吗啡对Pericyte-Endothelial交互的影响:影响抗血管新生疗法

文摘

吗啡刺激小鼠的肿瘤血管生成和癌症进展。我们检查如果吗啡endothelial-pericyte互动通过影响血小板源生长factor-BB (PDGF-BB)和PDGF受体-(PDGFR -)。临床相关的剂量的吗啡刺激PDGF-BB从人类脐静脉内皮细胞分泌,激活PDGFR -和增殖蛋白激酶/细胞外signal-regulated激酶(MAPK / ERK)磷酸化在人类周围的周。这些在体外吗啡被译成促进肿瘤血管生成的影响在乳腺癌的转基因小鼠模型处理临床使用剂量的吗啡。增加vessel-associated肌间线蛋白和PDGFR——的免疫反应性被观察到的周morphine-treated老鼠的肿瘤。这些数据表明,吗啡通过PDGF-BB / PDGFR -强化endothelial-pericyte交互信号和促进肿瘤血管生成、周皮细胞招聘和肿瘤血管的报道。我们推测,吗啡可能损害抗血管新生疗法的有效性通过影响血管外膜细胞覆盖。

1。介绍

新血管的血管生成,发芽现有的船舶,是肿瘤进展和转移的关键1]。血管内皮细胞,构建块,内皮特异性细胞因子和血管内皮生长因子(VEGF)及其受体因此抗癌疗法的目标(2- - - - - -4]。几个VEGF和内皮细胞特定的疗法在临床使用或临床试验。然而,耐药性和无能是一个重大的挑战限制这些有前途的新药的成功。最近的研究表明,血管内皮结构,不仅仅是一个而是与壁画密切相关的细胞包括周和血管平滑肌细胞(VSMCs) [5- - - - - -7]。周皮细胞的确切作用的报道肿瘤脉管系统还不清楚,但提出矛盾的角色,一方面有利于抑制血管生成和抗血管新生疗法的障碍(4,8,9]。

周皮细胞血管内皮的报道是由一些细胞因子包括血小板源生长因子(pdgf)和VEGF (10,11]。PDGF-BB分泌内皮细胞作为引诱剂招募PDGFR -β表达对周和周皮细胞祖细胞内皮(12]。反过来,对指导内皮豆芽,脚手架的血管生长,稳定血管壁(5,13,14]。因此,内生和外生影响pericyte-endothelial分子相互作用可能影响肿瘤血管生成和干扰治疗指向他们。例如,吗啡刺激PDGF-BB的表达在人类大脑微血管内皮细胞(HBMECs) [15)和coactivates PDGFR -β信号在小鼠视网膜微血管内皮细胞(mREC)和肾脏系膜细胞(专业壁画细胞)(16,17]。

吗啡用于临床相关剂量促进血管生成在体外和在活的有机体内并增加血管通透性(18- - - - - -20.]。这种吗啡proangiogenic活动转化为促进乳腺癌和肺癌小鼠(18,19,21]。此外,吗啡促进乳腺癌和肺癌细胞增殖和迁移。阿片受体(ORs)特别是μ阿片受体(铁道部)调解吗啡的镇痛效果和在人类肺癌中表达的高度21- - - - - -23]。吗啡及其副产品用于治疗疼痛是由于癌症,尤其是晚期恶性肿瘤的大部分的治疗是无效的。很可能影响吗啡endothelial-pericyte交互和靶向治疗可能会进一步导致无效。

因此,我们研究了吗啡内皮和pericyte-specific活动由PDGF-BB / PDGFR -β信号。我们主要使用人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人类placenta-derived周在体外乳腺癌的研究和转基因小鼠模型,模拟人类疾病的进化谱系。我们发现,吗啡刺激PDGF-BB分泌HUVEC和PDGFR——的磷酸化β、增殖蛋白激酶/细胞外signal-regulated激酶(MAPK / ERK)和信号传感器和转录激活3 (STAT3)在周。补充这些在体外观察,在临床使用剂量吗啡肌间线蛋白和PDGFR增加β阳性细胞在小鼠的肿瘤血管,暗示增加增殖和/或招聘vessel-associated周。

2。材料和方法

2.1。肿瘤模型和药物治疗

雌性转基因老鼠携带一只老鼠C3(1)猴病毒40大肿瘤抗原(C3TAG)融合基因开发高度侵袭性乳腺癌肿瘤。女性C3TAG老鼠显示人类的进化谱系浸润性导管癌(24]。这些老鼠在8周开发导管上皮异型性,发展为上皮内瘤在12周(类似人类导管原位癌),浸润性癌和严重明显的肿瘤在16周。肿瘤肺转移远隔部位为主,以及肝脏、肾上腺和心脏。6个月大的时候,所有的老鼠死于普遍发展的多焦点的乳腺腺癌。在以前的研究中我们使用该模型针对肿瘤血管生成使用血内皮细胞表达产物sFlt1 [25]。三个月大C3TAG小鼠皮下注射硫酸吗啡(巴克斯特Esilerderle医疗、樱桃山、新泽西)在0.5毫克/公斤/天为2星期,每两周剂量升级0.75毫克/公斤/天,1.0毫克/公斤/天,1.25毫克/公斤/天,1.5毫克/公斤/天,或用PBS,一段七周。所有试剂都从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,除非指定。

2.2。HUVEC文化

人类脐带血管内皮细胞从脐带分离(通过传代形成细胞和培养如前所述26]。完成HUVEC培养基(CHCM)由媒介199(马里兰州盖瑟斯堡生活技术,Inc .,), 40岁μg / mL肝素钠盐、15%胎牛血清,2.4% 200毫米谷酰胺,100单位/毫升青霉素,链霉素100单位/毫升、100单位/毫升二性霉素b,新鲜解冻ENDO-GRO 0.04%, 0.1%丙酮酸钠。主要HUVECs通道1和3之间用于所有实验。HUVECs在和增长factor-free血清培养基培养(SFM)研究吗啡对PDGF-BB表达和信号的影响的研究。SFM由媒介MCDB 131(马里兰州盖瑟斯堡生活技术,Inc .,), dibutyryl营地,肝素,谷酰胺、笔/链锁状球菌/二性霉素b,和氢化可的松(描述18]。

2.3。周皮细胞文化

人类从周围的周胎盘从PromoCell购买(PromoCell、海德堡、德国)和外膜细胞培养基上培养/制造商的指示。周是血清和外膜细胞生长因子缺乏和增长factor-free血清培养基(PSFM)。PSFM介质由199(马里兰州盖瑟斯堡生活技术,Inc .,), 0.5%胎牛血清,青霉素100单位/毫升、100单位/毫升链霉素,100单位/毫升二性霉素b、谷酰胺和2毫米。

2.4。ELISA

HUVEC血清和生长因子缺乏在一夜之间SFM孵化与不同浓度的吗啡表示数据的一个额外的48小时。HUVEC的上层清液是分析PDGF-BB使用酶联免疫试剂盒(RayBiotech,共同协助,GA)。吸光度是使用ELISA阅读器读取在450海里(协同HT、Winooski VT)。PDGF-BB在上层清液的浓度计算使用标准曲线与每个实验准备。SFM培养没有HUVEC在平行实验中被用作空白/消极的控制。

2.5。免疫印迹分析

一夜之间,周被血清饥饿0.1描述和刺激μM吗啡或PDGF-BB 20 ng / mL。细胞溶解产物被我们准备描述早些时候使用蛋白酶抑制剂混合物(18]。蛋白质溶解产物包含100μg蛋白质分离3 - 15%的梯度sds - page凝胶,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(止动剂;微孔,贝德福德,MA)。发现了蛋白质乐队使用1:250 phospho-PDGFR -β(纽约北部,普莱西德湖),1:500 PDGFR -β1:1000 phospho-STAT3, 1: 1000 STAT3, 1: 1000 phospho-MAPK / ERK和1:1000 MAPK / ERK(所有从细胞信号技术,丹弗斯,MA)。碱性phosphate-conjugated二级抗体(1:5000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)和ECF系统(Amersham生物科学,白金汉郡,英国)是用于检测化学发光信号风暴860 Phosphorimager(分子动力学,桑尼维尔CA)。蛋白质乐队被光密度分析量化使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。

2.6。Immunofluorescent染色

肿瘤在液态氮冷冻,嵌入在最佳切削温度复合(10月),切成6μM cryosections。部分固定在4%多聚甲醛和应用使用以下主要抗体稀释表示:1:100只兔子anti-PDGFR -β(纽约北部,普莱西德湖);1:100鼠标antismooth肌肉肌动蛋白(αsma;σ,圣路易斯,密苏里州);1:50山羊antidesmin (Santa Cruz);1:50鼠anti-CD31-FITC(圣地亚哥BD Pharmingen CA)。种特异的二级抗体与Cy3共轭或TRITC用于以下稀释:1:400驴anti-rabbit IgG-Cy3(杰克逊实验室、西树林、PA)和1:50驴抗体IgG-TRITC (Santa Cruz)。此外,isotype-matched免疫球蛋白作为控制(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。荧光图像可视化,并获得使用一个奥林巴斯IX70 epifluorescent显微镜附带一个奥林巴斯DP70数码相机(奥林巴斯美国公司,中心山谷,PA)。

2.7。定量的免疫反应性的像素和肿瘤血管生成

周皮细胞标记、肌间线蛋白、αsma和PDGFR -β,检测内皮细胞CD31标志。叠加与Adobe Photoshop图像分析计算肌间线蛋白的比例,αsma和PDGFR -β相对于CD31-positive细胞。比率是根据蛋白质的荧光强度。的形态学分析肿瘤血管生成,CD31-positive图像的关键和场大病使用Adobe Photoshop和图像处理工具插件功能Adobe Photoshop(驯鹿游戏,阿什维尔,NC)和总长度,目的,和节点的船只被量化描述美国早些时候(18]。

2.8。统计分析

所有数据都表示为±SEM。所有统计分析使用棱镜软件(圣地亚哥GraphPad棱镜Inc . CA)。意义决定使用未配对,学生的测试。被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。吗啡刺激PDGF-BB HUVEC的分泌

吗啡诱发PDGF-BB表达HBMECs [15分泌),但是这需要有一个对周旁分泌作用。我们检查了如果PDGF-B被分泌到文化上层清液用吗啡HUVEC刺激48 h。吗啡的剂量的0.1和1μM刺激分泌增加约2倍的PDGF-BB培养基比PBS(图1)。然而,1毫米的吗啡浓度没有显著影响PDGF-BB分泌比PBS。相差显微镜和台盼蓝染色HUVEC的孵化与0.1和1μM吗啡显示,超过99%的细胞还活着,出现正常(数据未显示)。相比之下,超过99%的HUVECs孵化与1毫米吗啡后都死了。吗啡浓度在0.1和1μM是符合不同患者人群的观察血浆/血清浓度与吗啡治疗,2 nM之间范围和3.5毫米27,28]。我们实验室早期的研究表明,1毫米吗啡是细胞毒性对人类皮肤微血管内皮细胞(HDMECs) [18]。因此,临床相关的浓度吗啡刺激PDGF-BB从内皮细胞分泌,endothelial-pericyte交互的关键一步。

3.2。吗啡激活PDGFR -β、MAPK / ERK和Stat3信号周

扩散、招聘和内皮细胞的相互作用与周围的周内皮依赖PDGFR -β信号。我们观察到0.1μM吗啡以及20 ng / mL PDGF-BB刺激持续激活PDGFR -β磷酸化周从5分钟到60分钟的孵化(数字2(一)和2(b))。有趣的是,吗啡和PDGF-BB显著刺激时间的方式MAPK / ERK的磷酸化,60分钟后回到基线孵化。另一方面,吗啡和PDGF-BB STAT3磷酸化的刺激,但没有统计学意义。因此,吗啡和PDGF-BB刺激PDGFR -β在周和MAPK / ERK信号。

3.3。促进肿瘤的血管生成吗啡C3TAG老鼠

三个月大C3TAG老鼠轴承多个乳房肿瘤,自发地生长,治疗与临床相关的升级剂量的吗啡,七周。多个肿瘤在不同尺寸切割,但只有肿瘤约1厘米×0.5厘米为肿瘤血管生成(数据进行了分析3(一个)- - - - - -3 (d))。在肿瘤的形态学分析部分沾anti-CD31-FITC。分析不同参数的血管生成包括血管密度(a),总长度的船只(b),船舶数量(结束,(c)),和分支(节点,(d))。显著增加在这些参数morphine-treated老鼠相比接受pbs老鼠。过度的分支(节点)和船舶数量的增加是一个典型的特征紊乱血管在肿瘤的增长。吗啡,因此,进一步增强肿瘤血管生成。

3.4。吗啡治疗结果增加肌间线蛋白免疫反应性但不影响αsma在肿瘤免疫反应性

从C3TAG小鼠肿瘤治疗吗啡如上所述与anti-CD31-FITC costained(绿血管)和肌间线蛋白(红色)或anti-CD31-FITC(绿色)αsma(红色)。Immunofluorescent图像显示显著增加肌间线蛋白免疫反应性在吗啡治疗相比接受pbs老鼠肿瘤(图4(一)上面一行)。大部分的肌间线蛋白染色与随机的方式CD31-postive内皮和显示显著增加吗啡治疗比PBS(图4 (b))。在一些地区,肌间线蛋白染色是独立于CD31染色(a)(红色箭头)。一些强烈desmin-positive(红色)细胞也出现在血管芽和提示(黄色箭头,扩大区域分别显示在图4 (c))表明支持新血管的形成和指导。相比之下,αsma免疫反应性较低的吗啡和接受pbs肿瘤两治疗组之间无显著差异(数字4(一)和4 (b))。值得注意的是,所有a-SMA免疫反应性与血管内皮。

3.5。增加血管PDGFR——的表达式β免疫反应性与吗啡治疗组小鼠的肿瘤

肿瘤的治疗吗啡小鼠表现出强烈的PDGFR costaining -β与内皮,橙色的覆盖红色和绿色的图片PDGFR -β和CD31(图5(一个))。定量也vessel-associated PDGFR -β免疫反应性明显高于在吗啡相比接受pbs老鼠肿瘤(图5 (b))。大多数PDGFR -β免疫反应性与一致的血管和周围血管在吗啡治疗小鼠(红色箭头)。相比之下,在接受pbs老鼠,大多数PDGFR -β免疫反应性与nonvascular细胞,可能与肿瘤细胞。值得注意的是,特定的colocalization PDGFR -β被认为在血管芽(橙色箭头)和血管分支点,在PBS组。因此,看来在这些小鼠的肿瘤,PDGFR -β与血管分支和豆芽,而吗啡治疗增加endothelium-associated周皮细胞密度和血管外膜细胞覆盖。

4所示。讨论

临床使用剂量的吗啡/阿片类药物作用于内皮细胞和肿瘤细胞从而导致肿瘤恶化在体外和在活的有机体内实验研究[18,21,22,29日- - - - - -31日]。铁道部的表达明显高于人类肺癌组织与良性的组织在同一器官补充吗啡的这个活动21- - - - - -23]。因此,本研究进行检查,如果周直接或间接受到临床相关的剂量的吗啡。我们发现吗啡刺激PDGF-BB由内皮细胞分泌,endothelial-pericyte相声的关键中介,从而间接影响周皮细胞活动。吗啡也激活PDGFR -β对人类就对信号和MAPK / ERK的磷酸化。这些活动吗啡对内皮细胞和周与增加血管生成,血管associated-desmin -PDDGFR -β表达对周在转基因小鼠乳腺癌。我们观察吗啡vascular-pericyte交互可能影响抗血管新生疗法的有效性。

PDGF-BB中起核心作用的招聘和增长的周和endothelial-pericyte交互以旁分泌的方式(5,13]。在这个关系中,内皮细胞分泌PDGF-BB,行为上的周内皮祖细胞和新兵。增加分泌的PDGF-BB HUVEC刺激时0.1和1μM吗啡表明吗啡在HUVEC-pericyte互动起着有益的作用。然而,1毫米吗啡没有影响PDGF-BB HUVEC的分泌。但值得一提的是,在患者的吗啡剂量不同条件包括癌症、吗啡浓度介于2 nM和3.5之间μM血浆/血清[27,28),0.1和1的范围μM浓度显示刺激PDGF-BB HUVEC的分泌。1毫米的吗啡浓度极不可能出现在患者的血浆,因为一个非常高剂量的吗啡需要实现这一血浆浓度,进而可能有严重的副作用,因此临床上不习惯。我们演示了早些时候,1毫米吗啡是细胞毒性HDMEC (18),在目前的研究中,我们发现HUVECs孵化与1毫米吗啡48 h没有活着。我们观察PDGF-BB分泌的HUVEC在这项研究进一步支持增加表达PDGF-BB HBMEC 10⁻⁷吗啡,但不是由10⁻⁵M吗啡(15]。在一起,这些数据表明,临床相关的剂量的吗啡PDGF-BB生产由内皮细胞有刺激作用,可在以自分泌和旁分泌的方式通过PDGFR -β促进血管生成和周皮细胞增长和招聘。

PDGF-BB激活PDGFR——而闻名β和一些下游信号通路,促进细胞增殖、生存、分化,包括MAPK / ERK和STAT3 (14,32,33]。我们发现,吗啡coactivates VEGFR2和PDGFR -β在小鼠视网膜微血管内皮细胞(mRECs)与铁道部免疫沉淀反应16]。我们先前的研究还显示吗啡MAPK / ERK Stat3和一种蛋白激酶磷酸化mREC和HDMEC16,18]。还在HBMECs,吗啡激活MAPK / ERK和PKB / Akt磷酸化(15]。最近,我们发现吗啡coactivates PDGFR -β在肾系膜细胞信号在体外和在活的有机体内(17]。铁道部沉默在肾系膜细胞导致显著减少吗啡的磷酸化PDGFR -βMAPK / ERK Stat3和PKB / Akt,暗示MOR-PDGFR -β相声。这是非常重要的考虑,铁道部兴奋剂药物包括吗啡用于治疗癌症疼痛和PDGFR -β信号参与周皮细胞增长和招聘。我们的观察吗啡激活此PDGFR -β和MAPK / ERK的磷酸化程度类似于周围的周PDGF-BB表明吗啡引起的,也可能会增加招聘周皮细胞内皮和增加肿瘤血管生成。

符合吗啡的分泌PDGF-BB PDGFR——的HUVEC和激活β和MAPK / ERK信号在周中,我们观察到肿瘤的血管生成增加C3TAG小鼠接受使用临床相关的剂量吗啡。吗啡肿瘤血管生成与吗啡血管生成在协议在体外和在活的有机体内和促进小鼠乳腺癌和肺癌18- - - - - -22]。吗啡血管生成充满了过度血管分支和显著更多的船只,典型的肿瘤血管生成。这些数据表明,吗啡促进血管生成在乳腺癌模型,概括了人类乳腺癌的进化谱系。在一起,促进血管生成和PDGF-BB / PDGFR -β诱导endothelial-pericyte交互由吗啡可能影响抗血管新生疗法。

肿瘤血管生成增加morphine-treated老鼠伴随着增加vessel-associated desmin-expressing周,但不是α-SMA-expressing周。人们相信αsma不表达与正常毛细血管,周围的周肌间线蛋白表达,而vSMCs小动脉和小静脉肌间线蛋白表达以及周围的周αsma (34,35]。另一方面,αsma建议的标记的周(36]。无论治疗,肿瘤部分显示出强烈的表达αsma在肿瘤血管。因此有可能αsma强烈表达了对某些类型的血管在肿瘤模型中,这似乎是类似于小动脉和小静脉,不影响吗啡。值得注意的是,强大的肌间线蛋白免疫反应性的肿瘤morphine-treated老鼠与内皮细胞芽和提示细胞在内皮细胞附近。这是一个迹象表明增加的外膜细胞分化和招聘吗啡诱导的内皮的附近。同样,细胞表达PDGFR -β越来越与吗啡组血管内皮附近密切,进一步证明增加招聘周皮细胞和血管覆盖。确实增加了PDGFR-b信号导致的外膜细胞覆盖率增加脉管系统(14]。有趣的是,在接受pbs老鼠,vessel-associated PDGFR -β表达对周几,稀疏位于血管分支点和血管芽。明显高PDGFR -β表达式nonendothelial细胞上观察,也许在肿瘤细胞,在接受pbs老鼠。增加微脉管密度和厚PDGFR -β表达周皮细胞覆盖率与人类KM12SM高转移性结肠癌有关盲肠的裸体小鼠相比低转移性肿瘤KM12C细胞肿瘤(37]。因此,增加vessel-associated周皮细胞覆盖率morphine-treated老鼠的肿瘤研究补充增加转移我们观察到皮下SCK乳腺肿瘤/ J老鼠(19]。吗啡可能影响肿瘤血管生成、发展、和转移通过刺激endothelial-pericyte互动和增加血管的外膜细胞招聘和覆盖率,从而增加抗抗血管新生疗法通过限制药物的可访问性内皮一方面,促进血管生成。

在使用抗血管生成疗法,阿片类药物的贡献(如果coadministered)治疗结果需要考虑。到目前为止,没有临床数据吗啡对癌症进展和转移的影响。然而,或拮抗剂纳曲酮抑制卵巢癌进展在老鼠38)和改善卵巢癌顺铂治疗的结果(39]。抑制先进nonmetastatic和转移性胰腺癌也在患者接受低剂量服用抗氧化剂治疗α-酸(40]。吗啡PDGF-BB表达HBMEC抑制了环丙甲羟二羟吗啡酮(15),暗示或者上瘾的机制。此外,周边地只代理铁道部拮抗剂,methylnaltrexone,抑制opioid-induced血管生成(20.]。因此,共同服用外围地表演的不妥协的铁道部拮抗剂吗啡镇痛可以提高抗血管生成治疗的结果。

总之,我们表明,吗啡刺激PDGF-BB由内皮细胞分泌,激活PDGFR -β周和MAPK / ERK信号,从而调节endothelial-pericyte交互。这种细胞活动的吗啡与血管生成增加充斥着周皮细胞招聘和肿瘤脉管系统的报道。因此,吗啡治疗可能影响抗血管生成药物的有效性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

陆k和s船夫,执行实验,定量分析,数据的准备和写论文。k·n·约翰逊表现西方分析;o·a·杜德克和n Ristau进行免疫染色;d .稳索辅助定量和统计分析;j .阮辅助细胞培养;k·古普塔设计并监督整个研究和编辑。陆k和s船夫同样导致了这项工作。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院的资助。CA109582, HL068802, HL103733 k·古普塔和NHLBI补充促进多样性陆k。作者感谢露西尔·文森特博士,有见地的建议和t .阮女士卡罗尔Taubert论文准备的援助。

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