一个潜在的高含量筛选小分子核糖核酸

文摘

在过去年microrna越来越被认定为有效的基因表达的转录后的监管机构。可能microrna施加他们的行动几乎任何生物过程的同时调节许多基因。miRNA-based监管的重要性在健康和疾病激发了研究调查不同方面的microrna的起源、生物起源和功能。尽管最近快速积累实验数据和功能模型的出现,miRNA-based监管的复杂性还远未被充分理解。特别是,我们缺乏综合知识microrna哪些细胞过程监管,,此外,时间和空间互动如何microrna目标发生。大规模的功能分析结果有巨大的潜力来解决这些问题。在这次审查中,我们讨论的最新进展应用高含量和高通量功能分析的系统说明生物microrna的角色。

1。介绍

microrna(小分子核糖核酸)是17-nt 24-nt长非编码rna在后生动物的调节基因的表达。microrna法案通过部分或完全互补绑定目标mRNA,导致平移镇压和/或信使rna降解[1,2]。microrna预计影响近60%的哺乳动物蛋白质编码基因的表达(3,4),从而控制很多,如果不是全部,生物过程。根本性的变化在细胞和有机体的层面,包括开发(5),老化(6),应激反应(7),细胞增殖8,9),和细胞凋亡10,11),被证明是由microrna。此外,microrna与各种疾病,如糖尿病(12- - - - - -14,癌症15,16)、丙型肝炎(17),神经发育(了18),和精神19)障碍。快速增长的知识microrna在健康和疾病强有力的监管机构使得治疗干预[microrna吸引力为目标20.,21)以及诊断标记(22,23]。

许多以前的出版物已经解决microrna的生物起源和行动(详细评论[24,25])。短暂,microrna转录只要主记录(pri-miRNAs),其中大多数是腺苷和限制。Pri-miRNAs最初是在细胞核裂解multiprotein复杂,称为微处理器,收益率~ 70 - nt长茎环结构的前体microrna (pre-miRNAs)。微处理器复杂的关键组件是核糖核酸酶III酶Drosha和双链rna结合蛋白DGCR8 /帕夏(26]。然后出口到切除pre-miRNA发夹的细胞质Exportin-5包裹着Ran-GTPase [27]。在细胞质中,pre-miRNA进一步加工20-22-nt长microrna的第二次核糖核酸酶III / microrna *双酶,帽子,这是在一个复杂和TRBP协定蛋白(28,29日]。随后,microrna的双工是由多个解旋酶解除,这可能是miRNA-specific并可能调节microrna的活动(30.,31日]。mRNA-targeting microrna的链(导链)加载到miRNA-induced沉默复杂(miRISC)。直到最近,人们认为microrna *互补链(乘客链)是退化的,但是现在有证据表明,大量的microrna *物种功能活跃(32]。核心组件Argonaute miRISC是蛋白质的(前)33)和GW182蛋白质的家庭(34]。个人microrna可能需要特定的成熟的步骤(35- - - - - -37]。

一旦纳入miRISC, microrna带来目标mrna的复杂互动与互补的结合位点,可以出现在多个副本(38- - - - - -40]。每个microrna通常会影响多个记录,因此,许多蛋白质同时[41,42]。另一方面,可以抑制多个microrna的表达一个目标mRNA (43- - - - - -46]。microrna是假定的优先绑定到3′未翻译区(3′utr)成绩单(47]。然而,最近的实验证据证明存在的一个新类的microrna的目标包含在他们的5′UTR microrna的结合位点和3′UTR [48)或信使rna编码区域内(49]。

miRNA-mediated调制基因表达的复杂性只是开始被欣赏,和需要做许多研究为了了解microrna的全球和自适应监管职能。在这次审查中,我们总结可用方法调节内源性microrna的表达水平,以及这些策略的应用对高含量和高通量功能研究。

2。RNA沉默

发现小ncRNAs(非编码rna)基本生物过程中扮演关键的角色已经大大扩大了我们的知识基因调控机制的最后一年50,51]。siRNAs(小干扰rna)和microrna ncRNAs的两个最佳特征类。都是来自dsRNA(双链RNA)前体和施加他们的抑制功能的沃森克里克碱基配对互补序列基因表达的目标RNA分子:通常被称为基因沉默产生影响(2]。此外,siRNAs和microrna分享一些组件的细胞效应机械参与基因沉默(52]。通常,microrna修改内源性基因的表达而siRNAs进化捍卫基因组完整对外国入侵者,如病毒或转座子(53]。在哺乳动物siRNAs 21 - nt长片段通常,但不总是,来自外国dsRNA帽子(52,54]。siRNAs纳入siRNA-induced沉默复杂(siRISC) [55)和绑定在目标分子完全匹配的序列。通常,这导致退化的RNA,一个名为RNAi的函数(RNA干扰)53,这个属性被广泛涉及功能的研究在过去的十年里(见下面)。

绑定mRNA的microrna的完美匹配的序列也可以导致退化的信使rna (56),但通常,microrna在mrna网站只有部分序列互补。这个结果主要是在平移镇压而不是退化(57),但也会导致二次nucleolytic信使rna的降解(24]。相反,绑定部分无与伦比的序列的siRNAs mrna可能导致平移blockade-potentially干扰siRNA-based筛选实验结果(56]。

3所示。核/ shRNA-Based屏幕

在过去年RNAi系统的研究已经发展成为一个强大的工具的基本生理和病理过程。许多大型屏幕已经完成,分析不同的细胞过程。最近令人印象深刻的例子全基因组RNAi-based屏幕提供人体细胞的工作Collinet et al。58),进行了高含量调查内吞作用的基因,并通过研究诺伊曼et al .,利用延时显微在活细胞识别基因,在细胞分裂中发挥作用59]。

siRNA-based屏幕还表现在一些生物模型。秀丽隐杆线虫和果蝇尤其接受这种类型的遗传筛查(60]。在秀丽隐杆线虫例如,基因沉默可以通过喂食细菌表达长dsRNA(约200 - 2000 - bp -长)或通过提供dsRNA在中(61年,62年]。培养细胞的RNAi果蝇同样可以增加引起的在体外转录dsRNA的培养基(63年]。在哺乳动物细胞中,相比之下,短RNA工器141/2 bp必须服用,因为很久dsRNA唤起先天免疫系统的反应,最终导致细胞凋亡(64年]。短siRNAs可以化学合成或来自转录PCR产品消化重组帽子或细菌核糖核酸酶III (esiRNAs-endoribonuclease-prepared短干扰rna) [64年,65年]。siRNA-mediated混战可以达到减少接近100%目标mRNA。然而,单个核的效果是很难预测的,因此,几个siRNAs针对不同区域目标mRNA的测试。一些作者建议检查4 - 6 siRNAs每个基因筛选实验中获得可靠的结果(66年]。

如果需要稳定压倒一切的或者很难使转染细胞,可以使用短发卡rna(成分)。序列编码的成分可以克隆到质粒或virus-derived向量(lenti、复古,或adenoviral起源)(67年- - - - - -69年]。在“第二代”成分的情况下,所谓的shRNA-miRs, RNAi-triggering小RNA序列克隆到一个pri-miRNA[的支柱70年]。这个设计原则,结合改进的选择小RNA的目标序列,提高生产水平的小分子RNA和沉默效率。shRNA-miRs可以克隆为构造带不同的启动子和用于组织或诱导表达(70年]。

4所示。调制的microrna的函数作为功能筛查的方法

显然,他们的生物的重要性本身使分析microrna的表达和识别目标mrna的当前研究的焦点。然而特定功能的microrna给他们强大的潜在功能基因组学的工具。首先,microrna能同时改变数以百计的mrna的翻译,通过这样做,添加一层调控基因表达(71年]。事实上,microrna能影响整个生物项目,包括开发、细胞凋亡、增殖,并分化,不仅通过与目标mrna的直接交互,也间接地通过改变的表达,例如,组件的翻译或RNAi机械(42]。

一般来说,microrna效果只有细微的调制的目标基因的表达。因此,他们明显影响细胞行为可能是他们的一个后果能力影响多个基因参与了一个途径。事实上,miRNA-based屏幕可以提供列表丰富功能相关的目标:例如,一个最近的RNAi屏幕识别三个目标基因,拟表型miR-19合作的监管phosphatidylinositol-3 kinase-mediated生存信号(72年]。miRNA-based屏幕,尤其是结合microrna siRNA-based屏幕,虽然费力,可能有一个明显的优势在siRNA-based屏幕,只有单一的个体差别与siRNAs以来,对这些基因的mrna。另一方面,浓缩目标基因的特定功能并不总是发现使用当前生物信息学预测工具(73年];因此,潜在的组织打miRNA-based屏幕直接进入功能网络是尚未得到证实。一个信使rna的事实可以被不同的microrna [74年)也意味着细胞表型产生协同效应,使解释。有基础设施大规模试验,复杂和以前不曾预料到的监管模式可能会被识别。

与大量的mrna,必须拆装的全面功能基因组方法使用siRNAs / shrna, microrna的数量必须分析全基因组屏幕相对较低。迄今为止,1424 microrna在人类基因组中已确定(miRBase数据库,发布17;http://www.mirbase.org/)。各种各样的在网上预测microrna的目标开发的方法,估计在10%和60%之间的信使rna可能受到microrna [3,4,75年,76年]。因此,相对少量的microrna的分析,原则上,相当一部分的人类基因的功能。调节相同数量的基因的表达由核/成分需要大约44000到66000小干扰rna /成分不同,考虑到需要多个试剂针对相同的信使rna(见上图)。

5。工具来调节microrna的函数

这里,我们将简要描述方法,目前正在使用调节microrna的函数并讨论他们的潜力和局限性(表1)。基本上,它是可能的干扰microrna的表达(丧失化验)或诱发异位(-)microrna的表达(功能)。

一种可能性进行分析的microrna的将是一个完整的淘汰赛。这非常精确的干预会导致功能完全丧失。由此产生的表型,因此,往往比那些混战后看到。一段时间,一代的淘汰赛表型在哺乳动物只有利用是可行的同源重组技术在老鼠身上77年]。最近,带有主管胚胎干细胞也成立于老鼠,所以同源重组现在可以执行在这个物种(78年]。基因组编辑方法的发展,用工程锌指核酸酶开放的可能性,这样的分析扩展到其他生物和组织培养细胞(79年]。然而,基因淘汰赛是费力,如果给承包商的工作,贵。许多microrna位于内含子的蛋白质编码的基因;淘汰赛的microrna的同时会导致“主机”蛋白质编码基因的失活与潜在的不利影响,microrna的行动无关。最后,正如下面所讨论的,通常需要下调几个microrna的功能结合在一起,通过淘汰赛不可行。干扰不合成多个microrna从单个多顺反子基因更容易实现使用最低的方法。

microrna可以由应用程序的可拆卸的反义寡核苷酸(ASOs)。通常,ASOs施加的影响独立于细胞沉默机械:潜在的生物化验了早在1978年(80年]。从那时起,很多经验已经获得了稳定的设计,具体的,强有力的反义试剂用于研究和治疗使用。因为修改的寡核苷酸很快被核酸酶降解接种细胞时,化学改性增强稳定性和力量是必要的。(用于反义化学改性方法,综述[81年]。)失活的互补的RNA可以实现,例如,通过提供DNA寡核苷酸。RNA / DNA杂交然后认可并由核糖核酸酶裂解H (82年]。另外,寡核苷酸可以耦合到核糖酶或灭活绑定RNA的DNAzymes乳沟81年]。microrna的失活,RNA-based寡核苷酸,携带酶活性没有得到普及。尚不清楚这些寡核苷酸诱导降解有针对性的microrna的(83年)或通过形成稳定的麻生太郎/ microrna heteroduplexes,从而阻止microrna的函数(84年,85年]。

ASOs和核酶,干扰microrna的函数通常被称为antagomiRs antagomiRzymes,分别从商业来源获得。此外,质粒,virus-derived向量存在允许同时和永久antogomiRs瞄准不同的microrna的表达并允许测量coexpression荧光记者蛋白质的表达水平(86年]。

原则上,microrna的功能可以在不同阶段(抑制87年]。例如,ASOs被用来干扰pri-miRNA的成熟88年]。目标pri-miRNAs退化核的核糖核酸酶H-based ASOs也试过(87年]。战略目标pri-miRNAs的优势结合抑制几microrna转录从同一基因位点多顺反子。实验siRNAs针对循环的pre-miRNA地区已报告(89年),但并没有获得多少声望的方法:循环区域可能很难获得,导致低效率的可拆卸的microrna的(87年]。

关于蛋白质编码mrna的混战,siRNA比ASOs如今更广泛使用,可能是因为siRNAs提供一个更强大的和有效的干预模式。然而,在一些模式生物,比如斑马鱼一定阶级的ASOs,称为“吗啉代”,仍然是不可或缺的混战的基因表达和到目前为止无法取代siRNA-based方法(90年]。

最近,向量构造设计,包含多个结合位点,microrna为了与内生mrna microrna的绑定。这样的microrna的海绵microrna的研究似乎是一个多功能的工具(91年]。洛亚和他的同事们分析了表型miR-7时,miR-8, miR-9a果蝇被抑制的microrna的海绵。作者发现microrna的海绵诱发同源重组产生的表型相同,但在一个温和的形式。这是预期:microrna的海绵目标microrna并不能完全隔离,因为竞争绑定的microrna mrna。不过,这种方法使不仅同时下调几个microrna microrna的海绵在特定组织的诱导表达,在不同的时间点,允许microrna的时空分析功能。例如,可以分配的已知作用miR-8 microrna的表达在神经肌肉接头形成海绵,肌肉细胞的定向miR-892年]。

作为一种替代或补充,功能丧失的研究中,miRNA-mimics可以用来实现吗新创或增强的microrna的表达(功能)。miRNA-mimics可以作为合成小dsRNA管理序列相同的内生microrna [93年,94年]。小干扰RNA分子,他们像极易进入细胞RNA沉默机制。如果想要稳定的microrna的异位表达,构造手头允许单个或多个microrna的表达,和测量cotranscription microrna的表达水平的荧光记者蛋白质是可能的(例如,95年])。至于其他基于矢量结构,选择合适的催化剂可以使组织——和/或miRNA-mimics可能是有时限的表达式。重要的是,分子模拟不同成熟阶段的内生microrna能过表达和分析。

时空调控的microrna的表达也可以达到通过别构核糖酶,riboswitches(96年]。这些都是模块化结构包含一个适配子域(RNA序列,特别是结合化合物)嵌入在一个核糖酶和融合pri-miRNA模拟。这种构造功能活动在缺乏适当的化学触发。在应用程序触发物质(如茶碱的引用工作)核糖酶的构象变化诱导导致其激活。模块化的RNA的核糖酶会裂开cis,释放pri-miRNA构造和处理(96年]。大量的已知的寡核苷酸适配子和内源性和外源性化学触发这种方法可以开发的有条件的RNA干扰诱导向量构造成一个多才多艺的替代,特别是有毒副作用降低或淘汰赛关注的方法是(97年]。

最后,可以释放特定的mrna miRNA-mediated抑制中的应用目标保护者。在实验中由蔡等人在斑马鱼98年),morpholino-based ASOs使用,从而避免了mir - 430绑定通过阻断seed-matched网站和邻近的核苷酸mrna在两个目标。通过这种方式,作者成功地专门干扰mir - 430 -介导转化镇压。进行这种类型的实验,有必要知道感兴趣的microrna的目标,但目标保护者可以价值目标验证和microrna的特征:信使rna相互作用。

6。miRNA-Based功能屏幕

建立基础设施核/ shRNA屏幕(即。,robotics for large-scale sample preparation, automated data acquisition and analysis, data storage capacities) can easily be applied for high-throughput studies of miRNA function. As for siRNA-based screens, lipid-based transfection is most commonly used to achieve a transient overexpression [99年)或抑制(One hundred.microrna的细胞培养。的屏幕数量完成microrna的稳定条件下超表达(40,45,101年,102年),通过与逆转录病毒载体转导编码特定的microrna基因(40]。另外,本构非编码rna的表达或下调可以得到adenoviral基于矢量系统(69年,103年]。反向转染方法的优势,再加上一个自动液体处理系统,由几组也利用miRNA-based屏幕成功率很高的(104年,105年]。

第一个microrna是描述在1990年代早期(50),但最初积累的数据(有关监管角色不太景气106年- - - - - -108年]。这反过来延迟的可用性试剂调节内源性microrna的活动,所以第一个功能性miRNA-based屏幕(One hundred.)完成几年后比siRNA-based屏幕(109年]。因此,尽管miRNA-based屏幕可以受益很多从经验积累siRNA-based屏幕。

7所示。生物过程分析miRNA-Based屏幕

许多miRNA-based屏幕已经完成在过去5年(表2)。两个主要群体的生物过程到目前为止的研究发现,即(i)细胞生存、增殖、凋亡和(2)基因转录和/或活动的监管。

许多microrna被抑制(let-7 miR-34a, mir - 143, mir - 145, mir - 221, mir - 222) [117年- - - - - -121年]或刺激(miR-21, mir - 133) [122年,123年细胞增殖。此外,最近的研究表明,研究集群mir - 17 - 92可以作为致癌基因(124年- - - - - -127年]随着肿瘤抑制[9,128年),而这些角色可能是细胞类型和/或依赖环境。上下文相关的活动也是miR-24报道:下调miR-24抑制A549细胞的增殖,但增加的增长的海拉细胞One hundred.]。

相当数量的增加microrna调节细胞增殖和细胞凋亡了40,99年,105年)自程等人报道哺乳动物的第一次大规模的屏幕识别microrna参与这些过程(One hundred.]。2007年,Ovcharenko等人进行了屏幕187合成寡核苷酸的调节器TRAIL-induced凋亡通路(104年]。他们发现34的microrna调节caspase-3活动进行测试。最近,一位功能miRNA-based屏幕完成人类大肠癌DLD-1细胞(11]。通过测量细胞的可行性,作者不仅确认函数已知致癌mir - 372和mir - 37340),但还发现小说microrna参与细胞增殖和细胞凋亡。mir - 491是最强的抗增殖microrna,和进一步的实验分析表明,它通过直接下调凋亡Bcl-xL凋亡129年]。microrna调节bcl - 2蛋白的表达的另一个家人,Mcl1, 810年被筛选图书馆人力microrna的能力赋予抵抗癌细胞的abt - 263,一种抑制剂的bcl - 2家族成员(99年]。生存能力的测量人类大肠癌HCT-16暂时细胞转染的microrna的模拟显示19个microrna致敏细胞abt - 263。15这些microrna显示相同的在黑色素瘤CHL1细胞表型。此外,10,12强敏化剂microrna分析针对3′的炒股Mcl1被确认为直接监管者的基因。这些屏幕的例子表明,microrna调节可以识别和潜在的对化疗药物的敏感性,在未来,用于癌症治疗(21,130年]。这种屏幕的可行性大大提高了进化的方法从简单量化细胞增殖细胞计数(One hundred.电阻抗超过96小时(的)记录111年]。

microrna作用于基因转录和/或活动的监管通常发现在所谓的“靶向性筛选”。在大多数情况下,荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的兴趣和检测信号的强度是用来评估测试基因的表达或活动(38,39,45,46,102年]。使用功能基因方法稳定个人microrna的表达(40),mir - 221和mir - 222被证明特别调节肿瘤抑制p27的表达^Kip1(45),miR-192/194 cluster-modulate每个基因的表达家庭(102年]。

细胞过程分析的曲目microrna的功能屏幕迅速扩张(表2)。做miRNA-based屏幕在适当的细胞环境中,例如,对于microrna调节类固醇生成在卵巢癌细胞(112年),microrna调节脂滴形成肝细胞(105年)有助于确保收购生理相关信息。

8。功能和功能丧失miRNA-Based屏幕

虽然功能和功能丧失microrna的实验试剂可用于类似的区段,几乎所有的报道屏幕功能评估microrna的功能利用的方法(表2)。这一趋势可能是因为的microrna的异位表达可以证实。例如,外生报告基因检测(116年,131年)、存在和Northern和核糖核酸酶保护试验(40)很容易适用的方法来测量microrna的表达。相比之下,已广泛应用到目前为止唯一的化验显示抑制内源性microrna的活动涉及到的记者(38,One hundred.,128年,132年]。功能的普及的屏幕可能另外解释可能更容易评估。microrna的表达可能诱发加重了表型,这可能与内源性microrna的水平,而获得的评价数据的条件下,microrna的下调可能只有人知道内生microrna的表达水平测试系统。收购这些数据集,因此,需要全面的额外的实验。

9。荧光检测显微镜miRNA-Based屏幕

几乎没有原因的读出策略miRNA-based屏幕应该不同于那些成立于siRNA-based屏幕。尽管如此,我们认为荧光显微镜屏幕是非常有利的。理想特性,使这种显微镜分析microrna的监管可能包括以下几点:(i)快速的收集大量的数据,(2)表型多路复用的可行性,(3)可能在细胞的基础上获得定量数据和/或以人群为基础的基础,及(iv)检测微妙的表型(133年,134年]。第一个研究这项技术申请功能microrna的研究是Sirotkin和他的同事们,报告一个免疫细胞化学和fluorescence-microscopy-based屏幕识别microrna调节增殖和凋亡113年]。主要人类卵巢癌细胞与合成microrna的前兆,转染和PCNA和细胞周期蛋白B1蛋白质被用作标记的增殖。伯灵顿和caspase-3的表达水平,结合TUNEL检测,用于确定细胞凋亡的程度。科技的力量是证明了另一个microscopy-based屏幕:使用自动图像分析和核分类软件,一种新颖的抗增殖活动发现mir - 320 a (116年]。屏幕识别microrna控制肝细胞脂滴的形成(105年]说明荧光microscopy-based方法的敏感性,这是比较费劲的生化assay-11 327是暂时性的过表达人类microrna选择通过一个自动化的工作流程作为细胞内脂质含量的最有力的监管机构105年]。

10。验证在miRNA-Based屏幕

在当前屏幕,主要的列表点击参与调控生物途径可以获得相当快,如果必要的基础设施的地方。主核/黑名单shRNA-based屏幕通常由(i)重复验证试验与不同类型的试剂,和(2)二次化验,和(3)救援的实验中,某一基因的表型由可拆卸的产品是被构建的表达无法救出被核攻击(由于突变或因为另一物种的起源)。目前,没有明确的标准协议成功的验证主要microrna,除了繁殖的表型不同的试剂。此外,microrna的表达和下调可能造成的影响进行比较。因为这可以费力,列出了导致一个特定的microrna表型在屏幕可能有用的发表没有进一步分析(One hundred.,112年,113年),允许后续由他人。

为了执行一个microrna,后续研究需要做预测的目标基因。许多计算算法开发了过去十年来预测microrna的目标(135年,多个算法是常用的组合来缩小候选人范围。有趣TRAIL-induced细胞凋亡的研究中使用的策略是当点击miRNA-based屏幕相比siRNA-based屏幕,以确定合理的microrna和目标之间的相互作用mrna (104年]。

的许多屏幕已经完成到目前为止一直延伸到实验识别和验证的目标达到microrna(表3)。使用最广泛的方法来测试直接调控基因表达的microrna是基于记者化验。3′UTR、5′UTR或整个下游基因克隆立即报告基因编码荧光素酶或荧光蛋白。构建然后瞬变cotransfected microrna的模仿或antimiRs到宿主细胞和荧光素酶活动或荧光测量后24 - 48小时孵化的10,11,38,99年,110年]。额外的证据表明目标基因直接由一个microrna的可以提供的变异(38,110年)或删除(10,101年]预测microrna的结合位点的3′UTR记者向量。为控制,整个3′UTR可以插入在相反的方向136年)或截断(110年]。频繁,存在被用来显示目标mrna在退化microrna overexpressing细胞(10,45,46,101年]。

自microrna可以执行他们的监管行动抑制翻译和/或促进靶基因的mRNA衰变(137年),测量产品的蛋白质含量是一个额外的验证microrna的行动11,45,46]。生化技术目标mrna的隔离也被证明是有益的(138年- - - - - -140年]。最终,microrna的作用可以通过下调测试已知或假定的目标基因和监测产生的表型(72年,105年]。观察相同的表型microrna的表达和下调后的假定的目标基因增强目标识别是有效的证据。这种测试可能包括下调一个目标以及多个的。复杂的评估是可能的如果结合多个验证方法。例如,目标蛋白质水平的变化没有任何记者的变化分析表明,microrna的不直接受影响目标基因而是调节其调制器或整个通路(99年]。

11。核的挑战、成分,miRNA-Based屏幕

RNAi-based屏幕已经非常有用的生物学和医学各领域研究[59,141年- - - - - -143年]。一个健壮的化验,精心设计的实验,可靠的控制,和详尽的测试成功完成试剂是至关重要的一个屏幕上,和一些优秀的评论,描述RNAi屏幕实验的计划,已发表(例如,60,144年- - - - - -146年])。现在我们将关注一些实用方面的核/ shRNA-based屏幕可以在执行有关miRNA-based屏幕。

分析siRNA-based屏幕通常是复杂的非目标效应(选票):造成表型未指明的mrna的下调。选票的一个来源是部分同源性的siRNAs意想不到的mrna。不同类型的投票来自诱导细胞因子生产核/成分与某些序列(147年),最终导致细胞凋亡。因此,在过去年相当大的努力一直在改善投资siRNAs /成分的性能。例如,诱导干扰素反应可以减轻小干扰rna分子(不包括GU-rich序列在148年]。可以大大增强特异性改变的化学骨干siRNAs:例子是放大器(锁核酸)核苷酸类似物或修改ribosyl组添加2′-O-methyl集团在特定位置(149年,150年]。

二级甚至毒性作用引起的转染试剂单独和/或结合沉默RNA不能完全排除。幸运的是,目前的配方含有5 - 10倍不如几年前被要求试剂。另一种方法是池几个siRNAs攻击同一个目标,在使用数量的减少。这种方法背后的理念是,将攻击目标mRNA,或多数,siRNAs池中,和特定的下调将累计,而选票的个人siRNAs太弱,无法影响的结果。改善信噪比的相同的概念也在观察表型形式的基础应用esiRNAs [65年]。

不过,尽管有这些策略,选票和未指明的继发效应不能完全避免。因此,必要的控制。一种选择是使用几种不同siRNAs目标相同的mRNA在独立网站。的概率一个观察表型对应于一个目标消声效果增加的数量siRNAs引起相同的表型(151年]。此外,利用测量的几个细胞参数(例如,细胞的形状和大小,数量的细胞)在一个屏幕上。Multiparametric分析允许代个人siRNAs表型资料。高度重叠在这些概要文件证明强特异性的信心观察表型(58,151年]。

功能屏幕最严重的问题之一是可能的过饱和外源性细胞沉默机械的siRNA /成分和microrna的模仿。这可能导致脱抑制受内源性microrna的mrna (152年,153年]。各种策略也已经被开发出来,以解决这些问题(详细的编译策略[154年])。短暂,重载细胞RNA沉默机制可以避免采用尽可能低的核/成分的细胞。例如,转录的RNA波尔II-driven催化剂,并使用诱导的结构,可以有效控制水平的vector-encoded shrna [70年,155年]。使用向量来源于腺相关病毒也可以诱导一个适度稳定的shRNA表达在细胞21,156年]。Coexpression AGO-2也被描述为一种有效的方法来克服问题的饱和异位siRNA RNAi机械,成分,microrna [157年]。增强的AGO-2被证明驱动RNAi干扰对优惠最低的完美匹配的目标mrna在不同哺乳动物细胞系。因为,此外,少核/成分需要特定的可拆卸的,和不具体的目标的mrna在异位AGO-2的存在显著降低,作者建议,这种策略可能导致减少假阴性和假阳性的比率在RNAi-based筛查方法。另一方面,应该严格测试方法的适用性,为AGO-2最近被证明在生源论中发挥作用的特定类型的microrna [36,37]。

最后,miRNA-based功能屏幕可能遭受中性镇压,转录水平降低时不会导致细胞可衡量的变化行为。有时,残余蛋白仍足以实现所需的功能;另外,反馈机制存在补偿功能的降低(158年]。

通常情况下,屏幕包含成千上万的基因,甚至整个基因组;这是几乎不可能的寻找可能赋予的功能冗余基因功能。通常,细胞功能并不是由一个蛋白质,而是由两个或两个以上的同形像或evolutionary-related形式的蛋白质,以确保流程的运行可靠性高、和代谢途径可能是多余的。需要使用几个siRNAs /蛋白质,和多个可能的组合不同的siRNAs,限制了研究的目标识别冗余基因产物相对较小,直接屏幕。相反,高度同源的基因产物,例如,拼接变异,可能有不同的细胞功能,但siRNAs可能目标一起形式(例如,159年])。类似的担忧与miRNA-based屏幕,作为冗余活动microrna在许多生物过程的监管是有据可查的160年]:Miska等人报道,大多数microrna秀丽隐杆线虫是单独可有可无的161年],Voorhoeve等人发现mir - 372和mir - 373与致癌RAS合作发展的睾丸生殖细胞肿瘤(40]。处理microrna的冗余方式可以使用敏化遗传背景描述Brenner et al。162年]。通过删除两年前基因之一秀丽隐杆线虫作者部分残疾人RNA沉默机制。此外,蠕虫与染色质修饰缺陷或转录监管生成。使用这些生物允许定义生物角色好几个人microrna [162年]。此外,合成microrna表型可以用来分析功能(160年]。

microrna的行动的复杂性为高通量功能分析提供了一个具有挑战性的任务。然而,鉴于我们的经验从RNAi屏幕上在过去的十年里,siRNAs和成分在不同的生物模型,仔细的实验设计和详尽的目标验证这种强大的技术不可缺少的对于理解生物microrna的角色。

确认

作者感谢教授克里斯汀·克莱顿ZMBH,海德堡的评论和仔细阅读手稿。诉Starkuviene和c支持Claas BMBF FORSYS ViroQuant (# 0313923), BMBF SysTec(0315523),和Stiftung巴登符腾堡(P-LS-Meth / 11)。答:支持美国赛瓦LGFG海德堡大学的奖学金的研究生学院和肌注。答:美国赛瓦和c Claas贡献同样这项工作。

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