文摘

背景/目的。毛细支气管炎是一种常见的急性下呼吸道传染病的婴儿。呼吸道合胞病毒(RSV)感染是主要原因之一。细支气管炎会导致显著增加在儿童哮喘的发病率,但细支气管炎转换成哮喘的机制仍不清楚。这项研究旨在调查NF -的作用κB / IL-33 / ST2轴RSV-induced急性细支气管炎。方法。共40个婴儿被诊断为急性细支气管炎感染RSV,和20名正常婴儿被纳入本研究。BALB / c小鼠(6 - 8周大, g)作为研究模型。酶联免疫吸附试验(ELISA),实时定量PCR,免疫印迹分析,免疫组织化学染色和流式细胞术分析相关指标进行检查。结果。IL-33水平显著升高,Th1 / Th2在婴儿急性毛细支气管炎后比例失衡。在体内研究中,我们发现,NF -κB / IL-33 / ST2轴是介导的Th2细胞因子水平,BAL RSV引起的细胞数量。RSV引起的急性毛细支气管炎后小鼠模型是减毒抑制NF -κB / IL-33 / ST2途径。此外,我们还证实,巨噬细胞IL-33的重要来源,由NF -κB通路RSV-induced老鼠。结论。我们证实,抑制NF -κB / IL-33 / ST2轴可以减弱急性细支气管炎RSV感染。我们的研究结果不仅证明IL-33抗体的潜在作用衰减RSV-induced肺损伤,也更好的预防提供新的见解RSV-induced哮喘调停NF -κB / IL-33 / ST2轴。

1。介绍

哮喘是一种呼吸道疾病,包括各种炎症介质和细胞因子,已严重威胁人类健康(1]。众多研究表明,病毒感染可以直接入侵75 - 300μ米细支气管,引起坏死和剥落的细支气管上皮细胞,周围淋巴细胞浸润,腺体增生,粘液分泌增加,缩小甚至堵塞的腔2,3]。反复或持续的病毒感染最终导致慢性气道炎症和气道hyperreflux [4]。

呼吸道合胞病毒(RSV)的主要病原体在婴幼儿毛细支气管炎和肺炎,哮喘的主要原因之一,年轻患者(5]。先前的报道表明,RSV感染占80 - 85%和75 - 80%的哮喘病例在儿童和成人,分别为(6,7]。RSV能诱发哮喘的另一个重要原因是,它可以激活T辅助2 (Th2)闲暇的细胞因子il - 4、IL-5, il - 10和破坏人体的免疫平衡(8,9]。最近的研究发现,由Th2细胞分泌细胞因子的治疗能有效缓解急性哮喘发作的症状,而细胞因子分泌的减少Th1细胞没有明显缓解哮喘的症状(8,10]。这些研究结果丰富和改善哮喘的经典Th1 / Th2平衡理论。

IL-33是最近发现的促炎细胞因子与多种生物功能。它属于il - 1与分子量约1800家庭和人类9 p24.1位于染色体11]。目前的研究表明,IL-33不仅诱发Th0细胞分化成Th2细胞也促进Th2-related的分泌细胞因子il - 4, IL-5, il - 6和il - 10在体外和体内12,13]。在儿童哮喘的研究,发现Th2细胞的比例和血清的IL-33水平显著增加,这与自身抗体的水平呈正相关,IgE体内(14]。

抑制肿瘤发生2 (ST2)受体能具体地绑定到IL-33两种形式;一个是transmodel ST2 (ST2L),主要表达在Th2表面,另一个是可溶性ST2,可以与ST2L和绑定到IL-33竞争,导致的减少IL-33函数(13]。当ST2 IL-33相结合,它激活了NF -κB信号通路,促进Th2细胞因子的释放il - 4、IL-5, il - 10 (15]。然而,IL-33 / ST2和NF -的作用κB在RSV-induced支气管炎仍不清楚。

在我们目前的研究中,我们探索的表达IL-33急性细支气管炎婴儿血清和肺组织Th1 RSV-induced老鼠和研究它的作用/Th2细胞比婴儿和RSV感染的小鼠在急性细支气管炎。此外,我们表明,NF -κB / IL-33 / ST2轴是参与RSV-induced急性细支气管炎。我们的研究结果表明,IL-33 ST2, NF -κB可以作为治疗靶点治疗RSV感染哮喘。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

呼吸道合胞病毒(RSV)是购自Hipower制药(Hipower制药、广州、中国)。胎牛血清(的边后卫)和杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)获得GIBCOBRL (Gibco、钙、美国)。Anti-IL-33抗体和anti-IgG获得圣克鲁斯生物技术(SantaCruz、钙、美国)。可溶性ST2 (sST2)购买的注册机(南京凯基生物,中国)。吡咯烷氨荒酸铵盐(PDTC)获得Beyotime (Beyotime、上海、中国)。抗体的p50 p65、ST2 GAPDH是购自细胞信号技术(CST、钙、美国)。Lipofectamine 2000和Opti-MEM从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。试剂盒获得从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。免疫印迹检测化学发光试剂购买从热科学(热科学、钙、美国)。

2.2。研究对象

共有40个婴儿从常州第二人民医院、南京医科大学附属医院从2016年到2018年被诊断出患有急性细支气管炎感染RSV和20名正常婴儿被纳入本研究。急性毛细支气管炎的诊断是基于最新的诊断指南(16]。的静脉血液样本选择的病例在治疗和用于以后的实验。所有病例被排除在先天性心脏病、心肺发育不良,免疫缺陷和其他严重的疾病。本研究经伦理委员会批准常州第二人民医院、南京医科大学附属医院(没有。SPH1904880)。书面知情同意是来自父母的主题。

2.3。动物实验

BALB / c小鼠(6 - 8周大, g)被随机分为六组:正常控制(NC)、呼吸道合胞体病毒(RSV), anti-IgG + RSV anti-IL-13 + RSV sST2 + RSV, PDTC + RSV。协议的RSV-induced小鼠模型是如前所述17]。RSV感染组小鼠腹腔内注射麻醉的3%戊巴比妥钠0.1毫升/公斤,紧随其后的是鼻滴RSV的100毫升106空斑形成单位连续6天,而对照组的老鼠被鼻滴相同的麻醉剂量的生理盐水。anti-IgG + RSV, anti-IL-33 + RSV sST2 + RSV, PDTC + RSV组使用anti-Rabbit IgG抗体和anti-Mouse IL-33抗体(30μ鼻内注入100 g /鼠标)μl 2 h,利巴韦林,sST2 PTDC腹腔内注射2 h与RSV挑战前连续3天。

所有的老鼠死亡,3日取样,5和7天后RSV感染;本研究经伦理委员会批准常州第二人民医院、南京医科大学附属医院(没有。cz0004 - 1732)。

血清样本取自小鼠的脾脏后执行,和红细胞被移除。细胞悬浮在10毫升的哈佛商学院清洗缓冲和血细胞计数器计数。在4°C的细胞悬液离心10分钟200 g。然后,上层的丢弃,沉淀是混合的比例每10 0.9毫升的mac电脑的缓冲8细胞。0。l毫升的磁珠(CD90)添加每10细胞和孵化15分钟在4°C为了提取总T细胞。离心后,细胞悬液在4°C, 200克10分钟,足够的mac缓冲区添加到沉淀达到10的浓度8细胞/毫升,拌匀。细胞通过30μ尼龙网或40μm preseparation膜。冲洗过滤器与0.1 ~ 0.4毫升的mac缓冲区。将细胞放入上面的示例autoMACS渠道。选择possel程序,标记细胞会洗提从正的车道。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)

IL-33水平的il - 4、il - 10 - 2,正无穷γ,ST2婴儿血清检查特定的ELISA试剂盒(云克隆集团,武汉,中国)根据制造商的指示。

2.5。的提取和检测支气管肺泡灌洗液(BALF)

PBS(1毫升)注入分离后的气管周围的结缔组织和重复3次,冲洗PBS是恢复。收集灌洗液对炎性细胞计数,并存储在-20°C灌洗液细胞流式细胞术分析检测。

2.6。实时定量聚合酶链反应

肺组织的总RNA提取利用试剂盒(表达载体)。上标2(英杰公司)是用来进行逆转录合格400 ng根据制造商的指示。实时定量PCR, SYBR绿色主(罗氏)和abi - 7900混合系统被使用,和GAPDH是加载控制。表列出了相关基因的引物1。

表1
序列的引物PCR。
2.7。免疫印迹分析

蛋白质样本准备,其次与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质随后被转移到PVDF膜。为进一步检测相关的基因,使用下面的抗体:我κB p65 p50、ST2 GAPDH。膜被阻塞在5% BSA在室温下2小时前一夜之间孵化主要抗体在4°C。膜清洗10分钟三次TBST然后用二次抗体培养(1:5000)(CST、钙、美国)在-20°C 2 h。然后,膜与TBST 20分钟洗了三遍。这些墨迹与发射极耦合逻辑+检测试剂(美国沃尔瑟姆热科学)。

2.8。免疫组织化学染色

分别在不同的治疗组肺组织收集,沾染了一只兔子单克隆anti-mouse IL-33, p65, ST2抗体在室温下过夜,水洗,然后用二次孵化Ab (CST、钙、美国)2 h,并再次清洗。具体细节步骤进行根据民建联衬底工具包(美国马热科学)。

2.9。流式细胞术分析

外周血样本和单个细胞悬液从小鼠肺组织收集。FITC、anti-CD30 anti-CD49, CD11抗体中添加样品根据指令的浓度。100 P1抗体系统完全悬浮细胞和孵化冰上30分钟条件下的黑暗。添加2%的边后卫和PBS 1毫升/管,轻轻旋转,1500 rpm, 4°C离心5分钟,丢弃上层清液;重复这一步骤。存储在2%的边后卫。使用FlowJo PBS悬细胞检测和分析软件(版本7.6.5)。

2.10。统计分析

连续变量被显示为“ 。“为多个比较,使用SPSS 22.0软件进行单向方差分析(SPSS, Inc .)、美国),和 值< 0.05被认为是显著的统计。

3所示。结果

3.1。IL-33水平显著升高,Th1 / Th2比率失衡后RSV感染婴儿

据报道,Th2细胞因子il - 4和il - 10的生产是由IL-33 [18],Th2免疫反应的病机入手,描述了影响呼吸道合胞病毒(RSV)急性细支气管炎19]。首先,血清中IL-33急性毛细支气管炎的表达了婴儿感染RSV ELISA测定;我们发现IL-33浓度在真空断路婴儿正常受试者相比均有显著增加(图1(一))。急性毛细支气管炎引起的il - 4和il - 10水平增加(数据1 (b)和1 (c)),但降低程度的干扰素-γ和2(数据1 (d)和1 (e))。我们还研究了Th1、Th2细胞的比率在降低外周血比正常婴儿急性毛细支气管炎的流式细胞术(图1 (f))。此外,急性毛细支气管炎患儿血清有更高级别的2.87倍(sST2)比正常情况下(图1 (g))。ST2蛋白表达呈正相关( , )急性毛细支气管炎病例(图IL-33生产1 (h))。

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IL-33表达升高,Th1 / Th2婴儿急性毛细支气管炎的比例失衡。(a) ELISA试验用于检测血清中的IL-33的生产。(b, c) Th2-related细胞因子il - 4和il - 10的水平被ELISA试验检查。(d, e)细胞活素Th1-related和正- - 2的水平γ被ELISA试验检查。(f)细胞流式细胞仪是用来检测Th1 / Th2细胞的比例。(g) ELISA试验用于检测血清中的ST2的生产。(h)相关分析是用来计算IL-33和ST2血清之间的相关性。所有的数据都表示为 ( )。每个值的 , ,和 被认为有显著差异。
3.2。NF -κB / IL-33 / ST2轴是介导的Th2细胞因子水平,BAL RSV引起的细胞数量

以前的研究已经表明NF -κB是参与RSV-induced急性毛细支气管炎的过程(20.),和NF -κ富马酸二甲酯B抑制剂抑制IL-33生产(21),但其具体机制尚不清楚。此外,sST2 ST2的另一种存在方式。据报道,与IL-33 sST2能够开诚布公的结合,干扰的耦合IL-33 ST2,然后抑制IL-33的生物效应。确认是否Th2细胞因子il - 4和il - 10的水平是由IL-33,我们使用anti-IL-33抗体通过鼻内注入30μg /鼠标2 h与RSV挑战前连续3天(14、15和16)。免疫印迹分析表明,ST2的丰度,导出κ英航,p-p65 p-p50都RSV引起的,和ST2丰富治疗后明显抑制anti-IL-33抗体之前公开RSV。然而,大量的我κ英航,p65 p50 anti-IL-33 + RSV组没有明显减少(图2(一个))。Th2细胞因子il - 4和il - 10的mRNA表达升高RSV的肺组织明显减少anti-IL-33 + RSV组(数字2 (b)和2 (c))。此外,IL-33抗体强烈抑制球细胞激活RSV(图2 (d))。为了进一步验证是否有NF -之间的关系κB和IL-33,我们使用NF -κB特定抑制剂(PDTC)注入小鼠前2 h RSV激活。如数据所示2 (e)和2 (f),ST2和mRNA表达的蛋白质丰度IL-33 RSV引起的小鼠肺组织中显著升高,抑制PDTC + RSV组。符合IL-33抗体的作用,Th2细胞因子il - 4和il - 10的mRNA表达升高RSV的肺组织也显著抑制PDTC + RSV组(数字2 (g)和2 (h))。此外,PDTC强烈抑制BAL治疗细胞激活RSV(图2(我))。此外,il - 4和il - 10(数据的水平2 (j)和2 (k)(图),BAL细胞2(左))RSV组升高显著抑制RSV + sST2组。然而,丰富的IL-33和NF -κB (p-p50 p-p65和导出κBa)增加RSV组中没有抑制sST2 + RSV组。

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NF -κB / IL-33 / ST2轴是介导的Th2细胞因子水平,BAL RSV引起的细胞数量。(一)免疫印迹分析检查导出大量的电κ英航、ST2 p-p65, p-p50。(b, c) rt - pcr分析被用来检查的mRNA表达Th2-related IL-33抗体治疗后细胞因子il - 4和il - 10。(d)炎性细胞数量的支气管肺泡灌洗液IL-33抗体治疗后。(e) ST2蛋白质丰度进行检测免疫印迹分析。(f) IL-33 mRNA表达在肺组织中被rt - pcr检测。(g h) rt - pcr分析被用来检查的mRNA表达Th2-related PDTC治疗后细胞因子il - 4和il - 10。(我)炎性细胞数量的支气管肺泡灌洗液PDTC治疗后。(j, k) PCR分析被用来检查的mRNA表达Th2-related sST2治疗后细胞因子il - 4和il - 10。(左)炎性细胞数量的支气管肺泡灌洗液sST2治疗后。所有的数据都表示为 ( )。每个值的 , ,和 被认为是显著的差异。
3.3。RSV引起的急性毛细支气管炎后小鼠模型是减毒抑制NF -κB / IL-33 / ST2途径

进一步证实NF -的作用κB / IL-33 / ST2途径在小鼠模型RSV-induced真空断路,免疫组织化学染色进行了这项研究。代表IL-33、ST2 p65疣状在saline-exposed检查控制老鼠(NC)和RSV-treated老鼠(RSV)。免疫染色结果表明,IL-33的丰度,ST2, p65都增加了RSV所致急性毛细支气管炎的NC组(图3(一个))。此外,他染色试验表明气管RSV显著增厚壁,细胞间隙扩大,炎性细胞浸润和增强anti-IL-13减毒的抗体,PDTC sST2治疗,典型地(图3 (b))。

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图3
RSV-induced小鼠模型是减毒后抑制NF -κB / IL-33 / ST2途径。(a)免疫组织化学分析IL-33、ST2和p65丰富saline-exposed控制老鼠(NC);RSV-treated老鼠(RSV)进行(原始放大×400,100比例尺μ米)和得分图(右)。(b))染色法分析了不同组小鼠肺组织的Image-proplus 6.0(原始放大×400)。并给出了数据 并通过学生的进行了分析 - - - - - -测试(NC组, ;RSV组, ; ; ; ; )。每个值的 , ,和 被认为是显著的差异。
3.4。巨噬细胞是IL-33的重要来源,是由NF -κB通路RSV-Induced老鼠

进一步澄清后增加IL-33分泌的主要细胞来源RSV感染,炎症细胞在BAL分类和统计。我们发现落下帷幕小鼠肺泡巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的数量显著增加RSV感染后(图4(一));流式细胞仪分析显示巨噬细胞的数量是最大的,达到峰值后的第五天RSV感染(图4 (b))。我们进一步验证是否NF -κB通路参与RSV-induced巨噬细胞数量和IL-33生产在巨噬细胞;我们发现巨噬细胞的数量和表达IL-33 RSV组增加减少PDTC + RSV组(数字4 (c)和4 (d))。

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图4
巨噬细胞是IL-33的重要来源,是由NF -κB通路RSV-induced老鼠。(a)肺泡巨噬细胞,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞落下帷幕的老鼠。(b)流式细胞术分析排序RSV感染后肺泡巨噬细胞在不同的时间。(c)流式细胞术分析肺泡巨噬细胞在不同时间进行排序后RSV + PDTC治疗。在肺泡巨噬细胞(d) IL-33表达式RSV + PDTC治疗后在不同的时间检查了rt - pcr分析。所有的数据都表示为 ( )。每个值的 , ,和 被认为是显著的差异。
3.5。是通过抑制NF - RSV-Induced IL-33表达式κB通路体外

为了进一步验证NF -的作用κB通路在生产IL-33 RSV感染的巨噬细胞,RAW264.7巨噬细胞被用于这项研究。rt - pcr分析表明,IL-33表达式被RSV感染24小时后明显升高和时间的方式(图5(一个))。与上面的结果一致,蛋白质丰富的我κ英航,p65 p50也增加在RSV-induced巨噬细胞(图时间的方式5 (b))。此外,IL-33增加RSV活化RAW264.7细胞的表达明显被PDTC(图5 (c))。

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是通过抑制NF - RSV-induced IL-33表达式κB通路体外。(一)rt - pcr分析检查IL-33 RAW264.7细胞表达RSV-induced后在不同的时间。(b)免疫印迹分析检查我的丰度κ英航,p65 p50。(c) IL-33表达式在RSV + PDTC治疗后巨噬细胞在不同的时间检查了rt - pcr分析。所有的数据都表示为 ( )。每个值的 , ,和 被认为是显著的差异。

4所示。讨论

呼吸道合胞病毒感染会加重气道炎症,促进哮喘的发生和发展22]。如果不采取有效的治疗措施,急性毛细支气管炎的孩子可能患有哮喘反复喘息和发展在未来,严重影响肺功能和带来沉重的精神和经济负担,他们的家庭和社会23]。

IL-33能促进寄生虫感染和减轻动脉粥样硬化通过促进Th2免疫反应(11]。RSV引起的气道炎症的过程中,IL-33及其特定的受体ST2显著增加(24]。然而,IL-33 / ST2通路的作用RSV-induced急性细支气管炎及其分子机制尚不清楚。在我们的研究中,我们表明,IL-33 Th2-related细胞因子il - 4和il - 10的水平在RSV感染血清中急性毛细支气管炎的婴儿明显增加。此外,细胞活素Th1-associated和正- - 2γ和Th1 / Th2细胞比例明显减少婴儿血清急性细支气管炎。此外,RSV-induced Th2-related肺组织中细胞因子il - 4和il - 10减少IL-33抗体治疗。此外,我们还发现,在肺组织炎症细胞的增加被RSV感染被IL-33抗体抑制。这些数据表明,IL-33扮演着一个重要的角色在急性细支气管炎婴儿感染RSV。

ST2是il - 1受体的家族之一,广泛表达于多种细胞,特别是肥大细胞和辅助T细胞(25]。没有炎性刺激IL-33只存在于炎症和免疫细胞的细胞核。在许多疾病过程,激活和释放IL-33可以通过结合ST2发挥重要作用[26,27]。此外,可溶性ST2 (sST2)作为诱饵受体的IL-33可以直接绑定到IL-33和抑制IL-33的生物功能28,29日]。在这项研究中,我们证实了ST2基因表达呈正相关,在急性细支气管炎IL-33生产情况。IL-33抗体和sST2可以逆转RSV-induced Th2-related细胞因子和肺部炎症损伤。此外,ST2丰富可以抑制体内和体外IL-33抗体治疗。我们的研究结果表明,IL-33 / ST2通路介导RSV-induced急性细支气管炎和可能的潜在目标预防哮喘急性毛细支气管炎后婴儿。

多种细胞可以分泌IL-33后刺激炎症。除了多发地细胞如上皮细胞和成纤维细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞也可以刺激后分泌IL-33 [30.]。近年来,越来越多的证据表明,先天免疫细胞可能是一个重要的IL-33呼吸道病毒感染的过程中(30.]。通过流式细胞仪分析,我们发现,炎症细胞显著增加RSV感染小鼠后,主要是巨噬细胞,IL-33表达式在巨噬细胞明显升高。此外,我们还发现,IL-33 RSV引起的抗体可以减少巨噬细胞的数量。这些结果表明,RSV增加巨噬细胞的数量和导致IL-33分泌的增加;IL-33也可以进一步促进巨噬细胞的增加。

尽管证据表明通过NF - IL-33发挥生物学作用κB通路(20.),IL-33抗体治疗没有抑制的表达NF-pathway RSV引起的我们的研究,我们推测,NF -κB通路的抑制作用不是由IL-33抗体RSV-induced肺损伤。有趣的是,我们发现NF -κB抑制剂可以减少RSV-induced肺损伤小鼠,我们还发现,NF -κB抑制剂可以减少大量的IL-33体内和体外。这一发现表明,NF -κB途径主要是参与的过程RSV-induced IL-33分泌在老鼠身上。

总之,我们证实了NF -κB / IL-33 / ST2轴是介导的急性细支气管炎RSV感染。我们的研究结果不仅证明IL-33抗体的潜在作用衰减RSV-induced肺损伤,也更好的预防提供新的见解RSV-induced哮喘调停NF -κB / IL-33 / ST2轴。

数据可用性

所有的数据收集和分析进行了双盲和支持下常州第二人民医院、南京医科大学的附属医院。

的利益冲突

没有利益冲突。

作者的贡献

梨纹张设计并进行体内实验,分析数据,并写了手稿。渔湾,梁妈妈负责收集临床血液样本,检测炎症标记物;他们也负责体外研究。徐业界参与了动物实验。Baojin程设计和监督执行的研究手稿编辑。梨纹张和渔湾的贡献同样这项工作。

确认

本研究支持的研究项目由江苏省卫生和计划生育委员会(没有。H201547),常州城市的重大科技项目卫生和计划生育委员会(没有。ZD201612),南京医科大学的科技项目(2017号njmu042),中国国家自然科学基金(81700500),和科学的应用基础研究项目,技术部门常州市(CJ20160031)。

补充材料

Uncropped免疫印迹的形象。(补充材料)