文摘

牙周炎是牙齿周围组织的慢性炎症引起的斑块和相应的免疫反应。生长arrest-specific蛋白6 (GAS6)和妳受体酪氨酸激酶(妳)参与炎性疾病,虽然信号传感器和催化剂transcription-1 (STAT1)和抑制炎症相关的细胞因子信号(soc)的过程。此外,miRNA34a直接目标妳调节妳的表情。然而,特定角色的GAS6牙周炎和妳仍不清楚。本研究旨在探讨妳的效果和机制引起的炎性细胞因子的表达Porphyromonas gingivalis脂多糖(p . gingivalis有限合伙人)人类牙周韧带细胞(hPDLCs)。不同浓度的的影响p . gingivalis有限合伙人在hPDLCs GAS6 /妳的表达被观察到。此外,该有限合伙人对妳的影响被转染miRNA34a抑制剂的研究。妳拆除或过表达观察的释放炎性细胞因子白介素- 8 (IL)和IL - 6的分泌。结果表明,GAS6和妳的表达水平降低p . gingivalis有限合伙人的感染。转染miR-34a抑制剂hPDLCs表现出角色的miR-34a妳的差别在对这些表达式由有限合伙人。此外,妳击倒或过度影响引发和il - 6的表达了在LPS刺激。妳可拆卸的减少STAT1和SOCS1/3的表达。总的来说,这些结果说明妳抑制LPS-induced炎性因子的表达hPDLCs STAT1和SOCS1/3参与炎症的调控GAS6 /妳。

1。介绍

牙菌斑引起的牙周炎是一种慢性感染性疾病,导致牙周组织的破坏。Porphyromonas gingivalis流行在成人牙周炎患者(1),发现超过80%的患者(2]。p . gingivalis脂多糖(p . gingivalis有限合伙人)刺激促炎反应和骨吸收在活的有机体内(3,4]。在体外研究表明,多种细胞产生不同的促炎细胞因子,包括白介素- 1 (IL)α,il - 1β、il - 6、引发和肿瘤坏死因子(TNF -α),后p . gingivalis有限合伙人的挑战[5,6]。

TAM的受体酪氨酸激酶家族有三个成员:TYRO3,妳受体酪氨酸激酶(妳)和MERTK。妳原本孤立和确定1991年在慢性粒细胞白血病细胞(7- - - - - -9),这是一种跨膜蛋白,取决于交互与其配体激活(7]。TAM受体的激活依赖于绑定两个配体:增长arrest-specific 6蛋白质(GAS6)和S1 (PROS1) [10]。在TAM受体,GAS6最高绑定到妳的亲和力;然而,PROS1之间的亲和力和妳还没有被证实11,12]。

GAS6 /妳激活多个不同的细胞信号通路;扮演几个角色,包括细胞生存、增殖,炎症,和迁移;和参与几个途径,包括磷脂酰肌醇3-kinase-Akt,细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2,磷脂酶C -γ通路(13]。GAS6 /妳也被确认为各种人类疾病的生物标志物,包括纤维化和炎症性疾病(14]。GAS6扮演着一个重要的角色在老鼠的口腔上皮细胞(免疫内稳态15,16]。p . gingivalis刺激增加i型干扰素的生产(IFN-I)小鼠的牙龈上皮中,导致GAS6下降,妳,PROS1水平(17]。PROS1也显示出抑制牙周牙槽骨吸收在老鼠18]。然而,妳在人类牙周组织的作用尚不清楚。

信号传感器和催化剂的transcription-1 (STAT1)是统计家族的一员,已证实在干扰素信号通路起着关键作用在多个研究[19]。GAS6 /妳激活STAT1和IFNAR1-STAT1复杂,导致增加的抑制细胞因子的表达signaling-1 (SOCS1)和SOCS3 [20.]。小分子核糖核酸(microrna)短的非编码rna调节基因的表达,导致平移镇压或信使rna降解[21]。确认该miR-34a直接目标3未翻译的妳使用荧光素酶记者分析(22- - - - - -24]。miR-34a调节血管平滑肌细胞钙化通过抑制妳(25),upregulation miR-34a显示显著减少妳的水平在类风湿性关节炎(RA)患者和健康人相比,(26]。

基于此背景下,本研究旨在(a)评估的影响miR-34a妳的表达在人类牙周韧带细胞(hPDLCs)刺激p . gingivalis有限合伙人在体外,(b)观察在体外妳对炎性细胞因子表达的影响引发和il - 6在hPDLCs刺激p . gingivalis有限合伙人和(c)调查的作用和潜在机制在这一过程中妳。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

hPDLCs买来iCell生物科技有限公司(上海,中国),培养在最低必要的中期α(αmem ScienCell)补充10%胎牛血清的边后卫,100国际单位/毫升青霉素(P), 100年μg / mL链霉素(S)在37°C和5%的公司₂在湿润孵化器。制造商确认的纤连蛋白和波形蛋白免疫荧光染色阳性细胞,细胞纯度高于90%。细胞通道3 - 7被用于后续的实验。“标准”p . gingivalis有限合伙人来自InvivoGen(猫。不。tlrl-pglps)。

2.2。刺激协议

hPDLCs ( 细胞/)被播种在6-well盘子2毫升αmem补充10%的边后卫和1% P / S。一旦培养,hPDLCs达到80 - 90%的融合;他们刺激不同浓度(0μ0.1 g / mL,μg / mL, 1μ10 g / mL,μg / mL)p . gingivalis有限合伙人24 h。GAS6 / tam的表达被确定。在50 - 70% hPDLCs融合与小干扰rna转染(siRNAs),质粒,或一个microrna的抑制剂,紧随其后的是挑战与1μ克/毫升p . gingivalis有限合伙人24 h。炎性细胞因子的释放引发和il - 6被观察到。

2.3。细胞转染

hPDLCs ( 细胞/)被播种在6-well盘子2毫升αmem补充10%的边后卫。当细胞达到50 - 70%融合,他们转染miRNA34a抑制剂(100海里)或microrna负控制(mi-NC)(100海里)使用Lipofectamine 3000(英杰公司)根据制造商的指示。妳可以阻止(si-AXL) (20 nM)被用来击倒妳小干扰rna (si-CTR)表达式,炒作为消极的控制,其次是挑战1μ克/毫升p . gingivalis有限合伙人24 h。pcDNA3.1(+)妳质粒(5μg)是合成过度表现妳。siRNAs和质粒被GenePharma合成(苏州、中国)。列出了siRNAs序列表1。转染效率是决定通过测量妳的基因和蛋白质表达水平反向transcription-quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫印迹分析,分别如下所述。

2.4。实时定量聚合酶链反应

从培养细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体)和reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类)。qPCR化验的il - 6,引发,妳、miRNA34a和甘油醛3 -磷酸脱氢酶(GADPH)进行使用SYBR绿色主人混合(罗氏)。表中列出使用的引物2。试验在7500年进行快速实时定量PCR系统(应用生物系统公司)在以下thermocycler条件下:一个周期在95°C 10分钟,其次是40的循环在95°C和1分钟15秒60°C。目标基因的表达是标准化的GAPDH使用比较2^{- - - - - -ΔΔCT}方法(27]。

2.5。免疫印迹分析

细胞细胞溶解使用缓冲区里帕(高效率)(中国Solarbio)含有1%完成蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Huaxingbio,中国)。超声破碎法后1分钟和30分钟的离心,bicinchoninic酸测定(热费希尔科学)是用于确定蛋白浓度。总蛋白(30μg)在不同的样本是由sds - page分离,然后转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(热费希尔科学)。阻塞后5% 脱脂牛奶在室温下1 h,膜与初级孵化抗体在一夜之间在4°C,其次是孵化与goat-anti老鼠或兔子辣根peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。蛋白质的乐队是由化学发光成像与Chemidox XRS成像系统(Bio-Rad)和量化微使用ImageJ 9.0。蛋白质的相对表达水平被规范化GAPDH水平。主要使用以下蛋白抗体:GAS6(细胞信号技术),妳(bios抗体),TYRO3 (Abclonal) MERTK (CUSABIO生物技术),STAT1 (Abclonal) phospho-STAT1 (Tyr701亲和力生物科学)、抑制细胞因子的信号(SOCS1亲和力生物科学)、il - 6 (Abclonal),引发(Abclonal) SOCS3 (Abclonal)和GAPDH (ZSGB-Bio)。

2.6。统计分析

每个实验执行和结果表示为一式三份 。数据分析使用SPSS(22.0版)。未配对的两组之间的差异进行了分析=测试或Mann-Whitney测试正常与否正态分布变量,分别。统计分析在多个组克鲁斯卡尔-沃利斯用单向方差分析或执行测试。统计学意义是 ( , ,和 )。

3所示。结果

3.1。GAS6 /妳表达减少p . gingivalisLPS-Stimulated hPDLCs

GAS6 TYRO3,妳,MERTK表示控制hPDLCs没有刺激(图1)。然而,每个蛋白质的表达水平明显下降后观察一个挑战p . gingivalis有限合伙人。此外,有一个浓度减少TYRO3 LPS刺激后,妳表达水平。有限合伙人挑战1μg / mL 24 h用于后续实验模拟牙周炎症微环境根据先前的研究28,29日]。没有发现孵化后形态学变化p . gingivalis有限合伙人24 h(图1 (c))。

3.2。miR-34a抑制剂逆转的抑制作用p . gingivalis有限合伙人在hPDLCs妳的表情

的影响p . gingivalis有限合伙人在妳的表情感染hPDLCs减毒的miR-34a抑制剂(图2)。如图2(一个)挑战后,miRNA34a水平增加1μ克/毫升p . gingivalisLPS刺激。p . gingivalis有限合伙人下调妳在mRNA的表达(图2 (b); )和蛋白质(图2 (c)和2 (d); )的水平。然而,p . gingivalis妳的差别LPS-induced对这些基因的表达在hPDLCs逆转,转染miR-34a抑制剂( )。这些结果表明,miR-34a参与妳的差别,对这些基因的诱导表达p . gingivalis在hPDLCs有限合伙人。

3.3。妳调制的p . gingivalisLPS-Induced il - 6的表达和hPDLCs引发

妳可拆卸的效率为76.03%,56.97%是观察到mRNA(图3(一个); )和蛋白质水平(数字3 (d)和3 (e); ),小干扰rna转染后分别与相应的水平相比si-CTR控制。hPDLCs与妳击倒展出mRNA增加(数据3 (b)和3 (c))和蛋白质(数据3 (d)和3 (e))表达水平的il - 6 ( )和引发( )。此外,妳可拆卸的减少GAS6的蛋白质含量( )。

过度的妳在hPDLCs导致大约17 - mRNA(图和增加2.74倍4(一)(图)和蛋白质4 (d)分别)水平。il - 6的表达水平,引发减少AXL-overexpressing细胞与转染与空pcDNA3.1(+)质粒( )(数据4 (b)- - - - - -4 (e))。

3.4。STAT1 / SOCS1/3参与AXL-Mediated炎症调节

hPDLCs有或没有妳可拆卸的服用p . gingivalis有限合伙人24 h, STAT1的表达水平和SOCS1/3比较与控制细胞(图5)。免疫印迹显示p . gingivalisLPS刺激导致减少的表达SOCS1 SOCS3的表达增加,SOCS1和SOCS3的表达水平均显著降低( )表达下调后妳表达式。p-STAT1的表达下调后也大大减少妳( )。

4所示。讨论

在这项研究中,hPDLCs挑战p . gingivalis有限合伙人表现出减少妳的表达及其配体GAS6;然而,miR-34a抑制剂逆转的抑制作用p . gingivalis有限合伙人在hPDLCs妳的表情。过度的妳抑制的LPS-induced表达il - 6和引发,而减少妳表达导致增加il - 6和引发水平和减少p-STAT1, SOCS1, SOCS3的水平。

牙周疾病是多因素之间的相互作用引起的感染细菌和宿主组织或细胞。p . gingivalis属于“红色复杂,”提出了高检测率在网站表达进步牙周炎(30.]。牙周韧带细胞产生和分泌胶原等细胞外基质成分,形成稳定的牙周韧带和纤维牙骨质和牙槽骨连接,使牙周韧带损伤后再生(31日]。牙周韧带细胞是免疫细胞表达il - 6,引发,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1),和其他炎症细胞因子和趋化因子(32- - - - - -34]。p . gingivalis激活NF -κB、半胱天冬酶1和其他炎症通路hPDLCs [35,36]。我们成功地建立了一个在体外使用hPDLCs牙周炎模型p . gingivalis刺激。各种各样的p . gingivalis有限合伙人准备商业应用。与“超纯”p . gingivalis有限合伙人,“标准”p . gingivalis有限合伙人显示明显高于免疫原性(5),因此可能更反映当地牙周炎毒力因素的复杂性。

炎症调节妳和GAS6表达式。妳源于造血、上皮和间充质细胞和表达在大多数人类细胞(7),而GAS6广泛表达于多种组织如骨骼,肺,心脏,肾,但其肝脏中表达水平较低37]。p . gingivalisLPS抑制妳的表达和GAS6人类脐静脉内皮细胞(38]。的抑制作用大肠杆菌有限合伙人在妳的表达在人类脐静脉内皮细胞也被报道(39]。妳和GAS6表情调节牙龈上皮细胞或血管感染后的老鼠p . gingivalis,而随后的感染显著减少他们的表达水平17]。然而,类似水平的妳和GAS6已发现人类慢性牙周炎牙龈组织有或没有使用qPCR [18]。这种差异可以解释为多个牙周病原体导致慢性牙周炎。在这里,我们表明,妳在hPDLCs降低浓度的方式表达的挑战p . gingivalis有限合伙人。两个1μg / mL和10μ克/毫升p . gingivalisLPS抑制生产GAS6 hPDLCs tam。之前报道,hPDLCs处理p . gingivalis有限合伙人(5μg / mL)显示显著减少可行的细胞与对照组(35]。指的是许多研究涉及p . gingivalis有限合伙人(28,29日,40),我们使用一个挑战1的浓度μg / mL 24 h在后续实验最佳模拟牙周炎症微环境。

妳的表达在肿瘤和自身免疫性疾病的研究显示,妳是由各种各样的microrna,包括miR-34a, mir - 199 a, mir - 92 b (25,41- - - - - -43]。miR-34a水平树突细胞来自RA患者高于健康人(26]。在这项研究中,转染的hPDLCs miR-34a逆转妳在hPDLCs诱导表达的减少p . gingivalis有限合伙人。妳受体发挥抗炎作用在不同的细胞和组织。妳^{- / -}日本脑炎小鼠显示加速发展,增加神经细胞死亡,扩大炎症细胞浸润,并增加促炎细胞因子水平与控制老鼠的44]。Anti-AXL抗体疗法减少了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度(45]。此外,妳LPS-induced内皮炎症激活和提供中介妳降价增加细胞间黏附分子1的表达(ICAM-1)和炎性因子白介素和引发39]。补充的妳配体GAS6作为治疗药物抑制中枢神经系统的炎症抑制TNF的upregulation -α在妳^{- / -}小胶质细胞引起的大肠杆菌有限合伙人(46),通过增加il - 10的表达和转化生长因子(TGF -β)[47]。然而,促炎效应观察GAS6 /妳在肝脏和肾脏48]。在这项研究中,il - 6的表达和引发hPDLCs增加和减少妳分别击倒和超表达。GAS6缺乏报道降低TNF的表达α和MCP-1提出防止肝脏炎症、肝病、肝纤维化小鼠(49]。GAS6 /妳的不同影响炎症中观察到这些研究可能与它的修复效果。

toll样受体,抑制(TLR)介导炎症所GAS6 /妳[也得到了证实50]。soc TLR的负调控中起着重要的作用,细胞因子受体介导炎症通路。GAS6 / TAM TLR-mediated炎症通路的抑制有关SOCS1和SOCS3感应50,51]。通过TAM GAS6激活STAT1受体;在复杂与IFNAR1-STAT1 STAT1修改(可能的磷酸化)和把核,导致SOCS1的感应和SOCS3调节炎症反应(50]。与这些以前的结果,我们的结果是一致的显示,SOCS1 / SOCS3的表达和p-STAT1大幅减少妳的差别后,对这些基因的表达在hPDLCs挑战p . gingivalis有限合伙人。这被认为是转染剂的效果Lipofectamine 3000,这或许可以解释的增加p-STAT1转染后的控制核;然而,增加p-STAT1 Lipofectamine与si-AXL转染后3000年有所下降。在牙周炎引起的小鼠模型p . gingivalis,丧失MyD88 TLR信号显著降低GAS6的表达,和PROS1妳的17]。优点抑制TNF -的生产α、il - 6、il - 1β、MMP9/2和RANKL引起的p . gingivalis有限合伙人通过SOCS1/3 STAT1/3人类牙龈上皮细胞在体外(18]。损害GAS6 /妳信号通路导致SOCS1/3表达降低,最终导致不羁IFN-I在上皮细胞的表达。因此,还需要进一步的实验来更好地理解STAT1的炎症调控作用在这种背景下,如通过检查特定STAT1抑制剂对il - 6的变化的影响和引发。此外,在活的有机体内研究还计划来确认这些影响。值得注意的是,妳可以抑制巨噬细胞炎症诱导捻蛋白质抑制NF -函数κB-dependent TNF -α基因激活(19]。因此,捻/ NF -κB途径将是我们未来的研究关注妳的角色在牙周炎的炎症调节。

5。结论

总之,妳在hPDLCs诱导表达p . gingivalis有限合伙人调节炎性细胞因子il - 6的表达,并通过STAT1引发/ soc通路。miR-34a逆转妳表达的抑制作用p . gingivalis有限合伙人在hPDLCs挑战。这在体外因此研究加深了我们对所涉及的分子机制的理解p . gingivalishPDLCs LPS-induced炎症,需要进一步确认在活的有机体内。

数据可用性

本研究所有生成的数据集都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

深圳设计和执行研究,收集和分析数据,写的手稿。YL和XW进行了研究,收集数据,并提供了分析工具。NA和XO指导、设计和监督的研究;提供金融支持的研究;和编辑的手稿。NA和XO cocorresponding作者。所有作者阅读和批准了手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81500859和81500859号)。