p75NTR/proBDNF通过坏死信号通路调控基底细胞癌(BCC)免疫微环境

摘要

基底细胞癌(BCC)是最常见的皮肤癌。虽然大多数基底细胞癌是局部病变且易于处理，但晚期基底细胞癌的治疗选择仍然非常有限。近年来，proBDNF及其受体p75NTR被报道在各种疾病中发挥重要作用，包括癌症和精神病。然而，p75NTR/proBDNF信号在基底细胞癌中的作用尚不清楚。在这里，我们发现p75NTR/proBDNF在基底细胞癌患者样本和细胞系中的表达水平下降。体外研究表明，p75NTR/proBDNF过表达可显著促进肿瘤细胞死亡，包括炎症沉默性凋亡和溶解性炎症性坏死。体内研究显示p75NTR/proBDNF过表达显著促进同基因BCC小鼠模型中肿瘤相关巨噬细胞(M1)和T细胞招募。这些结果表明p75NTR/proBDNF信号通路在基底细胞癌免疫微环境中发挥着重要作用。

1.介绍

基底细胞癌是一种常见且昂贵的皮肤癌。最近的数据点显示540万bcc, 330万美国人诊断出鳞状细胞癌(SCCs)，并呈上升趋势[1- - - - - -3.］．确定的基底细胞癌病因是环境变化，遗传疾病包括Gorlin-Goltz综合征和着色性干皮病[4］．基底细胞癌通常局限于局部。因此，标准的有创和无创手术可以达到令人满意的初级控制。然而，复发是常见的(治疗5年后复发率为10-20%)，并可能导致预后明显恶化[5］．一些基底细胞癌的亚群，如晚期基底细胞癌(aBCCs)，是极具挑战性的治疗，预后很差。这些事实使进一步了解基底细胞癌的发病机制成为一个必要而紧迫的课题。

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作为神经营养因子家族的一员，已被报道在神经系统发育和肿瘤发生中发挥重要作用[6，7］．与其他神经营养因子一样，最初生成的proBDNF可以被切割形成成熟的BDNF (mBDNF) [8］．proBDNF和mBDNF可以结合其受体，在中枢神经系统中发挥相反的生物学作用[9，10］．具体来说，proBDNF的受体是p75泛神经营养因子受体(p75NTR)和sortilin，而mBDNF的受体是原肌球蛋白受体激酶B (TrkB) [11，12］．除了大脑，外周神经系统、免疫细胞以及皮肤、嗅觉上皮和肠道等组织中也发现了proBDNF的自然表达[13］．在皮肤中，在角质形成细胞和神经纤维中发现proBDNF。在免疫细胞中，发现proBDNF及其受体p75NTR在寄生虫感染和神经炎症中上调[14］．基于单克隆抗体的proBDNF阻断剂可显著降低外周后炎症疼痛过敏反应[15］．之前的研究也显示脑膜和外周血CD4中proBDNF上调⁺T细胞可引起免疫抑制环境，从而促进败血症相关脑病的发病[13］．以上证据表明，proBDNF可能通过免疫微环境调控与BCC相互作用。

为了探讨proBDNF在BCC免疫微环境调控中的作用，我们进行了体内和体外研究。我们发现proBDNF/p75NTR过表达可调节BCC免疫微环境。具体来说，proBDNF/p75NTR过表达上调了肿瘤相关巨噬细胞募集，下调了中性粒细胞募集。除了先天免疫细胞外，proBDNF/p75NTR过表达显著增加CD8 T细胞水平。proBDNF/p75NTR可通过坏死信号通路调节免疫细胞募集。

2.结果

2．1．proBDNF/p75NTR在BCC患者样本、细胞系及癌旁非癌组织中的表达水平

为了探讨proBDNF/p75NTR在BCC进展中的潜在作用，我们采用western blotting检测proBDNF/p75NTR在BCC和对照组中的表达水平。如图所示1(一)，典型基底细胞癌的病理结构为基底细胞样细胞，胞浆稀少，核长染深，周围呈栅栏状，瘤周裂开，周围间质呈黏液样改变。如图所示1 (b)，与癌旁非癌组织(anct)相比，BCC患者样本中proBDNF及其受体p75NTR显著下调。如图所示1 (c)，我们还研究了proBDNF及其受体p75NTR在BCC细胞系TE354中的表达。T细胞和永生化人角质形成细胞HaCaT细胞。在TE354中，proBDNF及其受体p75NTR显著减少。与HaCaT细胞比较。如图所示1 (d)而在TE354中BDNF及其受体p75NTR的mRNA水平也显著降低。T和ASZ001细胞系。这些结果提示proBDNF及其受体p75NTR可能是潜在的BCC抑制因子。

2．2.p75NTR/proBDNF表达在BCC细胞增殖和死亡中的调控作用

由于p75NTR/proBDNF在BCC患者样本和细胞系中下调，我们试图探索p75NTR/proBDNF表达在BCC细胞增殖和细胞死亡中的调控作用。我们获得了稳定的BCC细胞系TE354。T-P75NTR和ASZ001-P75NTR，用含probdnf的培养基处理96小时。如图所示2(一个)，添加proBDNF显著抑制TE354细胞增殖。T-P75NTR和ASZ001-P75NTR细胞。由于p75NTR/proBDNF已被报道与凋亡过程相互作用，我们测试了TE354的细胞活力。T-P75NTR和ASZ001-P75NTR细胞标准Annexin V/PI染色。如图所示2 (b)， p75NTR/proBDNF过表达的细胞中有更多的细胞发生凋亡。除了炎症沉默死亡外，我们还评估了溶解性炎症细胞死亡，如坏死。我们构建了稳定的BCC细胞系，该细胞系表达p75NTR与GFP cDNA融合，由一个可诱导的启动子控制。用细胞毒红信号跟踪细胞死亡情况。如图所示2 (c)，与对照相比，过表达p75NTR/proBDNF显著增加了tnf诱导的坏死，表现为红色信号增强。以上结果提示，p75NTR/proBDNF在控制BCC细胞增殖和细胞死亡，包括凋亡和坏死方面发挥作用。

2．3.p75NTR/proBDNF控制RIPK1/ ripk3介导的坏死

坏死普遍被认为是一种炎性细胞死亡。坏死在癌症发展中的作用仍然是一个谜。为了确定p75NTR/proBDNF是否调节tnf诱导的坏死，我们在两个TE354中稳定过表达p75NTR。T和ASZ001细胞表达由诱导启动子控制的GFP报告基因。检测坏死关键适配蛋白RIPK1和RIPK3及其下游效应蛋白MLKL。如图所示3(一个)，与对照组相比，添加proBDNF显著提高了p-RIPK1、p-RIPK3和p-MLKL水平。相应的，利用活成像系统Incucyte跟踪细胞毒性红色信号分析细胞死亡。如图所示3 (b)，与对照组相比，加入proBDNF显著增加了tnf诱导的细胞死亡，表现为红色信号增强。为了分析p75NTR/proBDNF过表达是否会诱导RIPK1/RIPK3介导的坏死，我们用RIPK1抑制剂nec1 -1s和RIPK3抑制剂GSK处理细胞872.如图所示3 (b)通过necs和GSK抑制RIPK1或RIPK3872有效逆转p75NTR/ probdnf诱导的细胞死亡。总体而言，这些数据提示p75NTR/proBDNF在调控RIPK1/ ripk3介导的坏死过程中起着关键作用。

2．4．与正常皮肤相比，人和小鼠模型BCC样品显示巨噬细胞浸润增加

为了探究肿瘤免疫微环境如何影响基底细胞癌的治疗耐药，我们通过对患者样本和小鼠模型样本进行多色(12色)荧光激活细胞分选(FACS)来描述免疫细胞浸润。如图所示4(一)，我们发现CD14增加⁺CD11b⁺HLA-DR⁺人基底细胞癌样本中单核细胞/巨噬细胞与正常皮肤组织的比值。我们还观察到CD15降低⁺CD11b⁺HLA-DR^-CD49^-不同级别人类基底细胞癌样本与正常皮肤的细胞(中性粒细胞)比率。其他免疫细胞比值无组间差异。在小鼠模型中，我们测试了K14CreER/SmoM2和K14CreER/Ptch1KO转基因小鼠，它们在三苯氧胺处理后在基底角质形成细胞中表达一种构成性活性的平滑突变蛋白SmoM2，导致配体独立的Hedgehog信号通路激活。如图所示4 (b)，可观察到类似的免疫细胞浸润模式的改变。增加CD11b⁺CD14⁺HLA-DR⁺单核/巨噬细胞比值和a降低CD11b⁺CD15⁺HLA-DR^-CD49^-小鼠基底细胞癌模型标本中细胞(中性粒细胞)比例与对照组比较。这些结果表明，与正常皮肤相比，基底细胞癌CD45的浸润程度较高⁺免疫细胞，主要是CD45⁺免疫细胞群是CD11b⁺CD14⁺CSF-1R⁺单核/巨噬细胞系的细胞。

2．5．p75NTR/proBDNF过表达调节小鼠模型中的免疫微环境

人们普遍认为p75NTR/proBDNF在肿瘤进展过程中调节免疫微环境中发挥了重要作用。为了探讨p75NTR/proBDNF是否在BCC免疫微环境中发挥调节作用，我们对p75NTR激动剂BNN27治疗的BCC小鼠模型进行了活检。如图所示5(一个)- - - - - -5 (d)， NK细胞(CD3-CD49b⁺NK1.1⁺)、B细胞(CD3^-CD19⁺B220⁺)和T细胞(CD3⁺细胞受体⁺)组间无统计学差异。过表达p75NTR/proBDNF可显著改变巨噬细胞、中性粒细胞和CD8⁺T细胞的渗透。具体来说，是下调肿瘤相关巨噬细胞(CD11b)⁺F4/80⁺Ly6C^-Ly6G^-MHCII⁺)、中性粒细胞上调(CD11b⁺F4/80^+/-Ly6C⁺MHCII⁺CD8 T细胞(CD3 .⁺CD8⁺)在p75NTR/proBDNF过表达组中可见。

从理论上讲，活化的巨噬细胞将极化为两种不同的表型，并在免疫系统中发挥不同的作用。经典活化的巨噬细胞(M1极化)介导炎症反应，提高肿瘤的杀伤能力。另外，激活的巨噬细胞(M2极化)可能有助于组织修复、肿瘤进展和持续感染。为了探讨p75NTR/proBDNF过表达条件下巨噬细胞的极化活性，我们分析了M1和M2特异性细胞因子。如图所示5 (e)时，极化率变化为m1样而非m2样。这些结果表明，p75NTR/proBDNF在调节基底细胞癌免疫微环境中具有重要作用。

3.材料和方法

3．1.道德声明

本实验方案经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准。

３．２．人体肿瘤和正常皮肤组织采购

人基底细胞癌样本来源于新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科的手术。在新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科，从新鲜切除的拒绝移植的皮肤组织中采集正常皮肤样本。所有组织均在切除后24小时内处理。根据经批准的人类研究委员会(CHR)协议，所有人体组织的使用都没有标识符。

3．3．临床前小鼠模型和动物饲养

所有小鼠按照IACUC程序在新疆维吾尔自治区人民医院动物护理屏障设施内饲养。动物设施按照IACUC程序进行管理。生成原位BCC肿瘤细胞系不到十段报告基因的慢病毒感染塑料t - 150生长在培养皿中融合80%,此时他们被胰蛋白酶消化、收获洗1 x在无菌PBS和resuspended无菌PBS的最终浓度10⁷细胞/mL，置冰。 细胞被注射到6-12周龄的野生型雄性C57BL/6小鼠(Charles River)。

3．4．代的慢病毒

用绿色荧光蛋白(GFP)构建p75NTR，即pLKO。使用含有嘌呤霉素抗性基因的载体。为了产生慢病毒，我们在HEK-293T细胞中共表达VSV-G和delta-8.9，然后用PEG-it (System Biosciences)纯化。

3．5.西方墨点法

用免疫印迹法检测坏死转移蛋白，我们用胰蛋白酶消化收集细胞颗粒，用RIPA缓冲液裂解。用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。样品用4% ~ 12%的聚丙烯酰胺凝胶进行检测。用Trans-Blot®Turbo™转移系统(Bio-Rad)将电泳蛋白转移到NC膜上。我们通过5%脱脂乳孵育来阻断非特异性结合，然后用以下一抗孵育膜，包括proBDNF (57220, Cell Signaling Technology (CST))、BDNF (95702, CST)、p75NTR (74921, CST)和Actin (37705, CST)。洗涤膜，用酶标二抗(7076，抗小鼠IgG;7074年,anti-rabbit免疫球蛋白)。感兴趣的蛋白质用化学发光成像(Millipore, Billerica, MA, USA)。

3.6。基因表达分析

根据制造商说明书使用RNeasy Mini Kit (74104, QIAGEN)收集总RNA。用第一链cDNA合成试剂盒(4368814,Applied Biosystems)将提取的RNA逆转录为cDNA。采用SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR仪进行实时PCR。

3.7。细胞死亡分析

HaCaT TE354。T，和ASZ001在ATCC中生长培养。为了确定细胞的死亡情况，将细胞置于48孔板中，并生长到80%汇合处。然后用20 ng/mL TNF (T6674, Millipore Sigma)刺激细胞，并使用细胞死亡标志物-细胞毒红(4632,Essen Bioscience Inc.)进行跟踪。车牌每两小时扫描一次。图像使用IncuCyte分析仪(Essen Bioscience)进行分析。

3.8。流式细胞术

对于人类样本，来自恶性BCC和正常皮肤组织的单个细胞的制备方法如下:将组织完全切碎，然后在2.0 mg/mL胶原酶a (Roche)和50单位/mL DNase I (Roche)的混合溶液中37℃裂解45分钟。然后细胞被70过滤μM尼龙过滤器和离心 ，然后用PBS (1x)冲洗。然后将200万细胞置于由1:20稀释的Fc受体结合抑制剂(eBioscience)和1:500活/死水染色剂(Invitrogen)稀释的PBS溶液中孵育。然后细胞与前面描述的荧光标记单克隆抗体在FACS缓冲液中孵育(DPBS中的2%胎牛血清)。4℃孵育30分钟后，用FACS缓冲液洗涤1次，4℃用4%福尔马林固定30分钟，用FACS缓冲液洗涤1次，然后在FACS缓冲液中重悬。样本在LSRII流式细胞仪上运行(BD Biosciences)。使用FlowJo软件v9.5执行门控策略以识别特异性免疫细胞群。采用GraphPad Prism软件进行统计分析。

小鼠标本中，恶性基底细胞癌和正常皮肤组织的单细胞按上述方法制备。细胞在PBS +大鼠抗小鼠CD16/CD32单抗(BD Biosciences) 1:200 +活/死水染色(Invitrogen) 1:500冰上孵育30分钟。然后细胞与荧光团标记的抗小鼠单克隆抗体在4°C下孵育30分钟，浓度为FACS缓冲液中稀释的制造商推荐浓度:CD45-PE-Cy7 (30-F11, eBioscience)， CD3e-PerCP710 (17A2, eBioscience)， CD69-FITC (H1.2F3, Biolegend)， CD4-PE (GK1.5, eBioscience)， CD25-APC-780 (PC61.5, eBioscience)， CD8a-APC (53-6.7, eBioscience)，γδTCR-PE-Cy5 (GL3, eBioscience)， NK1.1-PE (PK136, eBioscience)， CD49b-APC (DX5, eBioscience)， CD49b-PerCP-Cy5.5 (DX5, Biolegend)， CD19-Alexa700 (6D5, eBioscience)， CD19-PerCP-Cy5.5 (6D5, Biolegend)， B220-Qdot655 (RA3-6B2, eBioscience)， CD11b-Alexa700 (M1/70, eBioscience)， CD11c-APC-780 (N418, eBioscience)， Ly6G-PE (1A8, eBioscience)eBioscience)、CD206-FITC (MR5D3, eBioscience)、PDCA-1-PE (eBio927, eBioscience)和CD103-FITC (2E7, Biolegend)。4℃孵育30分钟后，用FACS缓冲液洗涤1次，4℃用4%福尔马林固定30分钟，用FACS缓冲液洗涤1次，然后在FACS缓冲液中重悬。

4.讨论

目前基底细胞癌的临床难点主要集中在晚期基底细胞癌，包括转移性基底细胞癌和局部难治性基底细胞癌[16］．虽然这些病例被认为是罕见的恶性肿瘤，但令人沮丧的预后仍然需要相当多的临床和基础科学的关注。从临床方面来看，近年来各种出版物强烈建议多学科肿瘤委员会会诊。局部治疗方案和全身治疗方案包括以铂为基础的化疗，应相应地选择平滑抑制剂[17，18］．然而，迄今缺乏客观的治疗标准或强有力的循证医学建议。广受欢迎的平滑抑制剂Vismodegib也受到其明显不良反应的限制[19，20.］．这些事实使得对aBCC的进一步生物学认识仍有很大的需要。在本研究中，我们发现在BCC样本和细胞系中proBDNF/p75NTR表达下调。体外研究表明，加入外源proBDNF可抑制BCC肿瘤的发生。此外，proBDNF/p75NTR过表达可导致BCC细胞凋亡和坏死活性增加。由于前期研究表明，proBDNF/p75NTR信号是一个重要的免疫相关调节因子。我们分析了基底细胞免疫细胞浸润，发现巨噬细胞是基底细胞特异性浸润免疫细胞之一。proBDNF/p75NTR过表达与m1样极化率增加相关，与m2样极化率不变相关。

BDNF作为神经营养因子家族的重要成员，是在大脑中合成的蛋白质，广泛分布于中枢和外周神经系统[6，21］．BDNF广泛参与多种生理过程，包括大脑发育、稳态和免疫调节[10，22］．生理BDNF功能的中断与神经退行性变、神经性疼痛、精神疾病、乳腺癌、卵巢癌和胃癌相关[23- - - - - -26］．然而，BDNF在皮肤癌中的作用尚不清楚。我们的结果表明，proBDNF/p75NTR可能是一个BCC抑制因子。此外，体外proBDNF治疗可逆转BCC肿瘤的发生。

坏死是一种炎性细胞的溶解性死亡。据报道，在癌症中，坏死是一种抗肿瘤活性[27，28］．坏死反应可在癌症开始、进展和转移中发现[27- - - - - -29］．然而，坏死也会抑制骨髓细胞介导的适应性免疫反应，从而促进癌症进展[30.，31］．最近的一项研究表明，通过特异性地激活坏死通路来增强肿瘤微环境中死亡细胞的免疫原性是一种有效的治疗策略，可以保证进一步的临床应用[31］．

我们的研究表明，p75NTR/proBDNF在基底细胞癌进展过程中控制免疫微环境至关重要。p75NTR/proBDNF的这种免疫相关功能与其对坏死的调节作用密切相关。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

所有作者声明，本手稿没有任何利益冲突。

致谢

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(no . 2017D01C108)。

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