CD8+ T细胞相关基因的鉴定:与肝癌免疫表型和预后的相关性

摘要

意图．晚期肝癌的治疗结果很差。免疫疗法是一种广泛用于治疗其他癌症的治疗策略。研究表明，CD8+ T淋巴细胞是影响免疫治疗疗效的重要因素。我们使用计算生物学方法确定促进CD8+ T淋巴细胞浸润的共表达基因网络。方法．我们获得了TCGA肝肝癌FPKM的肝癌基因基质和临床随访资料。我们获得了单核苷酸多态性(SNP)数据来评估肿瘤突变负担。使用“estimate”软件包和CIBERSORT算法评估肝癌队列中肿瘤纯度和CD8+ T淋巴细胞的比例。我们以肝癌基因表达矩阵和CD8+ T淋巴细胞相对比例作为输入文件，在此基础上进行WGCNA分析。加权共表达网络鉴定出肝癌中CD8+ T淋巴细胞相关共表达模块最多。然后，我们分析了模块中涉及的生物过程。我们从数据和功能上确定了与CD8+ T淋巴细胞浸润共表达模块。然后筛选出与CD8+ T淋巴细胞含量大于0.4的共表达模块相关的因子。最后，通过免疫组化和单细胞测序在蛋白水平上验证这些因子的表达水平。结果．我们确定了与共表达网络相关的CD8+ T淋巴细胞比例。4个共表达基因(C1QC、CD3D、GZMA和PSMB9)被鉴定为促进CD8+ T细胞浸润的CD8+ T细胞共表达基因。由于共表达网络中的因子往往参与相似的生物学过程，我们发现这些因子与抗原加工和多肽抗原通过功能富集提呈关系最为密切。在临床表型分析中，我们发现18个因素可以作为独立的预后保护因素。我们在免疫表型分析中发现这些因素与肿瘤纯度呈显著负相关，与M2巨噬细胞呈显著负相关。通过免疫组化和单细胞测序分析，我们发现肿瘤组织中CD3D抗体染色较正常组织弱，且与CD8+ T细胞相关。结论．这些共置于抗原呈现过程中CD8 + T淋巴细胞的高渗透比例呈正相关。生物过程可能为对免疫治疗不敏感的患者提供新的方向。

1.介绍

近年来，免疫检查点抑制剂的应用取得了突破性进展[1，开创了治疗晚期肿瘤的新时代。免疫疗法的出现为肝癌的治疗提供了多种选择;这些方法包括免疫检查点抑制剂、过继细胞转移、肿瘤疫苗和细胞因子治疗。免疫检查点抑制剂通过逆转T细胞功能衰竭，恢复免疫识别和免疫攻击，增强抗肿瘤免疫应答。免疫检查点抑制剂的靶点包括程序性死亡配体1 (PD-L1)及其受体PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4。PD-1是CD28家族的成员，在大多数免疫细胞表面表达，主要是在CD8+ T细胞上表达[2］．它结合PD-L1和PD-L2引起抑制信号传递给T细胞并诱导耐受[3.].PD-L1在各种肿瘤中异常表达，包括肝癌；肿瘤细胞通过异常表达PD-L1或PD-L2实现免疫逃逸[4].Nivolumab（PD-1单克隆抗体）[5]、pembrolizumab (PD-1单克隆抗体)和atezolizumab (PD-L1单克隆抗体)已被用于治疗晚期肝癌。虽然免疫疗法已经取得了令人满意的结果，并被批准作为肝癌的治疗选择，但PD-1/PD-L1抗体单独的客观应答率很少超过40%。尼鲁单抗和派姆单抗治疗肝癌的客观有效率不显著[6］．目前据信，免疫疗法低目标反应率的主要原因是耐药性的出现[7］．免疫疗法的耐药性是一种复杂的和多层机制相互依赖的动态过程，通过肿瘤的免疫浸润受损，T细胞耗尽或免疫抑制细胞的募集来解释。

研究表明，肿瘤组织中PD-1低表达和CD8+ T淋巴细胞浸润低可导致这种不敏感[8］．根据一项非小细胞肺癌的meta分析结果，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量的增加与较好的总生存率相关[9］．在用Pembrolizumab处理的先进黑素瘤的患者中，患者的侵袭性缘和患者组织标本中CD8 + T细胞的密度高于非反应者[10.］．

因此，本文旨在鉴定与肿瘤微环境中CD8 + T淋巴细胞的含量相关的共表达模块和功能，并定义与CD8 + T细胞含量相关的共表达网络，为提高免疫疗法的功效提供依据。

2.方法

2．1．数据收集和预处理

从癌症基因组图谱下载来自LIHC样本的TCGA表达矩阵数据(http://cancergenome.nih.gov/)在377例肝细胞癌患者中测量了19530 mRNA的肿瘤转录组谱，并将其纳入后续分析。肝细胞癌单细胞小鼠测序队列GSE129516[11.]也从GEO数据库下载，该数据库的平台是GPL24247。

2．2.CD8+ T细胞比例评估

为了获得每个肝肝细胞癌样本中CD8+ T淋巴细胞的相对比例，我们使用CIBERSORT [12.)方法。CIBERSORT评估了每个样本中22个肿瘤浸润免疫细胞的比例。的样品 已被纳入WGCNA。

2．3.肿瘤微环境评分与肿瘤突变负担(TMB)

恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞的估计[13.是一种通过基因表达特征来评估基质细胞和免疫细胞比例的方法[13.］．与肿瘤突变负担进行相关性分析[14.，15.]，我们获得TCGA-LIHC SNP数据，并评估每个样本的肿瘤突变负担。

２.４.加权基因共表达网络分析(WGCNA)

我们使用WGCNA [16.探讨基因表达与CD8+ T淋巴细胞的相关性。首先，我们将TCGA-LIHC的mRNA矩阵与样本中相应的CD8+ T淋巴细胞含量进行匹配，并将其纳入后续的WGCNA中。为了保证网络的非标度，我们构建了无标度拓扑网络[17.，18.]，并将软阈值设为5 ( ， ）最小模块中的基因数量为30。

2．5．基因本体功能分析

基因本体(GO) [19.的分析，以显示基于不同模块的生物过程和分子功能。在本研究中，我们基于clusterProfiler进行GO分析[20.]R3.6.2中的包装。

2.6.Cox风险比例回归模型和亚组评估

采用Cox风险比例回归模型对灰色模块中的因素进行分析。采用正向筛选法确定肝癌CD8+ T淋巴细胞相关预后风险模型。我们使用生存分析和曲线下面积(AUC)来评估雨后预测风险模型的准确性。接下来，我们将TCGA-LIHC队列根据年龄、性别、临床分期、肿瘤纯度等因素分为不同亚组，并评估各亚组中CD8+ T淋巴细胞相关风险模型。

2.7。基因集富集分析

基因设定富集分析（GSEA）[21.]用于计算这些共表达基因的最相关途径。

2.8.免疫组织化学

提取的人体组织用4%甲醛缓冲液固定。脱蜡后的标本被切成4块μ片。组织切片在60℃下孵育2 h后脱蜡;切片在115°C下蒸压3分钟，在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中提取抗原，然后用0.3% H淬灭内源性过氧化物酶活性₂O₂溶液15分钟。将切片与正常山羊血清进行非特异性结合阻断45 min后，与C1QC、GZMA、CD3D、PSMB9特异性一抗(稀释1:20 0)在4℃下孵育过夜。随后，在室温下用山羊抗小鼠二抗处理切片30分钟。用3,3观察蛋白表达 -diaminobenzidine。使用尼康Eclipse 80i显微镜(尼康公司)拍摄图像。

3.结果

流程图如图所示1，这说明了我们分析的逻辑。

3．1.CD8+ T淋巴细胞、肿瘤纯度和肿瘤突变负担的评估

我们测量了每个LIHC样本的CD8+ T淋巴细胞比例、肿瘤纯度、基质评分、免疫评分和肿瘤突变负担。采用的筛选原理 ，我们获得了377例CD8+ T淋巴细胞准确评估的肝癌样本。通过将免疫相关文件与TCGA-LIHC mRNA表达文件整合，我们确定了WGCNA表型输入文件。

3.2.TCGA-LIHC中CD8+T淋巴细胞共表达网络传导

在TCGA肝脏肝细胞癌上进行WGCNA。要构建CD8 + T淋巴细胞共表达网络，我们使用动态混合切割方法来构建分层聚类树（图2(一个)）.树上的每个叶子代表一个基因，每个分支代表一个共表达模块。获得了总共22个表达模块（图2 (b)）.然后计算各个模块与CD8+ T淋巴细胞的相关系数，根据相关系数选择grey60和purple模块(图)2 (c)）.在TCGA-LIHC队列中，grey60模块与CD8+ T淋巴细胞比例的相关性最强( ； ）(图2 (c)）.在TCGA-LIHC队列中，品红模块与CD8+ T淋巴细胞比例相关( ； ）(图2 (c)）.基于这些发现，我们补充了灰60和品红模块中各因子之间的相关性的热图(图)2 (d)- - - - - -2 (g)).灰色60模块显示出与CD8+T细胞的显著相关性( ， ）及肿瘤纯度( ， ）.洋红色模块显示与CD8 + T细胞有显着的相关性（ ， ）及肿瘤纯度( ， ）.

3.3.CD8+T淋巴细胞共表达模块功能分析

我们测定了TCGA-LIHC grey60和品红模块中CD8+ T淋巴细胞比例最高的20个CD8+ T淋巴细胞比例1和2).洋红模块中20个CD8+T淋巴细胞比例阳性共表达mRNA在抗原处理和呈递中最显著富集。灰色60模块中20个CD8+T淋巴细胞比例阳性共表达mRNA在调节淋巴细胞活化中最显著富集，表明这些生物学特性cal过程可能促进肝细胞癌微环境中的CD8+T淋巴细胞浸润（图3(一个)和3 (b)）.黄色和绿色模块的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络如图所示3.．

3.4。共表达基因的临床表型和免疫表型相关性

为了确定这些共表达基因的结局状态相关性，我们进行了生存分析。CCL5 (TCGA)低表达组: ），CST7（TCGA： ），TCGA HLA-DPA1 (: ），TCGA HLA-E (: ），TCGA NKG7 (: ），张(TCGA: ），1英镑(TCGA: ），TCGA HLA-DPB1 (: ），TCGA IGLL5 (: ），HLA-DRB1（TCGA： ），CD3E（TCGA: ），TCGA GZMA (: ），HLA-DRA（TCGA： ），jchain（Tcga： ），TCGA MZB1 (: ），coro1a（Tcga： ），和HLA-DMA (TCGA: ）显示高表达组的生存风险(图4）.这些结果表明灰60和品红模块中的共表达基因可以预防肝癌。接下来，我们发现这些因素与CD8+ T淋巴细胞呈正相关(图)5)与肿瘤纯度呈负相关（图6）.

3．5．CD8+ T淋巴细胞共表达基因Cox回归风险模型

基于这些肝肝细胞结果保护因子进行CD8 + T淋巴细胞共抑制基因COX回归危害模型。

肝癌患者高危样本中的样本（TCGA： ； ）(图7)显示出与低风险人群相比的生存风险 (图7)对不同亚组的风险评分进行评估，包括年龄、性别、分期、肿瘤纯度和肿瘤突变负担。这些亚组的结果是显著的。

3.6。GSEA

抗原处理和呈递，趋化因子信号通路，细胞因子 - 细胞因子受体相互作用途径和T细胞受体信号传导途径与C1QC，CD3D，GZMA和PSMB9中的高表达组有关（图8）.

3.7.组织验证和单细胞标记

在中国医科大学第一附属医院的肝癌队列中，对癌内和癌周围的CD3D蛋白表达水平进行了免疫组织化学分析。结果表明，CD3D的染色强度较低（图1）9（a））.我们还在Geo中的肝癌的单个细胞数据中进行了UMAP尺寸减少聚类。使用“SINGLER”向子集注释，我们获得了包含T细胞巨噬细胞和其他小区的子集。我们发现CD3D的表达含量在T细胞子集中相对较高，在TCGA-LIHC中证实了我们之前的结论（图9 (b)）.

我们分析了CD3D与肿瘤微环境中目前已知基因集的关系，并在另外两个队列GSE29721中验证了CD3D与CD8A的表达相关性[22.]和GSE121248[23.]我们还标记了不同T细胞亚型在单细胞队列中的分布，结果显示CD3D与CD8A的相关性更强，与CD4+T淋巴细胞的相关性更小（补充图1）.

4.讨论

免疫治疗是一种在临床实践中广泛应用的晚期癌症治疗策略，但仍有许多不令人满意的结果，包括免疫治疗成功率低、与免疫治疗相关的并发症以及免疫治疗的超进展。研究表明，免疫治疗成功率低与由于CD8+T淋巴细胞浸润低，抗原提呈过程减弱，PD-1表达降低。本研究中，我们结合计算生物学和实验探索了促进肝癌中CD8+T淋巴细胞浸润的共表达网络。共表达网络中的因素这项工作被认为在生物体内具有相似的生物学功能。因此，挖掘这些共表达因子有助于我们了解与肝癌中CD8+T淋巴细胞浸润最密切相关的生物学过程。

grey60模块是与CD8+ T淋巴细胞最相关的共表达模块。该模块中的因子与调节T细胞增殖有关。到目前为止，我们已经证明这些因子在测序和功能水平上与CD8+ T淋巴细胞浸润有关。基于我们的推断，我们认为这些因素可能通过增加CD8+ T淋巴细胞的浸润来改善预后。然后，我们对这些因素进行生存分析，并成功构建了基于CD8+ T淋巴细胞共表达因子的肝癌预后风险评分。采用免疫组化方法检测C1QC、CD3D、GZMA、PSMB9蛋白在不同肝癌分期中的差异。

C1QC编码补体C1q C链，该链与C1r和C1s结合产生血清补体系统的第一个成分[24.，25.］．C1Q由18个多肽链组成，其包括六个A链，六个B链和六个C型链组成。每种链含有N-末端胶原状区域和C末端C1Q球状结构域。CD3D编码的蛋白质是T细胞受体/ CD3复合物（TCR / CD3复合物）的一部分，并参与T细胞发育和信号转导[26.，27.］．编码的膜蛋白代表CD3复合体的delta亚基。与其他四个CD3亚基一起，编码的膜蛋白结合TCR α / β或TCR γ / δ在T细胞表面形成TCR/CD3复合物[28.]在这项研究中，转录组、组织学和单细胞队列被用来证明C1QC和CD3D在CD8+T淋巴细胞中的重要性。

本文有一些局限性。我们使用TCGA与中国医科大学肝癌组织进行联合分析。更多的外部队列仍然需要交叉验证。由于计算机计算能力有限，我们在执行WGCNA时，只纳入方差在前25%的因素。这可能会导致一些假阴性结果。需要使用更先进的计算机来重复这种筛选方法。虽然我们假设这些因子可以通过促进CD8+ T淋巴细胞的浸润来提高肝癌免疫治疗的疗效，但由于TCGA随访数据中缺乏免疫治疗疗效评价，我们仅探索了这些共表达因子在肝癌中的传递。需要增加更多具有免疫随访资料的队列，促进CD8+ T淋巴细胞浸润，改善患者预后。

总之,我们构造一个肝癌预后风险评分模型基于CD8 + T淋巴细胞内容coexpression分子网络,确定风险因素得分模型可以作为肝癌生存的独立预后因素,并确定这些因素的水平在mRNA和蛋白水平。这些与预后相关的CD8+ T淋巴细胞共表达因子及其相关的生物学功能可能为提高免疫治疗的疗效提供新的方向。

数据可用性

本研究的TCGA-LIHC数据集可在http://cancergenome.nih.gov/。本研究中的数据集GSE129516、GSE29721和GSE121248可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/．

伦理批准

伦理编号为中国医科大学AF-0G-03-1.0-02。

同意

所有患者均签署知情同意书。

的利益冲突

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

齐盘写了手稿，程颖和程东华修改了手稿。

致谢

辽宁省教育厅2020年度科研计划项目(no . FWZR2020002)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性我们感谢这些参考文献的作者所作的出色工作。已上传预印本https://www.researchsquare.com/article/rs-146843/v1．

补充材料

补充图1:CD3D免疫环境分析与验证。(A) CD3D表达与免疫反应强度呈正相关。(B) GSE29721和GSE121248中CD3D表达与CD8A呈正相关。(C) CD8A和CD4的分布。（补充材料）

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