的转录调节系统酿酒酵母OLE1基因受脂肪酸种类和细胞内数量的影响，而不是简单的膜状态

抽象

我们检查了不饱和脂肪酸的（UFA）物种及其对的表达浓度的影响OLE1,其中编码硬脂酰CoA去饱和酶酿酒酵母.我们通过改变培养基中吉特醇的浓度来控制细胞对UFA的吸收。在0.1%的吉特醇中加入1mm脂肪酸后，细胞比在1%的吉特醇中加入相同浓度的脂肪酸时吸收更多的脂肪酸，尽管加入量取决于UFA的种类。对于每一种脂肪酸测试，我们发现较高的摄取(0.1%的特吉托条件)有更强的影响OLE1监管。一个主要的产物是去饱和酶16:1∆9，和非本地的UFA 18:2∆9,12，最强烈的压制了报告者构造OLE1-lacZ转录，而另一个主要的产物，18:1∆9，和非本地的UFA 17:1∆10造成了更小的反应。基于这些结果，我们最初的假设是OLE1响应于膜的流动性被调节;然而，随后的工作不支持这个想法;我们已经发现，用饱和影响膜的流动性的条件，例如生长温度和生长或反式脂肪酸补充，不规范OLE1在通过流动性的变化的预测的方向。我们的结论是至少一个信号调节OLE1转录表达很可能是基于脂肪酸本身。

1.简介

在酵母酿酒酵母，存在由编码单脂肪酸去饱和酶OLE1基因[1，2]。的硬脂酰辅酶A去饱和酶，其功能是作为同型二聚体[3]，引入了一个独联体碳9和碳的酰基链的10之间的双键。其主要产品在活的有机体内是棕榈油酸（16：1Δ9）（X：yΔn，脂肪酸含有x个碳原子和y顺位于位置n从羧基端双键; UFA，不饱和脂肪酸）和油酸（18：1Δ9）[4]。有越来越多的证据，所述硬脂酰辅酶A去饱和酶的异常表达也参与了疾病;在哺乳动物中，抗癌基因ORCTL3被鉴定，可以在某些转化的细胞凋亡引起[五]。后来的研究确定ORTLC3的目标作为硬脂酰辅酶A脱氢酶[6]。而在酵母中，硬脂酰辅酶A脱氢酶的过度表达导致侵袭性生长[7]。最近的调查发现了一个作用ARV1在脂肪性肝病[8]。酵母arv1突变体是有缺陷的OLE1这意味着脂肪肝和去饱和酶表达之间可能存在联系。最近，Vincent等人已经证明了去饱和酶作为药物靶点治疗神经退行性疾病如帕金森病的潜力[9]。

OLE1表达在转录水平调控，RNA稳定性和蛋白质的活性（在[审查10，11]并且已知通过各种生长条件，包括外源的不饱和脂肪酸[来调节12-14]，钴和碳源[15]，乙醇浓度[16，17和氧气[18]。虽然研究了培养温度等环境条件，但这些研究通常发现，表达的短暂变化对脂肪酸组成有轻微的长期影响[19，20.]。这些监管体系的最佳表征的正调控OLE1当细胞在不存在的去饱和酶的产品中生长：含有碳9和碳10的先前工作之间的双键UFAS已确定的转录OLE1基因被控制，至少部分地通过同源转录因子，由基因编码的MGA2和SPT23[21]。当有丰富UFAS，所述Mga2p和Spt23p转录因子拴如内质网膜不活动P120形式。但是，当被UFAS限制性的，这两种蛋白质被蛋白水解从羧基其尾巴裂解，和可溶性P90 N-末端易位至细胞核，在那里它们可激活的转录OLE1基因[21]。

Mga2p和Spt23p加工成它们的活性形式P90通过内质网中的蛋白酶体的受控，泛素调节的蛋白质水解发生。一个复杂的Cdc48p-Npl4p-Ufd1p需要这种激活Mga2p和Spt23p [的蛋白质的22-24]。除此之外UBX2编码的蛋白质已被证明是重要的调控OLE1响应于外源脂肪酸，作为配合物与泛素连接酶复合物和Mga2p和Spt23p [相关联的膜的胞质Cdc48p-Npl1p-Ufd1p之间桥接因子25，26]。除了它的调节作用OLE1， Mga2p与至少一种其他基因的调控有关，ERG1，这是参与甾醇生物合成[27]。通过Covino等有趣的工作。已经表明，当Mga2p形成同型二聚体，所述跨膜螺旋的方向可基于所述脂质环境。替代构象差异稳定，这取决于蛋白质是否在18无论贫富的膜发现：2Δ9,12。这些可替换的构象导致不同Mga2p的能力被加工成活性形式P90，因此允许Mga2p充当脂质传感器[28]。

然而，不明飞行物在结构上是多种多样的;根据链长、酰基链中双键的存在与否、双键的数目和位置以及键是否存在而变化独联体要么反式组态。我们调查了一些这些区别是否导致了不同的监管制度，以控制OLE1表达式。在这项工作中，我们看一下浓度和对控制去饱和酶表达4个UFAS UFA结构的效果：和油酸（18：1Δ9）：去饱和酶，棕榈油酸（1Δ916）的真实产品，并2个非天然产品亚油酸（18：2Δ9,12），一个多不饱和脂肪酸具有两个双键的，碳原子9-10和12-13，和脂肪酸之间独联体-10-十七碳烯酸（17：1Δ10），奇数链长度的单不饱和脂肪酸，其不包含9-10键，但一个10-11键。这些脂肪酸都经过精心挑选，使我们能够检查各种结构和物理特性如何影响监管。乌发18：2Δ9,12共享相同的链长度与去饱和酶的真实产品之一，具有在共同的Δ9-10双键两者的产品，和一个类似的解链温度如棕榈油酸。然而，如18：2Δ9,12是多不饱和脂肪酸，这是相当不同的结构上。乌发17：1Δ10不具有Δ9-10，但它的双键是从甲基端16相同的距离：1Δ9的键。这个外来UFA具有类似的熔化温度为18：1Δ9。此外，我们研究的条件能够改变细胞膜的流动性，从而找出一致的分子反应。

2.方法

2.1。菌株，媒体和生长条件

酵母菌株W303-1A（马塔，trp1-1，his3-11,15，ade2-1，leu2-3,112，ura3-1）在本研究中使用。酵母生长和媒体标准方法如所描述的[29]。YNBt介质是标准的合成完全培养基（0.67％酵母氮​​基，2％葡萄糖）含0.1％或1％的TERGITOL NP-40（Sigma）的如所指出的，补充有合适氨基酸，尿嘧啶和腺嘌呤。Fatty acids were prepared as stock solutions at 50 or 100 mM concentration in ethanol and supplemented to YNBt media as noted. YNBt media without fatty acids contained 1% ethanol.

酵母转化都通过乙酸锂方法进行[30.使用来自Takara Bio公司的试剂。对于质粒的常规繁殖，大肠杆菌NEB5阿尔法（New England Biolabs公司）被使用，在补充有氨苄青霉素的LB培养基。用于克隆，细菌生长和选择标准的方法来进行[31]。质粒P62已放置lacZ在1015-bp的控制下的HindIII / SalI位的片段OLE1基因，从基地-934相对于起始密码子开始，并包括去饱和酶的第一密码子27放置在框架与lacZ[32]。

2.2。脂肪酸分析

To analyze total fatty acids, cells were cultured at 30°C in 200 ml YNBt overnight to a maximum density of 1–2 × 10⁷细胞/ ml。脂肪酸在乙醇（或单独用于控制乙醇）加入到培养物中并继续孵育四小时。细胞通过离心收获，用无菌水洗涤，和脂质，用改进的Bligh-Dyer的方法皂化，转化成甲基酯[33脂肪酸甲酯样品用30 m HP-5柱在惠普6890型气相色谱仪上进行气相色谱分析。仪器情况如下所述[34]。蜂窝脂肪酸种类的识别是通过对这些的真实脂肪酸标准（Sigma公司）的保留时间比较制备。

2.3。苷酶化验

含有酵母质粒p62的酵母在含有1%或0.1%特吉托的YNBt培养基中培养过夜。将培养物接种到新鲜培养基中，加入1%乙醇(作为对照)或标记为UFA，并在30°C下孵育4小时，然后进行检测。细胞经离心和ββ-半乳糖苷酶活性用透化细胞的方法[测定29]。使用等式（测定酶的活性1）。

对每个构建进行至少5次重复的检测。活性归一化为乙醇对照组(设置为100%)。

2.4。脂肪酸熔点测定

99%的纯独联体-10-heptadecenoic acid (Sigma) was loaded into three separate capillary tubes, melted, and centrifuged at about 2000 rpm for two minutes. The samples were then allowed to solidify. Using a Barnstead International model 1001D Mel-Temp melting point apparatus, a preliminary “fast” reading was taken (increase of 5–10°C/min) to determine the general range of the melting point of the sample. The instrument was then cooled to 10°C below estimated melting point, and a second sample was read at a slow rate (increase of 1°C/min). The slow rate read was repeated. As a control, the melting temperature range of 99% pure独联体-9十八碳烯酸是通过该相同的方法测定，结果为13.0-13.4℃，其匹配的13.4℃时的值公布以及[35]。

3.结果

3.1。外源性UFAS的相对细胞内浓度可以通过的Tergitol在中等量来控制

在涉及的脂肪酸的酵母细胞馈送许多实验，用洗涤剂性能，如吐温或TERGITOL的化合物，被添加到生长培养基中，以帮助保持脂肪酸溶解和提供给细胞。我们假设，提供的脂肪酸的有效浓度的酸可用的细胞可以通过洗涤剂的在介质中的量来控制。We tested the effect of the amount of tergitol in the growth medium (at 0.1% and 1%) on the relative incorporation of a fed fatty acid, which was maintained at a concentration of 1 mM. As seen in Figures图1（a）和图1（b）在美国，脂肪酸的相对摄入量取决于特定的物种。但在每一种情况下，在0.1%的生长条件下比1%的生长条件下，细胞中发现了更多的美联储脂肪酸(图)图1（c））。

通过检查脂肪酸谱，我们确定的是，当细胞被不补充UFA，去饱和酶是活性，从而导致相当大的比例的总脂肪酸是不饱和的;16：表示1Δ9总脂肪酸约45％，和18：1Δ9约30％。当提供16：1Δ9或18：1Δ9，在其它的为代价所供给的脂肪酸增加。例如，当进料16：1Δ9，我们可以清楚地看到，18的量：1Δ9所生产的去饱和酶有较大幅度下降（图图1（a）和图1（b））。当我们在16的情况下比较的1％和0.1％的TERGITOL条件：1Δ9馈送，我们观察到16：1Δ9是在0.1％的TERGITOL条件总脂肪酸的健壮85％，而大约55％的总脂肪酸为16：在1％的TERGITOL培养条件1Δ9。二者增加基本处于18为代价：1Δ9，其从总脂肪酸约30％不喂食物的情况降低到约19％，在1％的TERGITOL条件和至2％，在0.1％的TERGITOL条件。由于不可能天然之间在这些条件下进行区分，内源性产生的16：1Δ9并送入16：进料16时1Δ9：1Δ9，它在形式上是可能的是，去饱和酶仍在积极生产161Δ9.然而，生产18的损失：1Δ9表明，最有可能去饱和酶本身并不活跃。这种无法区分从外源性的内源性不处于所述非天然脂肪酸的进料的问题酸17：1Δ10和18：2Δ9,12。当这些脂肪酸被馈送，我们看到在两个16伴随减小：和181Δ9：1Δ9，明确表明去饱和酶不是因为这些进料条件下有活性。有趣的是，我们观察到18：2Δ9,12以较高的电平超过17并入：1Δ10二者的培养条件下;约21％的18：2Δ9,12与9％17：在1％TERGITOL条件1Δ10，和69％18：2Δ9与35％17：1Δ10在0.1％的TERGITOL。

3.2。表达的调控OLE1启动子是在脂肪酸种类和浓度相关

为了量化对生长在补充UFA介质中的效果OLE1转录调控，我们检查了的报告构建了补充的作用OLE1启动子控制的表达lacZ.生长在含有16培养基：1Δ9或18：2Δ9,12导致的活性急剧下降β半乳糖苷酶相比，未补充的条件为，虽然有活性的18的中间电平：1Δ9和17：1Δ10补充条件（图2）。

当我们在0.1%的特吉托条件下和1%的特吉托条件下检测更高的UFA有效浓度的影响时，我们通常观察到，增加UFA的浓度会增加其对OLE1启动子活动。然而，18:1∆9没有遵循这一趋势，尽管细胞内数量不同，表达量却有相似的下降。

3.3。条件能够改变细胞膜流动性有意想不到的效果OLE1表达

根据目前的证据，我们假设调节的传感器OLE1正在响应膜流动性的信号。这是一致的想法，与更低的熔化温度供给的UFA时，这将导致增加的膜流动性，建立一个需要减少的表达OLE1.为了验证这一假设，我们考察了其他条件对流动性的影响OLE1表达;生长温度和饱和的存在或反式脂肪酸。

使用OLE1-lacZ报道构建体，野生型细胞中注意到条件生长4小时，之后β-半乳糖苷酶活性测定。如图所示3(一个)的影响，生长在饱和或反式检验∆9 UFAs对OLE1表达，并且在图3 (b)，检查温度的影响OLE1表达式。人们会预测，刚性化的条件下，去饱和酶的表达会被诱导，并在流化的条件下，表达会被抑制。然而，刚性化的增长情况饱和脂肪酸为报道活动没有显著变化，而生长在反式乌发显著下降OLE1约50％的表达（图3(一个)）。事实上，在较低温度（24℃）生长实际上导致约50％的降低在OLE1转录活性相对于标准30℃生长的温度条件为（图3 (b)），同时出现了在30°C和34°C标准生长温度之间的报告基因活性没有显著差异（Tukey的范围测试， ）。

表1提供的测试的脂肪酸物理/结构特性并总结它们的调节能力的不同的脂肪酸的影响OLE1转录活性测定报告试验。

4。讨论

从饮食进入细胞的摄取和使用的脂肪酸是关键的一步，所必需的能量使用和储存，并作为复合脂质的形成前体。然而，由于有在脂肪酸结构广泛的多样性，这可能导致在某些脂肪酸是理想的，为特定的生长或环境条件下使用的一些是不太理想。虽然其他研究探讨了在调控的外源性脂肪酸的作用OLE1我们还通过改变TERGITOL的量而变化的有效量UFA提供给细胞。这使我们能够审视细胞内浓度的效果以及对调控的结构性差异。我们发现，细胞供给16：1Δ9或18：2Δ9,12导致去饱和酶的表达的最强调节。虽然它可以不令人惊讶的是供给去饱和酶，的产物16：1Δ9，或者甚至是一个脂肪酸是有点类似的单不饱和产物18：1Δ9，如18：2Δ9,12导致在去饱和酶的下调，这是出乎意料的是进料18时：1Δ9，去饱和酶的真品，我们观察到调节的中间电平。的17的存在：1Δ10导致类似的，回火响应如18：1Δ9。总之，这些结果让我们对问题“什么是表达下调的实际信号OLE1？”。

调控OLE1并不是简单的由18:2∆9,12的强烈压制所证明的去自然酶的产物，或者仅仅是一个∆9的双键的存在，因为18:1∆9就会造成与16:1∆9或18:2∆9,12相同程度的影响。当我们检查这些被测脂肪酸的物理性质时(表)1），它们在质量，双键的数量和位置不同，但是，没有这些特性似乎被关联到在调控的差异。我们排除了该传感器从甲基端测量，因为双键在两个17的可能性：1Δ10和16：1Δ9是从甲基端相同的距离（7个碳原子）。然而，存在熔融温度和调节的程度之间的相关性（表1）。

Covino等人的出色研究发现，部分信号传导是通过Mga2p通过形成不同的跨膜螺旋结构域相互作用来感知脂质环境的能力发生的[28]。这些不同域相互作用从而影响Mga2p的易感性被处理成P90活性形式。鉴于这一发现，我们的结果描述到目前为止，我们然后假设负责确定所述去饱和酶的表达的需要被实际监测相对于存在或不存在特定分子的膜环境条件的调节系统;换言之，膜的物理状态可以是对的转录调控重要OLE1基因。然而，当我们检验我们所预测的具有硬化效应的条件，即较低的生长温度，或饱和或饱和生长的影响时反式脂肪酸，我们并没有看到预期增加OLE1基因的表达。此外，在升高的温度下生长，也应增加细胞膜的流动性的状态下，不降低OLE1基因的表达。虽然这些培养条件，可能对一些可能影响细胞等功效OLE1表达，如改变生长速率，它们是在它们的缺乏支持的膜流动性传感器的一致单独控制OLE1.虽然膜的状态似乎是至关重要的，并取决于许多因素，包括UFA的含量，但我们的数据表明，它不能仅仅是膜的流动性，因为影响流动性的条件并没有完全影响调节。这些结果表明，至少有一部分传感系统不只是检测膜的物理状态，而且可能更具体地响应不饱和脂肪酸分子的特征。需要进一步的工作来确定传感系统的性质。

数据可用性

支持本研究结果的色谱数据可根据要求从通信作者处获得。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢J. Stukey博士有益的讨论，并指导和使用GC化学的霍普学院系贾森·吉尔摩博士。研报本出版物中由美国国立卫生研究院的医学科学奖下数R15GM132853研究所的支持。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。这项工作也得到了美国国家科学基金会[授权号REU DBI-0754293]，并通过希望学院雅各E. Nyenhuis教师发展基金的支持。

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