93 - 112年从开始斜体字体所示)或gRNA # 5, GAAAGAATTGGCTATAAGAAGTCT gg(protospacer临近主题加粗字体所示;职位26-45从头斜体字体所示)。

父mda - mb - 231细胞系上面描述的转染# 2和# 5 gRNA / Cas9向量分别转染细胞排序后48小时以上GFP荧光(MoFlo XDP,贝克曼库尔特公司。肯德尔,FL,美国)。MCF-7 zr - 75 - 1细胞转染和# 2和# 5 gRNA / Cas9分别Lipofectamine 3000(表达载体、钙、美国),48小时后转染细胞GFP荧光如前所述排序。镀GFP-positive细胞收集和低细胞密度,这样个人独特的克隆可能被孤立。几周后,单个细胞发展成足够大殖民地利用胰蛋白酶细胞克隆缸板和转移96孔培养板。大约25到50分离克隆,随机抽取的,每个细胞gRNA,通道,直到近汇合的6-well板,然后测试PABA NAT1活动。GFP-positive克隆与察觉PABA NAT1活动被选作进一步鉴定。NAT1开放阅读框被测序。我们选择的瞬时转染gRNA / Cas9蛋白质脱靶效应降到最低;因此;gRNA / Cas9质粒只存在于细胞在短时间内(48 - 96小时),而不是稳定的长期的表达gRNA / Cas9编辑机械将存在下去。

基因组DNA mda - mb - 231隔绝,MCF-7, zr - 75 - 1 NAT1 KO细胞系。NAT1开放阅读框放大了PCR克隆到pcDNA™3.1 / V5-His-TOPO®(表达载体、钙、美国)遵循制造商的建议。威尼斯平底渔船的每个细胞克隆反应变成了一个全球化学主管 大肠杆菌。对于每个NAT1 KO细胞系,五个转变 大肠杆菌殖民地被选中,一夜之间长大。文化质粒纯化的细菌被收获。纯化质粒和引物DNA测序(欧陆坊,路易斯维尔,肯塔基州,美国)来确定基地gRNA / Cas9导致的变化。

转基因mda - mb - 231 MCF-7和zr - 75 - 1细胞系验证了上述写明ATCC短串联重复序列(STR)分析验证服务。

体外N进行了乙酰化化验使用NAT1-selective衬底PABA,和 N-acetyl-PABA由高效液相色谱法分离和测定的数量(高效液相色谱)如前所述 16]。简单地说,包含50酶反应 μL适当稀释细胞溶解产物,PABA (300 μM), AcCoA 37°C(1毫米)孵化出了10分钟。三个独立的测量( n= 3)一式三份完成后执行每个细胞株。在体外 N乙酰化作用分析使用NAT2-selective衬底磺胺甲嘧啶酶进行分析如前所述[ 19]。简单,反应包含从父母和NAT1 KO细胞溶解产物线细胞系,300 μM磺胺甲嘧啶,1毫米AcCoA孵化在37°C的120分钟。反应被终止的1/10体积的1 M醋酸。反应管离心去除沉淀蛋白。磺胺甲嘧啶和 N-acetyl-sulfamethazine被反相高效液相色谱分离和量化。三个独立的测量( n= 3)一式三份完成后执行每个细胞株。这个试验的条件下,检测极限是0.005 nmol /分钟/毫克的蛋白质。

测量NAT1-catalyzed N乙酰化作用 原位是由强化媒体用已知浓度的PABA如前所述[ 20.]。简单地说,这些细胞被孵化的37°C与媒体包含500 48小时 μM PABA。 N-acetyl-PABA由高效液相色谱分离和测定的数量(如前所述)( 16]。单独决定的数量对mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1是3、4和4分别。

细胞(1.5×10⁵)被镀成96 -黑/明确的底板块(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和隔夜37°C和5%孵化有限公司₂。一旦附加到板,细胞用PBS然后用3.7%甲醛固定在板在室温下在PBS为20分钟。修复后,细胞permeabilized使用0.1% Triton-X100 PBS和恒定搅拌5分钟,这个过程重复了4次。细胞被封锁在PBS奥德赛®阻断缓冲区(美国东北LI-COR生物科学,林肯)与恒定搅拌1.5小时。与兔anti-NAT1阻塞后,细胞被孵化(ab109114 (1:200) Abcam,剑桥,英国)或兔子NAT2 (ab194114 (1:10 0) Abcam) β肌动蛋白(A2228 (1:200), Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)一夜之间在4°C不断搅拌。由于高人类NAT1和NAT2之间的相似性,我们评估主要抗体的特异性人类NAT1和NAT2。特异性ab109114人类NAT1大于NAT2是4倍,和特异性ab194114人类NAT2是7倍大于NAT1准备(手稿)。主要抗体孵育后,盘子洗了5次,0.1%在PBS渐变20 5分钟。二次检测进行了使用IRDye®800 cw山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(1:1200)或IRDye®680山羊anti-Mouse免疫球蛋白(1:1200),(美国东北LI-COR生物科学,林肯)孵化为60分钟。最后,细胞用0.1%渐变20在PBS。NAT1、NAT2 β肌动蛋白同时可视化使用奥德赛红外成像扫描仪(LI-COR生物科学)使用680纳米和800纳米通道频道。相对荧光单位(RFUs)允许一个定量分析。相关蛋白表达计算除以RFU NAT1、NAT2 RFU的通道(800海里) β肌动蛋白通道(680海里)。蛋白表达在NAT1 KO细胞分裂的蛋白质表达父母的细胞系来确定褶皱的变化。生成的数据从4独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母及其NAT1 KO细胞系。

内源性AcCoA内mda - mb - 231水平,MCF-7, zr - 75 - 1父母和用高效液相色谱检测NAT1 KO细胞系如前所述[ 16与一些细微的修改。mda - mb - 231、MCF-7和zr - 75 - 1细胞系镀是一式三份的密度1×10⁶细胞板每10厘米,允许成长。镀后七十二小时,细胞被洗一次1 x PBS和分离从板1.0毫升胰蛋白酶。细胞从3,10厘米板结合,resuspended完全媒体和统计。后续步骤中所有细胞和溶菌产物保存在冰。收集细胞被洗一次冰冷的PBS和转移到1.5毫升微型离心机管。离心收集的悬浮细胞和上层的丢弃。删除任何剩余PBS,这些细胞被完全resuspended 50 μL冰冷的1 x PBS,然后立即通过添加50个细胞溶解 μL冷10% 5-sulfosalicylic酸与涡流15秒。细胞溶解细胞孵化冰上前10分钟在13000×g离心10分钟。上层清液注入在C18反相高效液相色谱柱(250 mm×4毫米;5 μ孔隙大小)(默克公司,达姆施塔特,蒙古包)。高效液相色谱法分离和定量的AcCoA实现如前所述[ 16]。生成的数据从8、12和3个独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系,分别。

倍增时间为每个父母和NAT1 KO细胞系是由镀每个细胞株融合水平的细胞系充足的发展空间会给至少7天或168小时。相同数量的细胞被镀对父母和为每个细胞株NAT1 KO细胞系。细胞被镀在6-well盘子一式三份,并允许增长为7天(168小时)。细胞计数和倍增时间计算使用在线计算器( http://www.doubling-time.com/compute.php)。单独的数量倍增时间决定对mda - mb - 231, MCF-7,和zr - 75 - 1细胞是3,3和4分别。

安克雷奇, 依赖增长进行了化验如前所述[ 16]。短暂,细胞(300 /)在6-well盘子镀一式三份,并允许增长了2周。可见殖民地与结晶紫染色后手动计算。生成的数据从6 3和3独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系,分别。安克雷奇- 独立的增长进行了化验如前所述[ 16]。短暂,anchorage-independent增长化验是由镀细胞(6000细胞/)在1.5毫升的低熔点的温度琼脂糖(0.3%)在完成媒体1.5毫升的基础层高贵琼脂完全媒体(0.5%)。总体积是3毫升每个6-well板。细胞被镀一式三份,增长了2周。殖民地(包含> 4单个细胞)与结晶紫染色后手动计算。生成的数据从3独立测量mda - mb - 231, MCF-7, zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系。

差异mda - mb - 231和MCF-7父母和NAT1 KO细胞株进行分析的意义方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。差异zr - 75 - 1父母和NAT1 KO细胞系进行了分析,供学生的意义 t以及。所有统计分析使用GraphPad棱镜v6.0c(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。的值 p < 0.05 被认为是具有统计学意义。

NAT1基因测序的mda - mb - 231 gRNA # 2(三分之一的克隆)KO细胞系显示删除单个胞嘧啶在96基地(bp)的翻译起始密码子(表 1)。这单核苷酸缺失导致移码突变导致氨基酸49后过早终止密码子290(表 2)。mda - mb - 231 gRNA # 5(克隆5-50)KO细胞系有两个核苷酸删除在43和44 bp从翻译起始密码子表 1)。这个删除导致过早终止密码子氨基酸密码子290年14后,立即终止NAT1翻译(表 2)。

的NAT1基因测序MCF-7 gRNA # 2(克隆2 - 4)KO细胞系表现出34 bp删除开放阅读框,跨度从95年到129年英国石油公司(表 1)。这个删除段DNA导致移码突变导致过早停止密码后38氨基酸(表 2)。的MCF-7 gRNA # 5(克隆5 - 20)KO细胞系有两个不同的删除(表 1)。第一个删除是单核苷酸删除42岁英国石油(bp),另一是43至48 bp的删除与插入额外的腺苷在同一地区。删除和插入这些导致过早停止密码后氨基酸密码子序列(表23 2)。

NAT1基因测序的zr - 75 - 1 gRNA # 2(2 - 10)克隆KO细胞系显示一个腺苷插入在开放阅读框(表95个基点 1)。这插入导致移码突变造成37氨基酸(表后过早终止密码子 2)。

的 体外N乙酰化作用的PABA父母细胞系为14.4±2.8,39.0±5.9,和121±19 nmol /分钟/ mda - mb - 231毫克,MCF-7,分别和zr - 75 - 1细胞系(图 1(一))。gRNA # 2和# 5克隆细胞系的活动水平降低到低于检测极限(0.05 nmol /分钟/毫克;图 1(一))。的 N乙酰化作用的PABA 原位为遵循相同的模式 在体外活动。 N乙酰化作用的活性PABA亲本细胞株为1.13±0.01,2.20±0.35,6.56±0.87 nmol /人力资源/百万对mda - mb - 231细胞,MCF-7,分别和zr - 75 - 1细胞系(图 1 (b))。gRNA # 2和# 5的克隆,PABA N乙酰化作用 原位被减少到低于检测极限(0.20 nmol /人力资源/百万细胞图吗 1 (b))。

相对NAT1和NAT2蛋白表达是评估在西方染色- sensing协议中描述的材料和方法。NAT1蛋白表达明显(方差分析, p < 0.0001 )降低mda - mb - 231 gRNA # 2和gRNA # 5的MCF-7 gRNA # 2和gRNA # 5,和zr - 75 - 1 gRNA # 2 NAT1 KO细胞相比,各自父母的细胞(图 2(一个))。相对NAT2蛋白表达在mda - mb - 231 gRNA # 2和gRNA # 5 MCF-7 gRNA # 2和gRNA # 5 NAT1 KO细胞显著增加(方差分析, p < 0.0001 )相比,各自父母的细胞系而无显著变化( p > 0.05 )NAT2在zr - 75 - 1蛋白表达观察gRNA # 2 NAT1 KO细胞相比,父母(图 2 (b))。NAT2增加蛋白质的检测后,磺胺甲嘧啶NAT2酶化验在材料和方法进行了描述,但NAT2活动低于检测极限(0.005 nmol /分钟/毫克蛋白)在所有的细胞系进行测试。

内源性的细胞内mda - mb - 231父母AcCoA线是17.8±1.1 pmoles /百万细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆为33.1±1.8,35.5±2.6 pmoles /百万细胞,分别,这两个相比明显升高父母细胞系mda - mb - 231 ( n= 8;方差分析, p < 0.0001 )(图 3)。

MCF-7父母细胞系有内生AcCoA 18.7±0.9 pmoles /百万水平细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆分别为27.6±2.6,27.0±2.7 pmoles /百万细胞,分别,这两个明显升高MCF-7相比,他们父母的细胞系( n= 12;方差分析, p < 0.05 )(图 3)。

zr - 75 - 1父母的细胞系有内生AcCoA 43.2±3.6 pmoles /百万水平细胞,而细胞内的内生AcCoA水平gRNA # 2 NAT1 KO为33.6±8.4 pmoles /百万细胞( n= 3;学生的 t以及, p > 0.05 )(图 3)。

翻倍的mda - mb - 231父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系分别为24.8±0.3,30.3±0.4,30.9±0.3人力资源,分别为( n= 3)。同时mda - mb - 231 NAT1 KO细胞系有显著(方差分析, p < 0.0001 )增加一倍时间比父母的mda - mb - 231细胞系(图 4(一))。

的翻倍MCF-7父母的细胞系和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞株分别为41.4±0.4,45.3±6.2,38.8±8.5人力资源,分别为( n= 3),没有显著差异(方差分析, p > 0.05 )相比,父母MCF-7细胞系(图 4(一))。

翻倍的zr - 75 - 1父母的细胞系和gRNA # 2 NAT1 KO细胞系分别为37.0±2.8,63.1±2.9人力资源,分别为( n= 4)。zr - 75 - 1的倍增时间gRNA # 2 NAT1 KO细胞系明显(学生的 t以及, p = 0.0006 )父母相比升高zr - 75 - 1细胞系(图 4(一))。

安克雷奇, 依赖集落形成试验允许癌细胞能力的确定形式殖民地当附加到表面。安克雷奇——的结果 依赖集落形成试验显示殖民地形成的数量对mda - mb - 231父母的殖民地,gRNA # 2,和gRNA # 5 NAT1 KO细胞系为40.7±2.5,51.3±1.6,54.8±6.8殖民地,分别。安克雷奇, 依赖殖民地的mda - mb - 231和NAT1 KO细胞系互相没有统计学差异(方差分析, p > 0.05 ; n=(图6) 4 (b))。

MCF-7父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系安克雷奇- 依赖集落形成为68.2±8.6,86.2±9.9,96.7±9.1殖民地,分别互相没有统计学差异(方差分析, p > 0.05 ; n=(图3) 4 (b))。

zr - 75 - 1父母和gRNA # 2 NAT1 KO细胞安克雷奇- 依赖集落形成是102±5和39.4±6.5殖民地,互相不同统计(学生的 t以及, p < 0.001 ; n=(图3) 4 (b))。

安克雷奇, 独立的“软琼脂集落形成试验(也称为分析”)允许形成菌落测定癌细胞能力缺乏细胞表面的附件。父母mda - mb - 231细胞系安克雷奇——形成的 独立的殖民地的水平明显高于NAT1 KO克隆(图 4 (c))。殖民地的数量由mda - mb - 231父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系1070±76,48.3±17.2,23.4±7.0殖民地,分别(方差分析, p < 0.0001 ; n= 3)。殖民地的数量由两个NAT1 KO细胞系并没有统计上的不同( p > 0.05 )。

MCF-7父母细胞系形成安克雷奇- 独立的殖民地在更高的级别上比MCF-7 NAT1 KO克隆(图 4 (c))。殖民地的数量由MCF-7父母和gRNA # 2和# 5 NAT1 KO细胞系195±9,33.7±6.8,13.8±6.6,分别。安克雷奇, 独立的形成的殖民地MCF-7父母细胞系均明显高于gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆(方差分析 p < 0.0001 ; n= 4)。的MCF-7 gRNA # 2和# 5 NAT1 KO克隆没有统计( p > 0.05 )不同。

父母zr - 75 - 1细胞系形成安克雷奇- 独立的殖民地在更高的级别上比NAT1 KO细胞系克隆(图 4 (c))。殖民地的数量由zr - 75 - 1父母和gRNA # 2 NAT1 KO细胞系为45.6±13.4,6.00±1.84,分别。安克雷奇, 独立的殖民地形成的zr - 75 - 1亲本细胞系均明显高于gRNA # 2 NAT1 KO克隆(学生的 t以及, p < 0.05 ; n= 3)。