端粒的G-Quadruplexes:从人类四膜虫重复

文摘

人类端粒和原生动物的端粒序列差异只在一个嘌呤基地重复;TTAGGG端粒序列;和TTGGGG原生动物的序列。在这项研究中,从这些重复G-quadruplexes形成之间的关系及其衍生物进行了分析和比较。人类端粒DNA序列G₃(T₂AG)₃)₃和相关序列中的每个腺嘌呤基系统取代了鸟嘌呤进行调查;结果是四膜虫重复。替换不影响G-quadruplexes的形成,但可能会导致不同的拓扑结构。结果还表明,在序列取代衍生物的稳定性增加更多的替换。此外,大多数含有缺陷的重复序列分析在这项研究中也发生在人类和四膜虫基因组。一般来说,G-quadruplex结构在任何生物的存在是一个来源的局限性在生命周期。因此,基地的影响有更全面的理解,替换的结构性变化G-quadruplexes将相当大的科学价值。

1。介绍

G-rich DNA序列可以形成内部和分子间G-quadruplexes基于一个或多个DNA链的协会。人与人之间的核苷酸G-runs循环折叠G-quadruplex结构形式可以采用各种不同的拓扑形式(1,2]。当鸟嘌呤大片面向同一方向,双链逆转(螺旋桨)循环链接两个相邻平行链形成平行结构(3]。当鸟嘌呤大片面向相反的方向,扁或斜循环链接两个反平行的线形成一个反平行的G-quadruplex [4]。在反平行的混合或所谓的( )结构,面向单个链从其他方向不同5- - - - - -7]。一本小说( )类型折叠它最近被Marušič等人展览所有三种循环的构象发生在一个构象:胡搅蛮缠,对角线,双链循环逆转(8]。此外,分子间multimeric G-quadruplexes协会可以由两个或两个以上的链(9]。

这些结构强调高度的G-quadruplex结构多态性,这一现象取决于很多不同的因素:长度和核酸序列,在折叠反应和环境条件如缓冲区,pH值、稳定阳离子,温度,和代理的存在导致脱水(10- - - - - -14]。G-rich序列与倾向形成G-quadruplex结构可以位于人类基因组DNA的许多地区,特别是在一些生物重要的地区包括线性年底真核染色体端粒(15,16]。但是假定G-rich在基因组序列并非随机分布;这样的序列主要发生在protooncogene地区(促进细胞增殖)和枯竭的肿瘤抑制基因(维持基因组稳定)(17]。很可能,这些假定的序列可以形成在活的有机体内在活细胞和其存在的直接证据仍然是一个主题的讨论(18- - - - - -20.]。毫无疑问,最广泛研究G-quadruplex形成序列是那些位于3′末端的人类端粒。端粒序列和专门的蛋白质复合物的帽线性染色体的末端对染色体的稳定性和基因组完整性至关重要(21- - - - - -23]。哺乳动物的端粒由G-rich序列的串联重复序列, 。几个碱基序列的双链,但仍有超过一百个核苷酸未配对,形成单链3′悬臂(24),一个国家将提供有利条件形成的一个或多个G-quadruplexes在活的有机体内(22]。端粒的结构和稳定发挥重要作用在癌症和细胞衰老的发展25,26]。也有证据表明,端粒作为一种生物钟,端粒结构似乎与每个连续的细胞周期变短。永生化细胞和癌细胞,然而,端粒酶被激活来维持端粒的长度由reelongating染色体末端的端粒序列(27,28]。G-quadruplexes由单链人类端粒DNA也被证明能够抑制端粒酶的活性(29日),而这一发现已经引发了一系列的利益结构作为有吸引力的潜在药物靶点[30.]。

广泛的研究人类端粒G-quadruplexes已经使用各种不同的技术(1]。迄今为止,高分辨率的四个不同的折叠结构拓扑和三个G-tetrad层已确定为四个人类端粒重复(1- - - - - -7]。此外,额外的结构组成的只有两个G-tetrad层还透露,突出了端粒的结构多态性G-quadruplexes [31日]。人类端粒DNA的结构在拥挤的解决方案也被许多作者研究[11),但这种结构可能是由于脱水而不是分子拥挤(12,32,33]。各种各样的结构确定的日期也可以归因于侧翼核心之外的核苷酸序列的存在G₃(T₂AG)₃)₃和离子的浓度,并使用不同的实验方法和条件1,34]。

一系列的系统的研究涉及衍生品的人类端粒重复序列是由Vorlickova et al。35- - - - - -38),这些早期的研究集中在替换为腺嘌呤、鸟嘌呤的步行不能的网站,8-oxoadenine取代腺嘌呤和胸腺嘧啶的替换5-hydroxymethyluracil端粒重复进行了分析(39- - - - - -41]。然而,在这项研究中,一个相反的策略应用,替代的腺嘌呤鸟嘌呤(见图1)。主要目的是实现总转换四个人类重复四膜虫重复而形成分子内G-quadruplex保留能力。有趣的是,G-rich重复包含缺陷也被发现在人类和四膜虫基因组;见表1和支持材料。

在这项研究中,我们检查结构形成的四膜虫端粒序列,dG₄(T₂G₄)₃不同于人类由单个G-for-A替换每个重复序列(42]。自Gs G-quadruplexes的形成至关重要,我们有系统地替换这三个腺嘌呤鸟嘌呤的TTA循环G-quadruplex-forming序列的G₃(T₂AG)₃)₃,从而增加的数量由三鸟嘌呤鸟嘌呤/寡核苷酸。圆二色性光谱(CD)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)被用来观察碱基替换的影响(s)的形成,热稳定性,G-quadruplexes的构象。测量进行的Na⁺和K⁺离子和peg - 200或乙腈浓度在0,15日,30岁和50 wt %在不同的温度下。此外,G-quadruplex结构的形成是验证和确认使用噻唑橙()。是一个很好的DNA荧光探针进行DNA结构形式,由于其高荧光量子产率(43]。G-quadruplex这配体稳定的结构,也可以诱导拓扑变化(44,45]。G-quadruplex-TO复杂的提供了一个特征轮廓induced-circular二色性频谱在缓冲区包含钠阳离子44]。

2。材料和方法

所有实验进行了修改Britton-Robinson缓冲区(mRB), 25毫米磷酸,25毫米硼酸,25毫米醋酸,辅以50 mM的氯化钾和氯化钠,peg - 200(平均分子量的聚乙二醇200)和乙腈(费舍尔斯洛伐克);pH值调整,力图最终值为7.0。寡核苷酸序列见表1买来Metabion国际AG)。冻干的DNA样本溶解在重蒸馏的水使用前给1毫米股票的解决方案。单链DNA浓度测定通过测量吸光度在高温260海里(95°C)。

2.1。CD光谱

CD和紫外可见光谱测量使用Jasco模型j - 810分光偏振计(伊斯顿,医学博士,美国)。电池座的温度是由ptc - 423 l的温度控制器。扫描进行了一系列的220 - 600 nm的反应体积300μl在试管的路径长度0.1厘米,乐器扫描100海里/分钟的速度,1纳米,和1 nm带宽、响应时间的2 s。CD数据代表三个平均扫描采取的温度范围0 - 100°C。DNA样本都溶解和稀释在合适的缓冲区包含适当的离子浓度和脱水剂。实验中使用的DNA寡聚物的数量一直接近25μ米的DNA链浓度。样品在95°C加热5分钟然后允许冷却前初始温度测量。CD谱表示为不同的摩尔吸收右旋和左旋圆偏振光(Δε以米为单位⁻¹·厘米⁻¹。物质的量浓度与DNA寡聚物。缓冲区基线谱获得了使用相同的试管和减去样品光谱。热稳定性不同的四重的测量通过记录CD椭圆率在295和265海里作为温度的函数14,46]。温度范围从0到100°C,和升温速率为0.25°C /分钟。熔化温度()被定义为midtransition的温度点。估计的峰值拟合曲线的一阶导数。DNA滴定的浓度增加了。随着在DMSO溶液达到最终原液的浓度的10毫米。DNA的浓度在1毫米石英细胞是30μM和0 - 200μM,分别是~ 67的增量μm .每个样本混合大力3分钟后增加;立即CD /紫外光谱测定。

2.2。电泳

0.3样品组成的μl 1毫米股票的解决方案使用nondenaturing页面在一个温控电泳分离装置(Z375039-1EA;Sigma-Aldrich,旧金山,CA) 15%(19: 1丙烯酰胺/ bisacrylamide)丙烯酰胺凝胶。DNA是装上 cm凝胶。电泳是在10°C运行4小时在125 V (V·~ 8厘米⁻¹)。每个胶沾StainsAll (Sigma-Aldrich)。凝胶也染色使用银染色过程以提高DNA可视化的敏感性(44]。

2.3。荧光光谱

荧光光谱是在22日瓦里安卡里Eclipse荧光分光光度计±1°C配备温控循环器。一个石英试管3 mm路径长度被用在所有的实验。荧光测量,激发和发射缝5 nm和扫描速度是240 nm /分钟。66年μ滴定与DNA的M(3.3、6.6和13.2μ米)mRB缓冲区中存在和缺乏单价金属阳离子。DNA和配体之间的摩尔比是1:20日1:1:5。激发波长调整到452海里。

3所示。结果与讨论

3.1。序列设计和CD谱

序列来自人类端粒序列d (G₃(T₂AG)₃)₃)和取代衍生品在不同条件下进行了研究。DNA序列和本研究中使用的缩略语表进行了总结1。点1、2和3显示的位置基本替换在第一,第二,第三的循环HTR序列,分别。0表示一个侧翼鸟嘌呤的5′末端寡核苷酸,人物1。来自HTR DNA寡核苷酸,鸟嘌呤(G)鸟嘌呤(TTA)循环被替换下场的期望将保留修改后的序列形式G-quadruplexes自发的能力,尽管不同的拓扑比HTR序列。分析了HTR衍生品的50 mM氯化钠和氯化钾,人物2。第一组代表寡核苷酸在不同位置只包含单点突变;HTR₁,HTR₂,HTR₃(黑色线条图2)。第二组代表包含两个点突变的寡核苷酸(用蓝色光谱显示在图2)。前两个循环在HTR修改_1、2,第一个和最后一个循环在HTR改变_1、3和第二个和第三个循环在HTR修改_2、3。寡核苷酸HTR_0、1、3,HTR_0、2、3,HTR_1、2、3包含三个G-for-A替换(绿色)光谱。HTR的频谱和融化的温度_0、1、2非常类似于HTR序列_0、2、3序列(在本研究中未显示),而HTR_{0、1、2、3}相当于用力推序列序列。

替换序列也比普通的HTR和刺序列。概括地说,每一个鸟嘌呤残留在任何G-run可能参与G-tetrads的形成。在三层的形成G-tetrad四重的,循环的长度被发现不同碱基替换时引入HTR序列;循环可以由三个或四个核苷酸取决于位置和数量的替换。然而,我们不能排除的形成的可能性但是G-quadruplexes序列包含三个替换,但重要的是要注意,这种结构必须包括至少一个heteronucleotide-tetrad腺嘌呤也存在。到目前为止,全身刺的3 d结构序列存在钾还未确定;结构,这是已知的唯一方面的四聚物的G-quadruplex结构由四个短序列d (TTGGGGT) (PDB: 139 d) [47]。这种结构由四个G-tetrads,不能代表真正的完整长度的寡核苷酸的结构。然而,用力推的3 d结构已经确定只有在钠的存在(PDB: 186 d) (48]。这个结构包含三个堆叠G-tetrads,两个扁循环,和一个double-chain-reversal循环。尽管用力推的序列和HTR只有6个核苷酸的不同,他们的3 d拓扑结构有很大的不同,因为HTR钠含量采用three-G-tetrad结构组成的两个扁环和一个中央对角循环(PDB: 143 d) (4]。然而,HTR序列也可以采用一个稳定的篮式构象的只有两个G-tetrad层组成的钾(PDB: 2 kf8) [31日]。

几种天然HTR序列到目前为止,尚未发现。表格1 (PDB: 2 hy9)和2 (2 jpz)由三个G-tetrads,但循环的顺序不同;HTR形式一个double-chain-reversal和两个扁循环在两种形式49,50]。有一些相似之处与刺G-quadruplexes在溶液中形成的钠(48]。形成3是由一个平行G-quadruplex三double-chain-reversal循环(PBD: 1 kf1) [3]。最近,林等人也证实的结构27-nt HTR导数在钠的存在明显不同于上面提到的这些(PBD: 2 mbj) [1]。尽管已知HTR结构解决钠具有相同的相对链取向,他们不同加以形成氢键和循环安排。再2 mbj结构由两个沿边和一个double-chain-reversal循环。

的端粒序列来自Oxytricha d (G₄(T₄G₄)₃](PDB: 201 d和230 d)采用类似的结构类型的循环与HTR钠;两个扁和一个中央对角循环(4,51,52]。然而,Oxytricha序列形式但是G-tetrad四重的。在撰写本文时,Oxytricha序列的解决方案结构d (G₄(T₄G₄)₃在K⁺包含解决方案尚未确定。主要原因可能是这个序列,用力推的钾可以采用不同的拓扑形式共存的解决方案;电泳分离过程中观察到其他乐队(14]。有趣的是,但是G-quadruplexes非常稳定,表现出特别高熔化温度的钾(14]。最近,d (GGGGCC)的结构₄的钾也已确定;胞核嘧啶代替胸腺嘧啶残留和包含一个序列8-bromodeoxyguanosine (PDB: 2 n2d) [53]。G-quadruplex结构采用这个序列可以密切相关,用力推的钾。这个反平行的结构由四个G-quartets相连三扁碳碳循环。CD光谱结果表明许多签名与刺序列。的胞核嘧啶在每个循环的堆在G-quartet;一个安排,结果是一个非常紧凑的和稳定的结构。同样,结构的熔化温度高于90°C。

人们普遍认为CD光谱是一个非常有用和有成本效益的方法提供第一眼折叠G-quadruplexes的体系结构。G-quadruplexes CD光谱可以用来表示DNA是否并入一个平行或反平行的构象36,54]。

虽然有多达25通用折叠G-quadruplexes拓扑,可以分类为基础的结构分成三组序列的鸟嘌呤核苷的糖苷键角采用G-quadruplex [55]。组我由平行G-quadruplexes链面向同一方向和鸟嘌呤核苷的糖苷键角。并行G-quadruplexes(我)共享相同的特征而不管它们包含三个或四个循环:强烈的积极最大~ 265 nm ~ 240 nm和最小。第二和第三组由反平行的G-quadruplexes;第二组可以以鸟嘌呤核苷的糖苷绑定等方向的角度anti-anti和syn-syn也syn-anti和anti-syn,而第三组由堆叠鸟苷不同糖苷键角。反平行的G-quadruplexes展示积极的乐队在295 nm ~。积极的和消极的CD ~ 265 nm ~ 240 nm信号,分别是第二组的特征,而第三组显示反向峰值。相比之下,高要求的CD光谱G-quadruplex架构组第三形式展现正面和负面的信号,在240 nm ~ 265 nm,分别为(55]。

光盘资料对应不同的G-quadruplex构象决定经验;因此,CD光谱的解释未知的假定的G-quadruplex序列可以模糊。其他一些因素也会导致一定程度的不确定性评估CD光谱,包括,例如,混合种群的存在各种矫形器和/或存在multimeric溶液中的构象(9,14,44,46]。

CD测量清楚地表明,G-for-A替换有相当大的对每个序列的谱剖面的影响。G-quadruplex脚手架的存在形成的未修改的HTR序列的特点是积极的峰值与两个肩膀~ 295 nm左右~ 270 ~ 250 nm的钾(图2(a),红线)。根据CD光谱这些签名的特征组II反平行的G-quadruplexes。这个光谱表明形成两层篮式结构(31日,55]。HTR序列采用明确的反平行的G-quadruplex构象组II型的钠(图2(d),红线)。结构特点是大量积极的最大值~ 295 nm, ~ 245 nm,附近的一个小的和一个消极的CD高峰在265 nm ~。先前的研究已经报道,这些序列形成一个分子内,篮式反平行的G-quadruplex [4]。每个序列显示了一个明确的峰值在~ 295 nm的特点是一个反平行的G-quadruplex拓扑。第一组低聚物与单个每寡核苷酸替换钾的存在显示了两个分开的山峰~ 295 ~ 265海里;信号主要在295 nm(光谱黑)所示。然而,刺和HTR衍生品包含一个或多个G-for-A替换的钾显示峰值的增加~ 265 nm(数据2(b)和2(c))。这表明多个拓扑结构的共存,也就是说,这两个平行和反平行的配置;参见电泳结果图7。结构多态性被认为增加越来越多的Gs的DNA序列。CD信号~ 265 nm(光谱绿色所示)主要包含三个寡核苷酸替换(图2(c))。

在钠的存在,只有HTR₂序列与一个替换第二个循环表现出CD谱相同HTR,尽管这信件显示在点缀黑色低振幅(光谱图2(d))。HTR₁和HTR₃序列替换在第一和第三个循环,分别也显示积极的最大值295海里,但负峰值在265 nm浅,略转向长波长相比的结果修改的序列。尽管有这些差异,他们仍然有可能形成G-quadruplexes小组第三。只有用力推的CD谱序列显示了第二组类型的签名。

样品在第二组表现出一个积极的最大~ 295 nm略微转向低波长在HTR的情况下_1、2和HTR_1、3(集团三世,光谱蓝在图所示2(b))。这两个序列显示缺乏一个负峰在265 nm,和较小的正峰值在245纳米左右轻微转向长波长(图2(e))。HTR_2、3显示了一个消极信号~ 245 nm和265和295海里的积极信号,结果表明第二组反平行G-quadruplexes的形成。

HTR的CD光谱_0、2、3接近的组II G-quadruplexes而HTR的CD吗_0、1、3和HTR_1、2、3第三组G-quadruplexes相似。所有样品和三个突变表现出一个积极的最大在295 nm ~。HTR_0、1、3展品的负面信号在235和275海里的钠(图2(f)),而HTR_0、2、3显示了积极的信号在265和295海里。

一般来说,所有的修改Na序列的存在⁺和K⁺被认为在某种程度上不同的HTR谱,也发现不同于对方。不同CD光谱不同样本配置文件是轻微G-quadruplex拓扑变化的结果。然而,它是不可能确定的组织或结构G-quadruplexes确定性的CD光谱资料的基础上,仅由于共存的各种拓扑形式,证实了这一发现电泳结果中讨论部分3.5。

3.2。CD光谱的peg - 200和乙腈

在K⁺,脱水剂peg - 200诱导端粒的G-quadruplexes的构象变化,主要从一个反平行的结构过渡到一个平行排列2,9,11,13,14,56]。因此,peg - 200和另一个的影响脱水剂乙腈CD谱结果和HTR衍生品的稳定性也被调查。HTR代表CD光谱和刺在不同浓度的脱水代理(15、30、50 wt %)和50毫米氯化钾如图3。两种类型的dna被发现G-quadruplex形式结构与螺旋推进器的平行排列的K⁺。然而,当序列进行了研究与没有钾钠的存在,没有观察到结构转换;这一发现保持不变的所有研究HTR衍生品和刺。有趣的是,在peg - 200浓度50 wt %的正峰在295海里消失和CD信号被发现在265纳米是记录~ 2倍比没有挂钩的存在- 200。乙腈的观察同样的效果。这是一个内在属性的任何转换G-quadruplex分子。在最近的一项研究中,我们提出了一个假说解释这个事实;CD信号取决于堆糖基的数量和方向债券(9,14,57]。我们之前也表明,peg - 200导致HTR[二聚9];因此电泳分析序列的peg - 200的存在也表现,人物8。

HTR的熔化温度和绝大多数G-quadruplex结构已知的存在增加peg - 200。为了验证这个事实,融化温度测定的peg - 200的基础上CD融化曲线。结果总结在表2并明确确认挂钩- 200增加了HTR衍生品的熔化温度。方法,已用于我们的以前的研究,双波长测量为例进行的光谱峰值显示在295年和265海里,分别为(9,11]。一个获得了63.2°C的mRB缓冲区包含50 mM氯化钾,相比值为50.4°C的缓冲50 mM氯化钠HTR 295海里。产生的整体稳定性的热力学数据G-quadruplexes HTR衍生品增加而增加的数量在Na G-for-A替换⁺和K⁺解决方案。最低的HTR值被记录在50 mM氯化钾和氯化钠50毫米。的HTR衍生品被发现在氯化钾氯化钠。所有的研究序列显示更高价值的存在脱水代理。结果表明,peg - 200稳定G-quadruplexes有或没有A-for-G突变。拟议的融化温度总结表2清楚地表明G-tract鸟嘌呤残留物的数量和性质稳定的离子是重要的决定因素G-quadruplexes的热稳定性。

3.3。滴定法测量

我们组最近发明了一种新的实验方法的识别G-quadruplex形成序列使用花青染料噻唑橙()。是一个很好的DNA荧光探针对各种结构图案由于其高荧光量子产率(58]。这种实验技术还可以用于研究假设HTR衍生品采用G-quadruplex构象。与各种DNA二级结构,但它有一个更强的亲和力三缸和G-quadruplex结构比其他结构主题(43,45]。虽然是光学活性,TO-quadruplex复合物是手性的,并显示一个独特的诱导CD (ICD)光谱中的可见光区域(44]。最近我们已经描述了许多不同的G-quadruplex结构共同ICD功能。TO-quadruplex互动的结果是积极的在265年达到顶峰,295海里(紫外线范围)和三个山峰可见地区512 ~ 492年~ ~ 473纳米溶液中没有金属阳离子的存在或存在Na⁺(44]。促进形成G-quadruplex结构即使没有其它阳离子的存在,但采用拓扑诱导不同相比,溶液中的钠或钾的存在;CD在紫外区域可以是不同的。一个完全不同的ICD的dna无法采用G-quadruplex结构复杂的观察序列(44]。然而,其他G-quadruplex配体在我们实验室测试是不适合这个目的并提供模棱两可的结果;例如,Thioflavin T,卟啉衍生物,赫斯特33342年,赫斯特33258年。这种方法的目的是作为一种辅助技术因为它扩展的可能性基本谱方法的区别G-quadruplex结构不使用更加昂贵和耗时的方法。ICD监测可以应用在不同的条件下,但它是最敏感的解决方案没有金属阳离子的存在;也可以应用包含Na略降低灵敏度解决方案⁺或低浓度的K⁺(< 5毫米)。应该注意,ICD剖面的解释在更高浓度的K⁺绝不是明确的。尽管如此,我们也进行滴定实验50 mM氯化钾,因为这种情况的存在更多的生物有关。

滴定分析的结果在50 mM氯化钠在图所示4。ICD的结果显示预期的积极信号~ 495 ~ 510 nm ~ 475 nm和消极的信号,特征为G-quadruplexes签名。此外,G4C2序列进行了分析,因为它含有钾3 d结构解决方案。正如所料,这寡核苷酸还发现在给定的条件下形成G-quadruplexes。信号对应的反平行的G-quadruplex结构显然也发现在紫外区域。通过增加的浓度,在295和265海里的信号被减少和增加,分别从反平行的现象表明一个转换到平行折叠。这种效应也观察到的影响下挂钩- 200,图3。

就像上面所提到的,滴定测量在50 mM氯化钾也表现,人物5。观察在紫外区域的信号显然表明G-quadruplex结构形成的钾,但结构转换的影响显著抑制。一个密集的ICD信号最多可能有500海里是对应于DNA和配体之间的复合物的形成。然而,有一个明显的缺乏明确的共同特征的一般观察资料获得的钠。有趣的是,用力推的ICD序列倒置,因此我们建议用力推的绑定模式是不同于HTR衍生品。另一种解释是,刺至少两种不同的拓扑在溶液中构象形式,这些形式之一,可以更有效地结合。在我们先前的研究中,用力推至少有三个不同的结构形式存在的钾(14];因此,我们决定使用电泳分离来验证这个假设。

是很重要的排除使用的潜在副作用DMSO在滴定实验。股票的解决方案包含DMSO,极性非质子溶剂中可能产生的效果类似于挂钩- 200 (56]。DMSO溶液的浓度用于我们的实验没有超过4.5 wt %。为了消除DMSO溶液脱水效果可能会导致在滴定实验中,也表现在DMSO溶液滴定分析。然而,没有观察到显著的影响浓度低于5 wt %没有Na⁺K⁺和离子。然而,DMSO溶液的存在在溶液中含K⁺可以解释的轻微差异ICD在K浓度资料吗⁺大于5毫米。

3.4。荧光分析

dna复合物显示清晰但广泛吸收约500海里。观察一个积极的峰值在波长452纳米,这是用于dna复杂的激励。HTR和刺序列的荧光光谱图所示6。测量是在三种不同的环境下表现:(i) mRB缓冲区没有金属阳离子,(ii) mRB缓冲补充50 mM氯化钠,和(3)mRB补充氯化钾50毫米。两个寡聚物的荧光增强实现最高的产量没有金属阳离子的解决方案。HTR的荧光产额大于刺的收益率三个测试条件。这个实验的目的是证明荧光的形象不是极大地依赖于DNA序列的寡核苷酸配体。可以诱导形成的荧光增强任何类型的G-quadruplex结构。

3.5。电泳的Na⁺K⁺,并

Nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一个可访问的技术用于补充光谱数据当G-quadruplexes的多个物种的存在不能容易被识别基于CD光谱。DNA样本的流动性取决于很多不同的因素,包括构象、电荷、分子质量。电泳分离可以提供宝贵的信息G-quadruplexes的分子状态。分子内G-quadruplexes有结构紧凑,因此通过cation-containing凝胶迁移速度比线性同行,而分子间G-quadruplexes迁移更慢因为他们的高分子量(9,14,44]。寡聚物d (AC)₉d (AC)₁₄和d (AC)₁₈被用作标准由于其缺乏二级结构。这些标准作为基准比较不同电泳的流动模式。因为没有超过22元。使用的序列,被观察到的寡核苷酸迁移速度比d (AC)₉可以确定为形成分子内G-quadruplexes。也是合理假设寡核苷酸以相似的速度移动更慢或d (AC)₁₈采用高阶G-quadruplex结构。图7显示了本地15%聚丙烯酰胺凝胶电泳记录说明的相对机动性寡聚物的50 mM氯化钠和氯化钾在10°C(数字7(一)和7 (c))。此外,相应的电泳结果,凝胶和加载缓冲区包含2摩尔当量,如图7 (b)和7 (d)。一般来说,一些明确的趋势出现。凝胶电泳中执行的存在表明,所有的寡核苷酸钠已经在一个大部分,与单一乐队迁移速度比d (AC)₁₈在每一列。这种效应也观察到当在场的凝胶。这些结果表明,所有DNA寡核苷酸形成反平行的分子内G-quadruplexes在这些条件下。这些结果同意CD光谱的结果。重要的是要注意,形成了分子内结构只在钠的存在尽管HTR引入突变序列的可能性增加G-quadruplexes的不同拓扑结构的形成。电泳并没有透露任何重大异常低聚物的流动;序列长度相同的发现将或多或少都是一样的。

与钠、钾的存在导致内部和分子间的形成安排(数字7 (b)和7 (d))。在第一组,HTR₁四倍的一个替代在第一循环表现出最快的迁移HTR的乐队相比。一个涂片HTR乐队也观察到₂序列。涂片通常出现在两个截然不同的矫形器可以形成;慢两个矫形器之间的异构化在电泳分离是带拖尾效应的主要来源。HTR和HTR的流动性₃序列替换在第三个循环是相似的。包含两个寡核苷酸替换/低聚物显示高水平的多态性。这些寡核苷酸形成多个共存的矫形器,因为每一行包含几个乐队以不同的速度移动。有趣的是,HTR_1、2和HTR_1、3序列显示两个知名乐队更快,结果对应于分子内构象的形成,和慢乐队代表multimeric结构。的增加也导致了矫形器合并最快和最慢的结构来减少。HTR_2、3慢了更快的内部和分子间物种(二聚体和四聚物)。令人惊讶的是,三个替换的寡核苷酸/低聚物被发现是不那么多态与序列包含两个替换相比,只显示大小对应于较低的乐队的形成multiple-molecular G-quadruplexes HTR的情况下_0、1、3和HTR_1、2、3序列。只被发现产生有限影响multimeric形式的这些寡核苷酸。

3.6。电泳的peg - 200

HTR二聚的依赖挂钩200浓度已经在先前的研究分析9]。分子内和分子间二聚体的形成单体在缓冲区包含挂钩wt - 200浓度的15%。包含2和3的HTR衍生品替换被容易转换成慢迁移二聚的结构甚至在低浓度的peg - 200。50 wt %的浓度peg - 200和50毫米氯化钾,完整的结构转换为一个平行的二聚的G-quadruplex诱导,数字3和8。这种效应并未观察到缓冲区,不包含钾(9,14]。CD测量在50 wt % peg - 200 ~ 295 nm显示没有信号。基于我们之前的研究,分子间物种的迁移速度表明形成的二聚体(2,9,14]。HTR包含旁侧序列的3 d结构的类比条件已经确定使用核磁共振(11]。结果显示一个分子内平行G-quadruplex结构(PDB: 2 ld8),但悬臂核苷酸可以导致空间位阻的二聚结构。

4所示。结论

在这项研究中,我们清楚地表明,增加鸟嘌呤的数量在HTR循环地区序列支持G-quadruplex结构的形成。任何替换A-for-G增加熔化温度,而引入的几个替换被发现促进几个矫形器的共存的钾。这些替换的系统介绍最后导致序列中发生的形成四膜虫端粒。此外,类似的序列也发现了在人类基因组中。这些发现提出一个有趣的点。为什么四膜虫端粒序列需要可以采用这样的高度稳定G-quadruplex结构?一般来说,非常稳定G-quadruplexes通常是问题的来源细胞在一个生物体的生命周期。用力推序列比HTR多态;形成两个不同的单体的和一个二聚的矫形器在这里已被证明在我们先前的研究[14]。我们的分析集中在序列组成的四个G-runs没有任何突出核苷酸在两末端;这种类型的安排不是一个理想模型外推自然端粒重复通常由数万数以千计重复。

我们的结果表明,所有HTR衍生品包括刺可以从反平行的转换平行褶皱的钾和peg - 200。ICD光谱表明,以刺的绑定模式的氯化钾HTR衍生品可能不同于那些观察到,这是一个寻找其他分子也可能是重要的认识到刺结构。它表明,用力推的结构显示了一些结构特点不同于HTR和HTR衍生品的钾。确认这一事实仍然是一个悬而未决的生物学意义的话题。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了斯洛伐克研发机构合同。apvv - 0280 - 11和apvv - 0029 - 16日,欧洲科学技术合作(CM1406成本),斯洛伐克授予机构(1/0131/16和002 upjŠ-4/2015),和内部大学拨款(vvgs - pf - 2017 - 251和vvgs - 2016 - 259)。作者感谢g·考珀批判性阅读和修正的手稿。

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