香烟烟雾诱发肺细胞扩散的分子机制和预防维生素C

文摘

肺癌是癌症匮乏的主要原因。吸烟是最强的患肺癌的危险因素,这是由扩散。在这里,我们表明,低浓度的水提物的香烟(aec)导致人类肺上皮细胞的过度增殖(A549)没有任何凋亡细胞死亡。负责AECS-induced扩散致病因素已被确定为p-benzoquinone (p-BQ)。Coimmunoprecipitation和免疫印迹实验表明p-BQ结合表皮生长因子受体(EGFR)。然而,在EGF相比,它会导致异常的EGFR磷酸化缺乏c-Cbl-mediated泛素化和退化导致持久的表皮生长因子受体的激活。这是紧随其后的是激活了极品+喀斯特和下游生存和增殖信号分子Akt ERK1/2,以及核转录因子原癌基因和c-Fos。维生素C和/或抗体p-BQ防止原子能委员会/ p-BQ-induced肺细胞扩散显然是被灭活p-BQ从而防止表皮生长因子受体的激活和下游信号分子。研究结果表明,维生素C和/或抗体p-BQ可能会提供一个新颖的干预对预防起始吸烟者的肺癌。

1。介绍

肺癌是癌症死亡的主要原因,在美国和世界各地1]。吸烟是最强的患肺癌的危险因素。吸烟和接触环境烟草烟雾占90%的肺癌病例,和吸烟者死于肺癌的风险增加了20倍比不吸烟者(2]。然而,吸烟的致癌机制不清楚3]。癌症细胞的最重要的特性是他们接受过度增殖。肺癌后出现的一系列进步的病理变化(肿瘤出现前的病变),是由扩散(增生)4]。在几乎所有情况下,不受监管的细胞增殖和抑制细胞凋亡构成的最小通用平台所有肿瘤发生进展(5]。有人提议增加增殖活动是导致致癌作用和肿瘤进展(6]。实验和理论支持的假设增加扩散本身就是一种致癌因素主要源于研究化学致癌物在啮齿动物肿瘤模型和数学建模的肿瘤进展(7]。临床观察也建议一个可能的贡献作用的细胞增殖增加到《创世纪》和/或人类癌症的进展7]。因为香烟(CS)会导致肺癌,预计CS应该促进细胞分裂。事实上,初步观察表明,细胞的增生发生在接触反应烟(8- - - - - -10]。然而,CS-induced细胞增殖的分子机制尚未清楚。尤其因为香烟(CS)是一个高度复杂的混合物包含大约4000种化合物,包括致癌物质、自由基和长寿的激进分子,如半醌(11,12]。这是一个猜想是否一个特定的化合物或化合物数量CS负责增殖的细胞。我们已经从CS和孤立的一个主要的半醌特征是p-benzosemiquinone (p-BSQ) [13,14]。p-BSQ存在于大量(100 - 200年μg /香烟)在所有商业香烟的烟雾从检查以及肯塔基州研究香烟15]。p-BSQ导致细胞毒性和组织损伤,通过转换p-benzoquinone (p-BQ),过渡发生歧化和氧化的含金属蛋白(14,16]。在这里,我们表明,CS-induced扩散完全预防肺细胞的抗体p-BQ p-BQ在大量来自CS模仿CS-induced肺细胞增殖。超表达和/或过度活跃的表皮生长因子受体(EGFR),伴随着一些下游细胞质信号传感器,包括Ras-MAPK级联以及细胞因子Akt幸存者(蛋白激酶B)已被证明的扩散和发展中起到关键作用的肺肿瘤(4]。Lemjabbar等人发现CS-induced细胞增殖是伴随着磷酸化(激活)的表皮生长因子受体(EGFR) [9]。Abdelmohsen等人表明p-BQ诱导激活细胞外signal-regulated激酶ERK1/2通过激活表皮生长因子受体(17]。在这里,我们表明,p-BQ显然源自p-BSQ水提物的CS (aec),负责AECS-induced通过激活表皮生长因子受体细胞增殖,Ras, ERK1/2, Akt以及转录因子原癌基因和c-Fos。p-BQ强烈灭活维生素C,早些时候我们曾报道,CS-induced细胞毒性和肺损伤预防维生素C (18- - - - - -22]。在这里,我们表明,这两种抗体p-BQ和维生素C防止原子能委员会/ p-BQ-induced灭活p-BQ人类肺细胞增殖明显。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

p-Benzoquinone (p-BQ)从默克和采购新结晶之前使用。苯并[a]芘(BP)获得了丙烯酰胺。4 - (Methylnitrosamino) 1 - (3-pyridyl) 1-butanone (NNK)和N-nitrosonornicotine(某某)是来自多伦多的研究化学品公司。Tyrphostin AG1478从Sigma-Aldrich购买,美国。“原位细胞增殖装备,氟”是来自罗氏应用科学,德国。从BD生物科学的膜联蛋白V-FITC设备购买。蛋白质的工具估计从Bio-Rad购买,美国和蛋白质A-Sepharose CL-42珠子从通用电气医疗集团,美国。化学发光免疫印迹分析工具,能从细胞信号技术,美国。所有其他化学试剂均为分析纯。p-BQ的抗体,在兔与p-BQ-bovine免疫后血清共轭长大,是由Abexome生物科学,印度班加罗尔。

2.2。香烟

所有的实验都使用醋酸纤维素执行带过滤嘴的肯塔基州参考香烟(3 r4f)来自肯塔基大学的农业学院参考香烟计划,美国肯塔基州列克星敦市。

2.3。香烟烟雾水提物的制备(aec)解决方案

原子能委员会的制备方法是设计,模拟呼吸道粘膜液的方式暴露在CS在吸烟过程中由人类[18]。烟从一个香烟提取1毫升的50 mM磷酸钾缓冲,pH值7.4,0.22过滤μ米微孔过滤器和pH值调整到7.4。计算机科学的水提物(aec)解决方案从而获得立即使用。

2.4。测量p-Benzoquinone (p-BQ)

p-BQ像之前描述的那样是用高效液相色谱法(14]。使用的列是一个LichroCART 350 - 4, RP-18 (5μ米)(默克公司)。p-BQ检测在245 nm的保留时间4.75分钟使用一个移动溶剂甲醇:水(90:10 v / v)在0.5毫升/分钟的流量。检测是500 pg的极限。

2.5。细胞培养

人类肺癌细胞A549保持在火腿F12培养基(美国GIBCO-BRL)含10%胎牛血清(美国GIBCO-BRL)、青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,4毫米谷氨酰胺/毫升。L132(正常的人类肺上皮细胞),维罗(非洲绿猴肾细胞系)和HepG2细胞(人类肝细胞线)在杜尔贝科的修改维护鹰介质(美国GIBCO-BRL),含10%胎牛血清(美国GIBCO-BRL)、青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,4毫米谷氨酰胺/毫升。所有的细胞都来自国立细胞科学中心(国立浦那(印度)。细胞种植在37°C的腐殖化的孵化器保持95%的空气和5%的公司的氛围₂。

2.6。细胞毒性试验

NNN,原子能委员会的细胞毒性,p-BQ NNK,和英国石油公司评估了3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT),如前所述[15]。短暂治疗后,不同的化合物,与无血清培养基代替中含0.5毫克/毫升MTT和文化孕育了一个额外的3人力资源。肝癌和蓝色甲瓒从而形成在DMSO溶液溶解,并测量吸光度值在560 nm紫外可见分光光度计(日本岛津公司uv - 2540)。

2.7。流式细胞仪细胞周期分析

估计的百分比细胞在细胞周期的不同阶段,培养细胞(),与aec / p-BQ指定治疗后1小时,PBS溶液清洗和孵化在新鲜培养基为12小时。细胞周期分析是由propidium碘(π)根据制造商的协议和分析使用流式细胞仪Calibur-Cell追求软件。10000事件是收购和直方图的情节FL2-H被记录。

2.8。流式细胞术对细胞凋亡的评价

估计细胞发生凋亡的比例,培养细胞(),与原子能委员会指定的治疗后1小时,洗了PBS溶液(Hyclone,热科学)和孵化新鲜培养基为12小时。细胞凋亡被膜联蛋白V和评估propidium碘(PI)(正)根据制造商的协议和分析使用流式细胞仪Calibur-Cell追求软件(Becton Dickinson)如前所述15]。总共有10000个事件,和双参数点块FL2-H (设在;PI-fluorescence,线性范围)与FL1-H (设在;膜联蛋白V-FITC-fluorescence,线性范围)被记录。

2.9。溶菌产物制备、免疫沉淀反应和免疫印迹

溶菌产物制备及蛋白质免疫沉淀反应被保等进行描述。23]。治疗后,提取细胞溶解缓冲区包含50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5;150毫米氯化钠;10%甘油;1%诺乃清洁剂p 40;EDTA约1毫米;蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(σ);磷酸酶抑制剂鸡尾酒(σ)。溶菌产物是通过在20000 g离心10分钟在4°C,和总蛋白质含量估计。蛋白质(400μg)在上层清液免疫沉淀反应通过隔夜孵化4μg anti-EGFR抗体(细胞信号技术,美国)在4°C,其次是蛋白质A-Sepharose CL-42(通用电气医疗集团)沉淀3人力资源在4°C。免疫沉淀反应和HNTG洗3次缓冲区包含20毫米玫瑰,pH值7.5;150毫米氯化钠;特里同x - 100 0.1%;10%的甘油,通过sds - page来解决,转移到PVDF膜。膜被封锁在Tris-buffered生理盐水1小时,pH值7.5;包含0.5%的渐变20和5%的脱脂牛奶(Bio-Rad),孵化一夜之间在4°C主要抗体(1:1000),其次是1小时孵化在室温下与1:3000稀释HRP-conjugated二级抗体(细胞信号技术,美国)。乐队是由化学发光检测到免疫反应性的蛋白质。印迹抗体使用anti-EGFR, anti-p-BQ、anti-p53 anti-phospho-p53, anti-Caspase 3 anticleaved半胱天冬酶3 anti-Akt, anti-phospho-Akt,反- phosphotyrosine - 845反phosphotyrosine - 1045反phosphotyrosine - 1068反phosphotyrosine - 1086, anti-ERK1/2, anti-phospho-ERK1/2, anti-c-Fos, anti-c-Cbl, antiubiquitin (UbC3)(细胞信号技术,美国),antiphosphotyrosine PY20,反- phosphotyrosine - 1173反β肌动蛋白(美国圣克鲁斯生物技术),anti-HRAS +喀斯特,anti-c-Myc, anti-phospho-c-Myc(磷T58 + S62)(英国abcam)。

2.10。检测活性氧(ROS)的生产

在治疗之前,细胞被孵化与10 30分钟μM 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H₂DCFDA) (Sigma-Aldrich)。使用共焦激光扫描显微镜荧光图像捕获(LSM 510元,卡尔蔡司)。

2.11。细胞增殖实验

细胞增殖是评估使用“原位细胞增殖装备,氟”(罗氏应用科学,德国),根据制造商的协议。简单,治疗后细胞在无血清培养基培养包含10μM BrdU标记5人力资源解决方案在37°C。细胞用PBS和固定在4°C为30分钟在固定的解决方案中,包含50 mM甘氨酸(pH值2.0)70% (V / V)乙醇。细胞然后permeabilized 20分钟在室温下与变性解决方案,包含4 M盐酸,紧随其后的是后续PBS洗,直到pH值达到6.5以上。阻止非特异性结合,细胞培养10分钟在室温下孵化缓冲区,包含PBS、0.5% BSA, 0.1%渐变20。细胞培养与anti-BrdU-FLUOS抗体45分钟在一个潮湿37°C室。孵化后,细胞被洗PBS和流式细胞术分析了使用流式细胞仪Calibur-Cell追求软件(正)。10000事件是收购和直方图的情节FL1-H被记录。

2.12。统计分析

所有的值表示为平均数±标准差。统计学意义是用单向方差分析。的使用适当的值计算测试。不同之处在于值<。05年被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。人肺上皮细胞的增殖(A549)原子能委员会/ p-BQ

用MTT测定在这里,我们表明,而低浓度的水提物的香烟(aec)诱导人肺上皮细胞的增殖文化(A549),高浓度导致细胞死亡(图1(一))。最优原子能委员会集中导致最大细胞增殖是约2μL /毫升。并不局限于A549细胞增殖;它也发生在其他细胞系,如L132(正常的人类肺上皮细胞),维罗(非洲绿猴肾细胞系)和HepG2(人类肝细胞线)(图1 (b))。AECS-induced扩散是模仿的p-BQ (200 ng / mL)的培养基生产的2μL /毫升的原子能委员会(图1 (c))。p-BQ的数量由原子能委员会在孵化高效液相色谱法测定混合物。这样的观察与原子能委员会,高浓度的p-BQ引起细胞死亡(图1 (c))。一个原子能委员会(2治疗μL /毫升)或p-BQ (200 ng / mL)导致持续增殖24 - 72小时(图1 (d))。的proliferation by either AECS or p-BQ is completely prevented by antibody to p-BQ (Figure1 (e))。anti-p-BQ抗体的抑制作用对A549细胞的增殖也被证实了的BrdU使用流式细胞术分析(数据1 (f)和1 (g))。结果表明,p-BQ来自原子能委员会负责AECS-induced肺细胞的增殖。准备使用的原子能委员会从肯塔基州研究香烟(3 r4f)。类似的结果由原子能委员会准备从一个商业香烟(遗嘱的烟丝,印度;结果未显示),这表明观察没有特定于肯塔基州研究香烟。

p-BQ CS中不存在,而是由p-benzosemiquinone (p-BSQ),一个长寿的半醌在大量(100 - 200年μg /香烟)在香烟烟雾从肯塔基州的研究以及一些商业香烟检查(15]。p-BSQ存在只在CS的焦油阶段和提取原子能委员会(12,14]。p-BSQ转化为p-BQ通过歧化(2 p-BSQ→p-BQ +总部)(16),以及由过渡金属(铁氧化^{3 +}、铜^{2 +})含蛋白质(p-BSQ→p-BQ) [14]。原子能委员会的制备方法是设计,模拟呼吸道粘膜液的方式暴露在CS在吸烟过程中由人类[18]。香烟焦油不断被沉积在肺部的吸烟者,而这些肺不断沐浴在水溶液中可以溶解和运输的水溶性成分焦油(12]。p-BSQ出现在香烟焦油可以提取到水的解决方案,从而将解决方案洗澡一个吸烟者的肺12]。CS溶液中产生的肺,p-BSQ将转换为p-BQ和诱导细胞增殖。这是支持的观察,CS导致肺部细胞增殖的老鼠体内8]。

3.2。增殖细胞的细胞周期分析

任何的细胞内细胞增殖的速度取决于三个参数:(a)细胞分裂的速度,(b)的比例人口进行细胞分裂中的细胞,和(c)细胞的速度损失的人口由于终端分化或细胞死亡。未能适当地调节这些函数结果改变表型和癌症(19]。在这里,我们已经完成了细胞周期分析使用propidium-iodide (PI)染色流式细胞术紧随其后。图2(一个)显示了直方图的A549细胞要么参与(NT)或暴露于2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ 24小时。2的意思是荧光μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ-treated细胞明显高于()比参与细胞。然而,与40预处理μg / mL维生素C 15分钟完全降低了平均荧光(图2 (b))。除了相对细胞DNA含量、细胞分布在细胞周期的不同阶段也决定(图2 (c))。三个不同的阶段在原子能委员会认可/ p-BQ-induced增殖细胞群:G0-G1(地区“M1”图2(一个)DNA合成阶段(地区),或“平方米”图2(一个)G2-M阶段(地区),“M3”图2(一个))。同时,细胞的比例占据细胞周期的不同阶段(图计算2 (c))。图2 (c)显示,参与细胞(30.2%)相比,细胞处理2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ有更多的细胞(细胞总数的40.55%或47.45%人口,resp) s阶段,表明DNA合成速率明显更高。然而,与40预处理μg / mL维生素C治疗前15分钟2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ减少细胞s阶段的比例为30.15%和31.35%,分别为(数字2(一个),2 (b),2 (c)),表明预防DNA合成速率高。

3.3。维生素C可防止原子能委员会/ p-BQ-Induced增殖的细胞

我们曾表明CS产生毒性和只在边际维生素C-deficient豚鼠组织损伤,而不是维生素C-sufficient的(14,18,20.]。我们还表明,适度大剂量的维生素C可以防止CS-induced毒性,明显减少和灭活p-BQ (14)。这是由于维生素C (V)强烈降低p-BQ (V) p-BQ有毒对苯二酚更少,从而使其失去活性。在这里,我们表明,p-BQ来自原子能委员会引起肺细胞在无血清培养基(图扩散1),基本上是免费的维生素c . MTT试验也表明,40岁μg / mL维生素C可以防止原子能委员会/ p-BQ-induced A549细胞的增殖(图3(一个))。在这个浓度,维生素C对参与的发展没有任何影响(NT)细胞在缺乏原子能委员会/ p-BQ(数据没有显示)。维生素C的抑制作用已经被BrdU证实合并,流式细胞术分析(数据就证明了这一点3 (b)和3 (c))。

维生素C的作用在癌症的预防和治疗有着悠久的和有争议的历史。尽管有人类研究缺乏使用维生素C治疗已经存在的癌症,有大量的流行病学证据表明维生素C的好处在许多类型的癌症的预防,包括肺癌(24,25]。几乎90%的肺癌是由于吸烟2]。我们已经表明,CS消耗维生素C (18]。这将证实了其他研究人员的观察肺癌患者通常患有维生素缺乏C [25]。一些癌症的临床试验和维生素C展示了非凡的宽容和安全的高剂量的维生素C患者(26]。

如上所示,在低浓度相比,高浓度的原子能委员会/ p-BQ (50μ2.5 L /毫升原子能委员会或μg / mL p-BQ)导致细胞死亡(图1(一))。造成的死亡是氧化应激和细胞凋亡。氧化应激的活性氧的形成(图已经证明了这一点4由p53的磷酸化(图)和细胞凋亡5(一个))和激活(裂)的半胱天冬酶3(图5 (b))。细胞凋亡是由膜联蛋白V /π化验使用流式细胞仪(数字5 (c)和5 (d))。维生素C可防止细胞死亡显然通过防止氧化应激(图4)和细胞凋亡(图5)。没有观察到这种氧化应激或细胞凋亡与低浓度的原子能委员会(2μL)或p-BQ (200 ng)诱导增殖的细胞(数字4和5)。

3.4。亚硝胺的影响、NNN和BP在细胞增殖

吸烟是一个复杂的混合物含有致癌物的4000种化合物,包括多环芳烃(多环芳烃)和亚硝胺。在多环芳烃中,最广泛地研究了苯并[a]芘(BP)和亚硝胺,4 - (Methylnitrosamino) 1 - (3-pyridyl) 1-butanone (NNK)和N-nitrosonornicotine(某某)[11]。相比p-BSQ(100 - 200年μg /香烟)(15),这些致癌物质在从一个香烟烟雾的浓度非常低:英国石油公司,20 - 40 ng;80 - 770 ng亚硝胺;某某,1.1 - -2.9μg (11,27]。这些致癌物质产生肿瘤在啮齿动物只有在非常高剂量(11]。在这里,我们表明,在实验条件下,某某,NNK, BP不会导致任何A549细胞的增殖(数字6(一),6 (b),6 (c))。高浓度的致癌物质,而抑制细胞的生长。此外,他们中没有人对A549细胞的增殖有协同效应由原子能委员会或p-BQ(数据没有显示)。尽管英国石油(BP)、亚硝胺、NNN不诱导细胞增殖,但他们可能产生致癌对p-BQ-induced细胞增殖的影响。扩散(细胞分裂)触发有丝分裂重组,基因转换,不分离。DNA修复在有丝分裂期间的时间间隔很短。DNA也是暂时性的碱基配对或绑定到组蛋白,因此使它更敏感的机会与DNA加合物的形成由BP和变异,NNK,某某,最终导致致癌作用。

3.5。原子能委员会/ p-BQ-Induced细胞增殖发生通过表皮生长因子受体的激活所阻止的维生素C

表皮生长因子受体(EGFR)是由一个细胞外配体结合域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶受体酪氨酸激酶,RTK)域。受体的激活导致了细胞内的信号级联控制细胞的增殖和分化。这些受体配体,最重要的是表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α(TGF -α),胞质域绑定导致受体二聚作用和细胞内受体的自身磷酸化酪氨酸激酶(RTK)领域,导致下游的信号,包括激活拉,英国皇家空军,增殖蛋白激酶(MAPK) phosphatidyl-3激酶(PI3K / Akt)和ERK1/2。这些分子与细胞生长、增殖,能动性,和生存28]。先前的研究显示表皮生长因子受体被激活(磷酸化)剂量和时间的方式暴露在CS的解决方案(29日]。然而,c是一个高度复杂的混合物,香烟解决方案的组件(s)负责细胞增殖没有知道。使用人类的肺上皮细胞(A549),在这里,我们表明,p-BQ (200 ng / mL)来自原子能委员会(2μL /毫升)负责AECS-induced EGFR磷酸化。(图7(一))。表皮生长因子受体的激活(磷酸化)表皮生长因子是由共价相互作用,和磷酸化似乎高5分钟后(图7(一)如图所示),它衰变后15分钟由其他人(29日]。另一方面,p-BQ来自原子能委员会共价结合表皮生长因子受体的细胞外领域初步通过迈克尔加成赖氨酸残基(30.)和激活表皮生长因子受体结构上。在这种情况下,磷酸化的p-BQ开始治疗后大约15分钟,持续1小时,表明长期的表皮生长因子受体的激活。据报道,不断激活表皮生长因子受体导致细胞不受控制的执行由癌症倾向,包括肺癌(31日,32]。这将表明p-BQ可能的危险因素的起始CS-induced肺癌。鉴于超过80%的nonsmall肺细胞癌(nsclc)表达表皮生长因子受体(2),表皮生长因子受体已成为重要的治疗这些肿瘤的治疗目标。这导致了表皮生长因子受体抑制剂的开发抗癌治疗(33,34]。最常见的方法使用单克隆抗体竞争结合到细胞外域或小分子靶向细胞内RTK域。维生素C能灭活p-BQ,我们已经表明,维生素C预处理细胞之前,原子能委员会/ p-BQ暴露完全防止表皮生长因子受体激活(图7 (b))。这将表明,摄入的维生素C将防止肺癌细胞增殖和起始吸烟者致癌作用。维生素C并不妨碍EGF-induced磷酸化的表皮生长因子受体(数据没有显示)。为了确认原子能委员会/ p-BQ诱导表皮生长因子受体的激活,我们进行上述实验的500 nM AG1478 (Tyrphostin EGFR激酶抑制剂)。结果(图7 (c))表明,500 nm AG1478完全阻止激活100 ng / mL EGF、EGFR的2μL /毫升原子能委员会,或200 ng / mL p-BQ。在一个单独的coimmunoprecipitation实验中,我们表明,anti-p-BQ抗体阻止AECS-induced表皮生长因子受体激活(图7 (d))。这将表明抗体p-BQ也可以预防的候选人的起始细胞增殖在吸烟和肺癌。

3.6。原子能委员会/ p-BQ暴露导致表皮生长因子受体的异常磷酸化

表皮生长因子受体二聚作用刺激其内在细胞内酪氨酸蛋白激酶活性。因此,自身磷酸化的酪氨酸(Y)残留在表皮生长因子受体c端域的发生。这些包括Y845 Y1045, Y1068, Y1148, Y1173 [35]。这个自身磷酸化引发下游活化和信号通过其他下游信号蛋白启动几个信号转导级联,主要MAPK, Akt,和物通路,导致DNA合成和细胞增殖。这种蛋白质调节表型包括细胞增殖(36]。早期的研究表明CS暴露导致的异常磷酸化表皮生长因子受体(29日]。因为p-BQ模仿原子能委员会在表皮生长因子受体激活,我们想知道是否p-BQ也导致表皮生长因子受体的异常磷酸化。表皮生长因子受体的免疫印迹分析A549细胞暴露于100 ng / mL EGF 5分钟,2μL /毫升原子能委员会1小时,或者200 ng / mL p-BQ 1小时显示原子能委员会/ p-BQ暴露会导致类似的异常磷酸化模式截然不同于EGF曝光(图8)。与aec / p-BQ孵化后,过度磷酸化酪氨酸- 845,但是不磷酸化酪氨酸- 1045。与EGF曝光,强烈磷酸化酪氨酸- 1045,而酪氨酸- 845是一个小得多的程度上磷酸化。酪氨酸的磷酸化的模式——1068年,1086年和1173年似乎不管用EGF治疗几乎相似,原子能委员会和p-BQ。

3.7。表皮生长因子受体暴露于原子能委员会/ p-BQ无法绑定c-Cbl并不是Ubiquitinated

c-Cbl (120 kDa)是一个起着关键作用的E3泛素连接酶在表皮生长因子受体表达下调。表皮生长因子受体激活,c-Cbl associates磷酸化酪氨酸- 1045和ubiquitinates受体,标记为clathrin-mediated溶酶体机械内吞作用和识别,从而导致受体退化和终止信号(37- - - - - -40]。表皮生长因子受体暴露于100 ng / mL EGF,其同源配体,与c-Cbl和ubiquitinated(图相关联9(一个))。然而,表皮生长因子受体2μL /毫升原子能委员会1小时或1小时200 ng / mL p-BQ并不磷酸化酪氨酸- 1045,这使得它无法与c-Cbl并排除了ubiquitinated(图9(一个))。因此,在原子能委员会/ p-BQ曝光,c-Cbl失去与表皮生长因子受体结合的能力,从而缺乏泛素化和退化,导致长时间信号即使删除外部刺激原子能委员会/ p-BQ。

为了研究表皮生长因子受体的命运与aec / p-BQ其次是孵化后删除这些配体,我们继续孵化2小时细胞的无血清培养基。结果(图9 (b))表明EGFR磷酸化存在预处理后2小时和2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ紧随其后的配体。这表明从激活表皮生长因子受体信号延长显然由于不能原子能委员会/ p-BQ暴露后的表皮生长因子受体退化。另一方面,当这些细胞被使用100 ng / mL表皮生长因子EGF的5分钟之后,去除表皮生长因子受体磷酸化不延长15分钟以上29日]。在这里,我们表明,磷酸化的表皮生长因子受体2小时(图后EGF几乎是零9 (b))。

3.8。原子能委员会/ p-BQ接触激活了极品+喀斯特导致下游生存和增殖信号ERK 1/2和Akt

Ras蛋白/ GDP GTP-binding蛋白作为细胞内信号传感器。活动形式是GDP的束缚。它们包括表皮生长因子受体激活受体酪氨酸激酶。最深入研究的成员拉基因家族极品和喀斯特。这些基因编码免疫相关蛋白的分子质量21 kDa和同系物的啮齿动物肉瘤病毒基因改变的能力。虽然这些野生型细胞蛋白质在人体正常组织信号中发挥至关重要的作用,包括增殖、分化、衰老、突变或过表达基因是强有力的致癌基因,扮演了重要的角色在许多人类癌症包括肺癌。在这里,我们表明,暴露在2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ 1小时的超表达了极品+喀斯特蛋白质(图10第1行)。

除了hra和喀斯特的增殖和细胞存活的介质,细胞外signal-regulated激酶(ERK1/2),也称为增殖蛋白激酶(MAPK),和一种蛋白激酶(也称为蛋白激酶B),已知参与细胞转换当持续激活(41- - - - - -43]。众所周知,激活(磷酸化)ERK1/2通路参与恶性转变在体外和体内。也报道,激活ERK 1/2与nonsmall细胞性肺癌(NSCLC),其中80%是由吸烟引起的(44]。由双磷酸化ERK激活1/2 Thr202和Tyr204残留。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在多种细胞过程中扮演着重要角色,包括促销在几个细胞系的细胞生存。激活ERK 1/2和Akt在各种细胞主要由生长因子受体是介导要求EGFR磷酸化(45]。此外,缺乏表皮生长因子受体的营业额已被证明调解在非肿瘤的肿瘤促进大鼠肝上皮细胞(46]。图10(行2和4)表明,暴露在2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ 1人力资源导致下游ERK的磷酸化1/2和Akt信号,使他们活跃。然而,参与细胞不显示任何过度激活的极品+喀斯特,ERK 1/2,或一种蛋白激酶(图10,行3和5)。

3.9。原子能委员会/ p-BQ暴露c-Fos导致原癌基因的激活和超表达

原癌基因蛋白(49 kda)是一种转录因子,编码的原癌基因基因对人类染色体8抓起。原癌癌蛋白是最有效的转换代理在人类细胞。原癌癌蛋白水平升高可导致大多数人类肿瘤的发生和发展中47- - - - - -49]。原癌基因的表达增加诱导增殖,抑制分化。原癌基因通常在多种肿瘤细胞和激活可以激活或抑制特定的目标基因的表达与各种生物功能相关。通过这个转录监管活动,原癌基因有助于癌症生物学的不同方面,包括细胞周期进展,血管生成、转移、细胞粘附、细胞生长和基因组不稳定性。研究显示功能之间的联系原癌基因在Thr58 / Ser62 ERK的磷酸化1/2在细胞增殖和细胞周期调控50]。

c-Fos属于核致癌基因的安全系数的家庭。c-Fos蛋白的表达(62 kDa)正迅速和瞬变引起多种细胞外刺激,包括生长因子。除了表达增加,”丛书蛋白质的磷酸化ERK激酶在应对外部的刺激可能会进一步增加转录活动(51- - - - - -54]。管制c-Fos会导致肿瘤细胞的表达转换(51]。图11显示,暴露的A549细胞2μL /毫升原子能委员会或200 ng / mL p-BQ 1小时导致原癌基因蛋白的磷酸化Thr58 c-Fos / Ser62和超表达。然而,参与细胞表现出任何原癌基因磷酸化和c-Fos表达式。

4所示。结论

尽管主要肺癌的治疗和管理的进步,大部分肺癌患者最终死于这种疾病。因为传统疗法未能对生存产生重大影响,新方法是必要的在对抗肺癌55]。众所周知,吸烟是最强的患肺癌的危险因素。最终防止肺癌的最好方法就是停止吸烟,这已被证明难以实现,而且不太可能完成。这动机强烈兴趣的化学预防这种疾病(56]。香烟(CS)是一个复杂的混合物约4000种化合物(11,12CS),并确定风险因素对实现这一目标至关重要。我们已经识别出p-benzoquinone (p-BQ)作为一个风险因素,暂时由p-benzosemiquinone [13- - - - - -15)水提物的CS (aec)。肺癌被认为后出现的一系列进步的病理变化(肿瘤出现前的病变),是由扩散(4]。我们已经表明,低浓度的原子能委员会或同等数量的p-BQ来自原子能委员会引起人类肺上皮细胞的过度增殖(A549)通过介导的异常磷酸化的表皮生长因子受体导致持久的表皮生长因子受体的激活。长时间的表皮生长因子受体的激活是伴随着Ras激活,下游生存,和增殖信号分子Akt ERK1/2,以及转录因子原癌基因和c-Fos。考虑到超过80%的CS-induced nonsmall肺细胞癌(nsclc)表达表皮生长因子受体(2),抑制表皮生长因子受体已成为一个重要的治疗目标治疗这些肿瘤的28,57,58]。我们已经表明,anti-p-BQ抗体和维生素C防止原子能委员会/ p-BQ-induced激活表皮生长因子受体和肺细胞(图的扩散12)。维生素C可以防止原子能委员会/ p-BQ-induced增殖明显减少,从而灭活p-BQ。我们考虑到预防CS-induced肺细胞扩散的维生素C和/或anti-p-BQ抗体可能会提供一个新颖的干预对预防启动CS-induced肺癌。

确认

这项研究受到了Juthika研究基金会,加尔各答大学和CSIR批准号60 (0092)/ 10 / EMR-II;n·戴伊(博士学者)Juthika研究员现在CSIR高级研究员;i . b . Chatterjee是早期荣誉科学家。

引用

1. g . a . Giovino”在美国烟草使用流行病学”,致癌基因,21卷,不。48岁,7326 - 7340年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. l . v . Sequist“非小肺癌”哈里森肿瘤学的手册b . a Chabner写、t·j·林奇和d . l . Longo Eds。,pp. 455–467, McGraw Hill Medical, New York, NY, USA, 2008.视图:谷歌学术搜索
3. 艾姆斯b . n, l . s .黄金,w·c·威利•“的原因和预防癌症,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷92,不。12日,第5265 - 5258页,1995年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. h .白菜,h . i, r·罗塞尔和a . Traynor“肺癌”肿瘤学,a . e . Chang, p . a .甘兹·d·f·海耶斯et al .,。施普林格,页545 - 621年,纽约,纽约,美国,2006年。视图:谷歌学术搜索
5. g . i . Evan和k·h·Vousden增殖、细胞周期和细胞凋亡在癌症。”自然,卷411,不。6835年,第348 - 342页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 艾姆斯b . n和l . s .黄金,“化学致癌作用:太多的啮齿动物致癌物,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷87,不。19日,7772 - 7776年,1990页。视图:谷歌学术搜索
7. l . Pusztai和k·库珀”,细胞增殖和致癌作用细胞增殖在癌症肿瘤细胞生长的调节机制l . Pusztai·c·e·刘易斯和大肠狂吠,Eds。,pp. 1–24, Oxford University press, New York, NY, USA, 2001.视图:谷歌学术搜索
8. h . s . Sekhon j·l·赖特,a . Churg“吸烟导致小航空公司快速的细胞增殖和相关肺动脉,”美国生理学杂志》上,卷267,不。5,L557-L563, 1994页。视图:谷歌学术搜索
9. h . Lemjabbar d·李·m·盖洛普s Sidhu e·德和c . Basbaum烟草烟雾诱发肺癌细胞增殖的肿瘤坏死因子α转化酶和amphiregulin。”《生物化学》杂志上,卷278,不。28日,第26207 - 26202页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. f . Luppi j . Aarbiou s·维特灵et al .,“烟冷凝物对扩散的影响和伤口闭合支气管上皮细胞体外:谷胱甘肽的作用,“呼吸系统的研究》第六卷,货号。140年,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 美国赫克特,“烟草致癌物和肺癌。”美国国家癌症研究所杂志》上,卷91,不。14日,第1210 - 1194页,1999年。视图:谷歌学术搜索
12. w·a·普赖尔k .石头,l . y .藏和大肠贝穆德斯,“水香烟焦油中提取分离:包含焦油激进的分数引起DNA损伤,”化学毒物学研究,11卷,不。5,441 - 448年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 隔离i b . Chatterjee”过程的一个主要从香烟有害氧化剂,”美国专利第6929012号,2005年。视图:谷歌学术搜索
14. Banerjee, r .将a Ghosh et al .,“香烟烟雾诱发肺损伤的细胞和分子机制和预防的维生素C,”杂志的炎症卷,5篇文章。21日,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. n .戴伊a Das, a . Ghosh和i . b . Chatterjee“活性炭过滤器有效减少p-benzosemiquinone主流烟和防止肺气肿,”生物科学杂志》,35卷,不。2、217 - 230年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a . b . Sullivan和g·f·雷诺兹取代基影响的衰减速度p-benzosemiquinone阴离子自由基,”物理化学学报,卷80,不。24日,第2674 - 2671页,1976年。视图:谷歌学术搜索
17. k . Abdelmohsen p·a·戈贝尔c·冯·蒙特福特h . sy和l·o·克洛茨”,表皮生长因子受体是一种常见的中介quinone-induced信号导致connexin-43的磷酸化。谷胱甘肽和酪氨酸磷酸酶的作用。”《生物化学》杂志上,卷278,不。40岁,38360 - 38367年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. k .熊猫r .将m . k . Ghosh d . j .将挑战和i . b . Chatterjee“维生素C可以防止吸烟诱导的氧化损伤蛋白和蛋白水解作用增加,”自由基生物学和医学,27卷,不。9 - 10,1064 - 1079年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m . Andreeff d·w·古德里奇,a . b . Pardee“细胞增殖、分化和凋亡,”Holland-Frei癌症Medicine_NCBI书28页。卷。5日,6日版,2000年。视图:谷歌学术搜索
20. k .熊猫r .将d . j .将挑战和i . b . Chatterjee“维生素C可以防止香烟烟雾诱发体内氧化损伤,”自由基生物学和医学卷,29号2、115 - 124年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. k .熊猫r .将d将挑战,即b . Chatterjee”香烟烟雾诱发蛋白质氧化和蛋白质水解完全由其焦油阶段:预防的维生素C,”毒物学字母,卷123,不。1,21-32,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. k .熊猫和i . b . Chatterjeeα-生育酚未能防止香烟烟雾诱发蛋白氧化。在比较与其他抗氧化维生素。维生素E的百科全书,v . r . Preedy Ed, 63章,页883 - 893,CABI出版社,牛津郡,英国;王'sCollege,伦敦,英国,2007年。视图:谷歌学术搜索
23. j .包Alroy, h·沃特曼et al .,”苏氨酸磷酸化转移内化表皮生长因子受体的降解通路回收内体,“《生物化学》杂志上,卷275,不。34岁,26178 - 26186年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 古德曼,营养和癌症:最先进的积极健康的出版物有限公司,斯特拉斯堡,弗吉尼亚州,美国,2003年。
25. k . a的头,“抗坏血酸的预防和治疗癌症,”替代医学检查,3卷,不。3、174 - 186年,1998页。视图:谷歌学术搜索
26. b·弗雷和美国劳森,“维生素C和癌症再现,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷105,不。32岁,11037 - 11038年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. Stepanov, j .詹森·d·Hatsukami,赫克特,“烟草亚硝胺在新烟草产品,”尼古丁和烟草研究,8卷,不。2、309 - 313年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. p . Wheatley-Price f.a.h ayek牧羊人,“表皮生长因子受体抑制剂治疗非小细胞肺癌,”肺癌:预防、管理和新兴疗法埃德·d·j·斯图尔特,页107 - 138,胡玛纳出版社,风险中,新泽西,美国,2010年。视图:谷歌学术搜索
29. e·m·汗r . Lanir a . r .能源部和t·戈德科恩“表皮生长因子受体暴露于香烟烟雾是异常的激活和经历细胞核周围的贩卖,”美国实验生物学学会联合会杂志,22卷,不。3、910 - 917年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. t·j·林奇,d . w . Bell r . Sordella et al .,“激活表皮生长因子受体突变的潜在反应非小细胞肺癌吉非替尼,”《新英格兰医学杂志》上,卷350,不。21日,第2139 - 2129页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. a·a·费舍尔m . t . Labenski s Malladi et al .,“醌亲电试剂选择性加合物”亲电试剂结合主题“在细胞色素c,”生物化学,46卷,不。39岁,11090 - 11100年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. f . Ciardiello f·德·维塔,m . Orditura和g . Tortora”的角色在nonsmall细胞肺癌表皮生长因子受体抑制剂,”目前在肿瘤的意见,16卷,不。2、130 - 135年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. a . Debucquoy j . p . Machiels w·h·麦克布赖德,k . Haustermans”一体化的表皮生长因子受体抑制剂与术前放化疗,”临床癌症研究,16卷,不。10日,2709 - 2714年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. p . s . Sukhramani p s Sukhramani, m . p . Suthar”EGFR激酶:潜在的癌症治疗的目标,”IJPI的药理学和毒理学杂志》上,1卷,不。1,2010。视图:谷歌学术搜索
35. k . Oda y松岗,A . Funahashi h .北野,“一个全面的表皮生长因子受体信号通路地图,”分子系统生物学2005.0010,1卷,文章ID, 2005。视图:谷歌学术搜索
36. o . e . Sørensen d·r·Thapa k . m . Roupe et al .,“人类皮肤创伤性先天免疫反应介导的transactivation表皮生长因子受体,”临床研究杂志,卷116,不。7,1878 - 1885年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 江黄f·d·柯克帕特里克,x, s . Gygi和a·索金“微分调节EGF受体内化和退化multiubiquitination激酶结构域内”分子细胞,21卷,不。6,737 - 748年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. 江x和a·索金,“表皮生长因子受体通过内化clathrin-coated坑需要Cbl无名指和脯氨酸域而不是受体polyubiquitylation,”交通,4卷,不。8,529 - 543年,2003页。视图:谷歌学术搜索
39. y Mosesson, k . Shtiegman m . Katz et al .,“酪氨酸激酶受体的内吞作用是由monoubiquitylation,不是polyubiquitylation,”《生物化学》杂志上,卷278,不。24日,第21326 - 21323页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. g . Levkowitz h·沃特曼,s . a . Ettenberg et al .,“泛素连接酶活性和酪氨酸磷酸化构成抑制生长因子信号通过c-Cbl / Sli-1,”分子细胞,4卷,不。6,1029 - 1040年,1999页。视图:谷歌学术搜索
41. 我比万科和c·l·索耶斯”磷脂酰肌醇3-kinase-AKT通路在人类癌症,”自然评论癌症,卷2,不。7,489 - 501年,2002页。视图:谷歌学术搜索
42. j·罗、b·d·曼宁和l·c·坎特”针对PI3K-Akt通路在人类癌症:基本原理和承诺,“癌症细胞,4卷,不。4、257 - 262年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. s . Vicent j . m . Lopez-Picazo g·托莱多et al .,“激活ERK 1/2在非小细胞肺癌和与先进的肿瘤,”英国癌症杂志》,卷90,不。5,1047 - 1052年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. s . Vicent j . m . Lopez-Picazo g·托莱多et al .,“激活ERK 1/2在非小细胞肺癌和与先进的肿瘤,”英国癌症杂志》,卷90,不。5,1047 - 1052年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. e·s·亨森和美国b·吉布森“幸存细胞死亡通过表皮生长因子(EGF)信号转导途径:对癌症治疗,”细胞信号,18卷,不。12日,第2097 - 2089页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. 黄r . p . a .彭a Golard et al .,“过氧化氢促进大鼠肝脏转化non-neoplastic上皮细胞通过表皮生长因子受体的激活,“分子致癌作用,30卷,不。4、209 - 217年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. j·h·帕特尔和美国b·麦克马洪BCL2是MIZ-1至关重要的下游效应阻止c-MYC-induced凋亡,”《生物化学》杂志上,卷282,不。1,第5 - 13页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. c . e . Nesbit j . m . Tersak, e . v . Prochownik“MYC致癌基因和人类肿瘤疾病,”致癌基因,18卷,不。19日,3004 - 3016年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. s . Pelengaris m .汗,g . Evan”原癌基因:不仅仅是一个生死攸关的问题,”自然评论癌症,卷2,不。10日,764 - 776年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. k .野口c . Kitanaka h . Yamana a . Kokubu t . Mochizuki y Kuchino,“监管原癌基因通过磷酸化ser - 62和ser - 71 c - Jun氨基端激酶,”《生物化学》杂志上,卷274,不。46岁,32580 - 32587年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. p . Dobrzanski t Noguchi k . Kovary c·a·里佐Lazo p s, r·布拉沃,“fosB基因的两种产品,fosB及其短形式,fosB /科幻小说,在成纤维细胞转录激活物,”分子和细胞生物学,11卷,不。11日,第5478 - 5470页,1991年。视图:谷歌学术搜索
52. s·f·罗森伯格,j·s·芬奇,a·古普塔和g·t·鲍登,“细胞外signal-regulated激酶1/2-mediated jund磷酸化和fosb冈田段需要激活蛋白1激活,“《生物化学》杂志上,卷274,不。2、1124 - 1130年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. 岸本t·佐佐木h .小岛r . a . Ikeda h . Kunimoto和k .中岛以“时空调节c-Fos ERK5和E3泛素连接酶UBR1,及其生物学作用,”分子细胞,24卷,不。1,第75 - 63页,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. j . Basbous d . Chalbos r . Hipskind Jariel-Encontre,和m . Piechaczyk”Ubiquitin-independent Fra-1是反感的蛋白酶体降解Erk1/2 pathway-mediated磷酸化的独特的c端破坏,”分子和细胞生物学,27卷,不。11日,第3950 - 3936页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. n·f·萨巴和f·r·Khuri”化学预防策略的肺癌患者筛查的背景下,“临床肺癌,7卷,不。2、92 - 99年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. n·贝利,r . l . Keth和f·r·赫希“肺癌预防”肺癌:预防、管理和新兴疗法埃德·d·j·斯图尔特,页107 - 138,胡玛纳出版社,风险中,新泽西,美国,2010年。视图:谷歌学术搜索
57. f·a·g·da Cunha桑托斯牧羊人,m . s .曹”EGFR突变和肺癌。”年度回顾的病理》第六卷,49 - 69年,2011页。视图:谷歌学术搜索
58. n .准备,”抑制表皮生长因子受体的结合形态治疗局部晚期非小细胞肺癌,”在肿瘤学研讨会,32卷,不。3,S35-S41, 2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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