文摘

目的。探讨缺氧对膀胱癌细胞化学抗性和底层机制。方法。国际- 87膀胱癌细胞系是顺铂在缺氧和常氧条件下处理和测试使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析,流式细胞术和免疫印迹。所有的数据都表示为 从三个独立的实验,分析了由多个 - - - - - -测试。结果。膀胱癌细胞的细胞凋亡引起的顺铂是在缺氧条件下减。缺氧自噬增强顺铂所致。自噬抑制剂和HIF-1α抑制剂可以在缺氧条件逆转药物抗性。膀胱癌细胞的细胞凋亡和自噬被HIF-1表达下调α抑制剂YC-1。低氧诱导自噬增强顺铂通过HIF-1信号通路的药物抗性。结论。顺铂耐药性国际- 87年膀胱癌细胞在缺氧条件下可以解释为激活自噬,由HIF-1监管α相关信号通路。hypoxia-autophagy通路可能是目标改善顺铂化疗在膀胱癌的疗效。

1。介绍

膀胱癌是第二个最常见的泌尿系肿瘤和癌症相关死亡的第五大常见原因男性在西方国家(1]。以铂为基础的全身化疗治疗膀胱癌很重要(2]。然而,一般的结果仍不满意。耐药仍然是一个关键的障碍限制了理想的膀胱癌患者的治疗效果。在最近几十年,已经完成了大量的工作来减弱耐药性和开发新颖的治疗方法,不太容易受到阻力3]。耐药性的机制可以归因于多种因素,包括改变药物网站,更有效的DNA修复机制,药物流出和代谢,药物动力学,肿瘤微环境,压力诱导遗传或表观遗传改变应对药物暴露(4]。在上述原因,肿瘤缺氧微环境必须考虑。致癌作用密切相关,肿瘤组织内缺氧环境。低氧诱导因子(HIF) 1α,最高阶的蛋白质刺激缺乏氧气,在组织和细胞中表达的广泛5]。根据最近的文学、化学抗性主要是由于HIF-1的表达和激活α(6]。

自噬发生在真核生物和是一个进化保存过程中细胞内蛋白质和细胞器是隐藏在自噬体,这是专门double-membrane-containing液泡(7]。通过自噬,肿瘤可以抵消各种不利条件,包括缺氧(8]。在饥饿或缺氧条件下,细胞能够消除过度的蛋白质和细胞器,可能维持体内平衡和促进循环和重复利用的氨基酸。事实证明,HIF-1α有一个亲密的关系与细胞内自噬引起的缺乏氧气。HIF-1α可以调节低氧诱导自噬通过操纵下游目标基因的表达BNIP3 BNIP3L,诱导自噬通过干扰Beclin-1之间的交互,bcl - 2,和BCL-XL9,10]。

膀胱移行细胞癌肿瘤是一个活跃的代谢与耗氧量高于健康组织。因此,肿瘤组织缺氧环境中的部分。然而,小的工作已经进行药物抗性之间的关系,在膀胱癌组织缺氧。在这里,我们调查的影响,低氧微环境在膀胱癌细胞对顺铂药物抗性和试图解释这种现象的潜在机制。本研究旨在揭示缺氧和自噬相互作用如何调解顺铂耐药性在膀胱癌细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

国际- 87年膀胱癌细胞系细胞从昆明购买银行,中国科学院。国际1640年RPMI - 87细胞最初培养介质(美国CA Gibco)和孵化10%胎牛血清(美国UT气旋、洛根)和青霉素和链霉素(Gibco) 37°C公司5%₂的气氛。

2.2。道德声明

人体组织,在本研究样本不是必需的。所有的工作已经在完善的执行,商用细胞系。

2.3。细胞治疗

国际- 87细胞与不同浓度的顺铂治疗(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)数小时或几天执行3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。这些细胞生长在20%或1%₂和5%的公司₂分别的气氛。观察的影响3-methyladenine (3-MA;Selleck化学品,休斯顿,德克萨斯州,美国)或lificiguat (YC-1;Selleck化学品),国际- 87细胞于96年首次培养——好或6-well板24 h,然后顺铂和抑制剂添加进一步的24小时。这些细胞被培养在20%或1%₂和5%的公司₂大气中缺氧孵化器(热费希尔3111)。样本收集和分析西方墨点法,如下所述。

2.4。MTT试验

细胞治疗后生存能力被MTT试验研究。细胞(5000 / 100μl介质)在96孔培养板(美国纽约康宁,康宁公司),治疗后,20μl MTT添加在PBS(5毫克/毫升)和孵化为4 h 37°C。我们把中、MTT解决方案,增加了100人μl二甲亚砜(Sigma-Aldrich),以490海里ELISA板读者(美国BioTek Winooski, VT)。

2.5。流式细胞术

细胞治疗后在PBS收集和洗3次。他们resuspended加载缓冲区(Sangon生物科技、上海、中国) 来 细胞/毫升。细胞凋亡和自噬分析膜联蛋白V-FITC /π工具包(Sangon生物技术)和monodansylcadaverine (MDC)工具包(北京Solarbio科技有限公司、北京、中国)被利用,分别。BD FACSCanto™II系统(美国BD生物科学,圣何塞,CA)是用于检测细胞表面标记。所有的结果都是由FlowJo软件分析。

2.6。MDC荧光染色

国际- 87细胞生长在盖玻片被用于MDC荧光染色。细胞培养在20%或1%₂和5%的公司₂的气氛。一夜之间,盖玻片被浸泡在75%的乙醇和PBS (Sangon生物技术)洗3次。盖玻片是放在6-well板块(康宁)和细胞悬液补充道。一天后,我们添加了顺铂和抑制剂细胞进一步的天,把盖玻片PBS的细胞和洗3次。细胞被固定为4%多聚甲醛(Sangon生物技术)30分钟在室温和在PBS洗3次。10%的细胞被孵化MDC在PBS为30分钟,洗3次。所有由徕卡DM4000B显微镜拍摄的图像(美国IL徕卡)。

2.7。西方墨点法

细胞细胞溶解在缓冲区里帕(Beyotime生物科技、上海、中国)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。蛋白质浓度的样品由BCA量化分析工具(Beyotime生物技术)和等量的蛋白质被加载到10% sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,Billerica的)。膜被封锁的5%脱脂乳1 h和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。以下主要抗体被用来检测蛋白质:兔子anti-Beclin-1多克隆抗体(1:500;亲和力,运河富尔顿,哦,美国),兔子anti-ATG 5多克隆抗体(1:500年,亲和力,哦,美国),鼠标anti-HIF-1A单克隆抗体(1:500;亲和力),兔子anti-caspase-3多克隆抗体(1:500;Proteintech,武汉,中国)。膜是孵化与山羊anti-rabbit免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(1:1000;Beyotime)或一只山羊anti-mouse免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(1:1000;Beyotime) 1 h。 Incubation with a mouse anti-β肌动蛋白单克隆抗体(1:1000;Abcam,剑桥,英国)进行加载控制样品。这些墨迹被发现使用清晰马克斯™西方ECL衬底(BioRad、大力神、钙、美国)ChemiDoc™XRS +系统(BioRad)。

2.8。统计分析

所有的数据都表示为 从三个独立的实验,分析了由多个 - - - - - -测试。数据图形化显示使用GraphPad棱镜版本6.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义的分析。

3所示。结果

3.1。缺氧诱导药物抗性国际- 87年膀胱癌细胞

抵抗化疗药物是一个关键的障碍,遇到在泌尿肿瘤的化疗11]。探索这种阻力背后的机制,我们设计了实验观察细胞生长的差异在常氧和缺氧条件下,它被定义为5%的股份有限公司₂20%的人啊₂和5%的公司₂1%的人啊₂,分别。- 87国际癌症细胞维持在完全培养基normoxia与顺铂浓度分级缺氧和孵化。在12 h,顺铂细胞增殖率下降,但这一趋势是与药物浓度的增加不明显。在24和48 h,细胞抑制率增加顺铂治疗后剂量依赖性的方式。在浓度高于5的趋势越来越明显μ顺铂和影响细胞增殖(图1(一))。由于抑制利率的显著变化,改进实验浓度为2.5μ米和5μM是进一步进行。国际- 87细胞的抑制率2.5和5之间是相似的μM顺铂(图1 (b))。因此,2.5μ米被选为下一个实验。

顺铂波动的抑制率与浓度的增加约20%国际- 87细胞在低氧条件下培养时(图1 (c))。然而,小改变,享年100岁μ在12 h M浓度和不规则变化同时观察。与顺铂浓度相同,国际- 87细胞的抑制率在缺氧下价格相比明显下调normoxia(图1 (d)),这表明顺铂耐药性可能是在国际- 87细胞缺氧引起的。

3.2。流式细胞术验证药物抗性国际- 87细胞对顺铂

Cisplatin-induced死于膀胱癌细胞涉及多个信号通路。在这些途径中,线粒体凋亡中起着重要的作用。MTT分析推断,化疗药物和缺氧有明确的对国际- 87细胞的生存能力的影响。阐明这一现象的原因,我们研究药物对细胞凋亡的影响。流式细胞术显示,细胞凋亡率显著增加(16.2 - -31.3%在24 h 9 - 14.6%在48 h) normoxia下随药物浓度增加。相比之下,细胞凋亡率与药物浓度的增加略有增加(36 - 46.7%在24小时32.6 - -34.2%在48小时)在缺氧。48 h后治疗,细胞凋亡率没有明显不同于normoxia之下。治疗后2.5μ顺铂在24 h,控制细胞的凋亡率高于常氧条件下(28.6%比16.2%)(数据2(一个)和2 (c))。然而,类似的改变并不是发现在缺氧条件下(36%比36.7%)。这表明,药物毒性下癌细胞normoxia增强随着药物浓度的增加,这样的效果是由缺氧受损(数字2 (b)和2 (d))。结果在48小时可能是由于药物失活。

3.3。自噬抑制剂和HIF-1抑制剂对药物抗性的影响下的国际- 87细胞Normoxia和缺氧

上述结果证明缺氧诱导抗化疗,这个过程和细胞凋亡相关。据报道,癌症细胞通过自噬在不利条件下使自己更适应。因此,我们推测,自噬在这一过程中扮演了一个至关重要的角色。为了验证这个假设,我们抑制自噬和3-MA的HIF-1 YC-1缺氧和常氧条件下。根据MTT测定,孵化后3-MA和HIF-1α抑制剂YC-1,顺铂浓度的增加细胞毒性是加强3-MA和YC-1(数字3(一个)和3 (b))。我们选择5毫米3-MA和100年μm YC-1下列实验。

为了调查的影响3-MA YC-1,我们检查了HIF-1的表达α中存在。结果表明,缺氧,5毫米3-MA和100年μm YC-1可以抑制HIF-1的表达α有效地在国际- 87细胞(图3 (c))。在常氧条件下,抑制自噬途径可以降低细胞的活动。这种环境导致自噬,从而显示了顺铂耐药性。来验证上述假设,我们继续在缺氧条件下的相关测试。这一趋势在缺氧在normoxia(图类似3 (d))。值得注意的是,这一趋势在缺氧小于normoxia(相对细胞常氧条件下的可行性,顺铂:83.9%,顺铂+ 3-MA: 77.0%,顺铂+ YC-1: 59.2%,与顺铂+ 3-MA + YC-1: 31.5%;相对可行性在缺氧条件下,顺铂:86.0%,顺铂+ 3-MA: 72.5%,顺铂+ YC-1: 71.0%,与顺铂+ 3-MA + YC-1: 45.2%)。这一结果表明,自噬和HIF-1α基因可能参与了缺氧抗顺铂- 87国际癌症细胞。

3.4。自噬在耐药性分析过程

MDC是一个荧光化合物,由ion-trapping纳入multilamellar身体机制和交互与膜脂质和探针检测培养细胞的自噬空泡(12]。流式细胞术显示,对照组有27.7%自噬而顺铂组只有8%在常氧条件下,表明细胞不能进行自噬在常氧条件下抵消药物中毒(图4(一))。与对照组(19.4%)相比,自噬在药物组显著增加(48.1%)后,大大减少了添加3-MA (11.3%)。这表明,耐药的细胞在低氧环境中确实是通过自噬调节(图4 (b))。

上述结果证明,在低氧的情况下,顺铂诱导自噬在肿瘤细胞,这是按照争取民主变革运动检测的结果。

3.5。自噬和凋亡参与药物抗性顺铂在缺氧的条件下,证明了分子测试

MTT试验(图2)表明,细胞凋亡参与了耐药性。为了证实这一点,我们设计实验来检测几个主要标记蛋白质和基因相关的过程。

Beclin-1作为标记蛋白质的细胞自噬。normoxia下,表达Beclin-1顺铂组低于对照组,类似于自噬抑制剂组(图5(一个))。相比之下,表达下Beclin-1缺氧与顺铂治疗后显著增加,显然与3-MA孵化后下降。这些结果和MTT测定和争取民主变革运动测试,表明缺氧促进自噬,让细胞更适应化疗。

normoxia下,表达caspase-3治疗后表达下调YC-1和下降的趋势有所缓解,其次是顺铂。在缺氧条件下,表达caspase-3并没有改变太多学习小组的价格相比对照组,表明两组相似(图中细胞凋亡5 (b))。这一结果表明,缺氧可能针对HIF-1诱导细胞的耐药性α信号通路。

在缺氧,表达Beclin-1显著调节与顺铂处理后,由YC-1表达下调,最低治疗后与代理(图5 (c))。这表明,缺氧会导致细胞内自噬,和减少HIF-1的表情α可能会减弱自噬。这表明低氧环境产生细胞通过瞄准HIF-1自动调整α表达式。这个途径负责耐药性。

Atg5,分子参与自噬,是通过各种应激调节转录因子和蛋白激酶(13]。表达Atg5 caspase-3相似(图5 (d)),在分子水平上支持假说缺氧条件可能会导致细胞内自噬通过瞄准HIF-1α。

基于先前的结果,HIF-1α已被证实参与了这一过程。因此,有必要研究它如何改变和作品。表达HIF-1αnormoxia下不能被检测到。调节缺氧下,添加3-MA和顺铂后显著下调,同样减少添加YC-1之后,顺铂的价格相比负对照组(图5 (e))。我们得出这样的结论:顺铂诱导细胞凋亡在国际- 87细胞在缺氧条件下,针对HIF-1α介导的自噬。

4所示。讨论

缺氧被证明是一个重要的因素在促进药物抗性的癌症细胞。自噬已广泛研究作为cytoprotective机制对化疗(14]。在过去的十年里,越来越兴趣之间的关系缺氧和自噬15,16]。然而,小的工作已经进行膀胱癌(17]。目前的研究表明,顺铂是致命的- 87国际细胞在常氧条件下,但缺氧逆转的细胞毒性化疗通过针对HIF-1调节自噬α。

据报道,癌症细胞经过一系列复杂的分子变化,使他们更适应化疗药物(18- - - - - -20.]。类似于这一点,我们的研究表明,顺铂是更少的有毒膀胱癌细胞缺氧与常氧条件下。的一个主要因素归因于不同的是低氧诱导因子(21,22]。研究证明HIF-1α参与低氧诱导药物抗性(23- - - - - -25]。我们的研究结果支持发现缺氧致顺铂在膀胱癌细胞降低了目标细胞凋亡。我们还表明,HIF-1α并不表示下normoxia但高度调节缺氧和治疗低氧诱导因子抑制剂YC-1时表达下调。低氧诱导药物抗性的根本机制是多方面的,包括MDR基因表达,减少活性氧水平,细胞周期阻滞,基因突变,药物浓度降低(26- - - - - -30.]。

自噬是一个决定性的因素,帮助癌细胞对抗各种不利条件。缺氧可以激活自噬和低氧诱导自噬可保护细胞免受化疗药物诱导细胞凋亡(31日- - - - - -34]。符合上面的报道中,我们的研究表明,MDC和Beclin-1增加缺氧,同时,膀胱癌细胞对顺铂不太敏感。然而,当与3-MA孵化,一个受欢迎的自噬抑制剂抑制LC3-I转换成LC3-II通过瞄准PI3K [34),低氧诱导自噬明显减弱,这表明在低氧条件下自噬诱导导致患膀胱癌的药物抗性。因此,3-MA可以用来增强细胞凋亡时结合化疗药物在缺氧条件下(35,36]。孵化YC-1时,一个典型的低氧诱导因子抑制剂caspase-3是调节在缺氧条件下,表明监管顺铂对细胞凋亡的影响可能是通过针对HIF-1α信号通路。此外,表达Beclin-1和Atg5 normoxia下显示没有变化,增加在缺氧,并下调YC-1顺序处理时,这表明自噬引起缺氧可能是通过调节HIF-1的表情α。太阳等人认为HIF-1α/凋亡途径带来的药物抗性顺铂在膀胱癌37]。结合我们的研究结果,它表明,多种机制参与膀胱癌的药物抗性。未来的研究可以集中在实验HIF-1a /凋亡和autophage相结合。

应该注意的是,我们只研究了一个膀胱癌细胞系和单一的化学治疗剂。未来的研究应该关注多个膀胱癌细胞系和更多的化疗药物。此外,体内实验会使结果更有说服力和可接受的。

5。结论

总之,目前的研究显示,抗顺铂国际- 87年膀胱癌细胞在缺氧条件下可以解释为自噬的激活,这是由HIF-1规定α相关信号通路。因此,hypoxia-autophagy通路可能改善的目标在膀胱癌顺铂化疗的疗效。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Xiawa毛泽东写的手稿,Nanzhang Kefeng丁修订后的手稿。

确认

这项工作是由浙江省自然科学基金的资助,LY18H050002 Y21H050008。我们感谢这些引用的作者他们出色的工作。