去甲肾上腺素增强有氧糖酵解，可能是胃癌免疫治疗的预测因子

摘要

目标/背景和目标．胃肠道富含神经递质，在胃肠道肿瘤的发生和发展中起重要作用。我们的目标是探讨神经递质在胃癌中的功能，并确定未来治疗胃癌患者的合适靶标。方法．在胃癌组织和配对正常组织中检测单胺类神经递质，并使用cancer Genome Atlas鉴定差异表达的去甲肾上腺素降解酶和合成酶。采用实时荧光定量PCR和海马法检测去甲肾上腺素对胃癌细胞糖酵解的影响。免疫组化分析MAOA在癌组织中的表达，并与患者PET-CT SUVmax值等临床病理特征进行比较。结果．胃癌组织中去甲肾上腺素水平明显升高，而去甲肾上腺素降解酶MAOA和MAOB低表达。高去甲肾上腺素水平与激活的糖酵解有关。肿瘤组织中MAOA或MAOB表达水平与患者PET-CT SUV max值、PD-L1等免疫治疗评价指标及微卫星状态密切相关。结论．去甲肾上腺素在胃癌组织中表达高于正常组织，其表达水平与患者糖酵解水平相关。去甲肾上腺素降解酶MAOA和MAOB在肿瘤组织和正常组织中表达差异显著，缺失或低表达可能预测胃癌患者的免疫治疗结果。高去甲肾上腺素水平伴代谢异常可能更适合代谢靶向治疗或免疫治疗。

1.介绍

以往的研究表明，神经递质与人类癌症的多种恶性表型有着密切的关系。胃肠道组织中丰富的神经递质参与了胃肠道肿瘤的发生和发展[1- - - - - -3.］．本研究探讨去甲肾上腺素(NE)与患者糖酵解的关系以及NE与免疫特性的关系。

肿瘤细胞代谢与正常细胞中的不同，因为肿瘤微环境呈现缺氧和低pH。由于恶性肿瘤需要快速增殖能量供应，因此厌氧糖酵解提供细胞分裂和增殖的增殖细胞能量和必需品。肿瘤细胞糖酵解在一种有氧环境中也被称为Warburg效应，肿瘤微环境中肿瘤细胞的特殊代谢[4，5］．

既往研究表明，PD-L1表达、EBV感染状态、微卫星状态、肿瘤突变负担与抗pd -1治疗结果相关[6，7］．免疫治疗在胃癌中的应用越来越重要，具有显著的生存益处。免疫治疗也成为晚期胃癌患者除手术治疗、化疗、靶向治疗外的重要治疗手段。

为了探讨胃癌患者肿瘤和正常组织单胺神经递质的差异表达，我们研究了NE及其降解酶单胺氧化酶的差异表达。单胺神经递质NE的表达水平显示与糖酵解活性紧密相关。单胺氧化酶A（MAOA）表达水平也可以在一定程度上预测免疫治疗响应。然而，其未来必须进一步探索胃癌的功能和机制。

2.材料和方法

2．1．免疫组化染色及评分

将所有组织样品固定在磷酸盐缓冲的中性福尔马林中，嵌入在石蜡中，然后切成5 μ米厚的部分。使用针对MAOA (Proteintech)和单胺氧化酶B (MAOB) (Proteintech)的抗体对切片进行免疫组化(IHC)。简单地说，组织切片脱脂，用分级乙醇复水，0.3%过氧化氢孵育30分钟，用10%牛血清白蛋白阻断(Sangon, Shanghai, China)。玻片首先使用抗体在4°C孵育过夜，然后用HRP第二抗体(Thermo Fisher Scientific, Inc.， US)在室温下标记1小时。用DAB底物液(Gene Tech, Shanghai)观察阳性染色，苏木精反染色。所有的切片都用显微镜观察和拍照(德国卡尔蔡司)。

根据阳性染色细胞的比率和强度进行评分，分数由两位高级病理学家独立确定。病理学家的得分以盲目的方式完成[8］．

2.2。HPLC分析

用高氯酸从人胃癌组织和配对的正常组织中提取神经递质。采用高效液相色谱(HPLC)分析多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)和5-羟色胺(5-HT) [9］．神经递质浓度用惠普积分器计算。

2．3.细胞培养及试剂

人胃癌BGC-823和HGC-27细胞系均保存于上海肿瘤研究所仁济医院。所有细胞均在RPMI-1640培养基(北京太阳生物科技有限公司)或F-12培养基(Gibco;根据ATCC协议，并补充10% ( ）胎牛血清(FBS)和1%抗生素(100μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素)，37℃，5% CO，湿化培养箱₂．细胞培养液每2-3天更换一次，更换培养液前用1X PBS冲洗细胞[10.］．在本研究中，上述细胞处理的去甲肾上腺素浓度为100 nmol。

2．4．逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

热循环条件为:60℃34秒，95℃15秒，40个循环。使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific, Inc.)从胃癌组织或胃癌细胞株中提取总RNA，使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara Bio.)进行逆转录。根据制造商的协议。采用SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio.)进行RT-qPCR。，Inc.) using a 7500 Real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific, Inc.). The 2-ΔΔCQ方法（15）用于量化相对基因表达，其标准化为β肌动蛋白(10.］．本研究中使用的引物可以在补充表中找到1．

2．5．TCGA数据库和基因集富集分析

对于TCGA数据库中的450个GC样本(https://cancergenome.nih.gov/)，在415例肿瘤组织和35例正常组织中分析NE合成和降解酶mRNA表达。并对32对肿瘤组织和正常组织进行NE合成和降解酶mRNA表达分析。我们利用基因集富集分析(GSEA)，分析了MAOA和MAOB mRNA表达量最高的100例和表达量最低的100例。http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)来寻找差分信号通路。

2．6．海马实验中的ECAR和OCR测量

根据制造商的说明，使用Seahorse XF96通量分析仪(Seahorse Bioscience)监测体外细胞代谢变化。将BGC-823细胞接种于xf96孔板，PBS和NE刺激24小时。为了评估实时糖酵解速率(ECAR)，糖酵解过程中净质子损失的指标，细胞在无缓冲的培养基中培养，然后依次注射10 mM葡萄糖、1 mM寡霉素(Sigma-Aldrich)和80 mM 2-脱氧葡萄糖(2-DG, Sigma-Aldrich, D8375)。采用序贯注射1mm寡霉素、羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP, Sigma-Aldrich, C2920)、2mm抗霉素A和鱼藤酮(Sigma-Aldrich)评估线粒体呼吸(OCR)。为了达到最大的OCR，抗霉素A和鱼藤酮通过阻断复合物III(泛素:细胞色素b-c复合物)来抑制线粒体呼吸。ECAR和OCR测量均归一化为总蛋白质含量，OCR以pmol /min报告，ECAR以mph/min报告[11.］．

2.7。葡萄糖摄取和乳酸产生的测量

简单地说，将细胞接种到6孔板培养皿中，细胞粘附后饥饿24小时。然后用指定的拮抗剂处理细胞2小时，然后用NE (10 mM)刺激细胞24小时。收集培养基用于测定葡萄糖和乳酸浓度，收集细胞用于蛋白质裂解物。葡萄糖摄取测定使用葡萄糖测定试剂盒(Sigma-Aldrich)进行。葡萄糖消耗由原始葡萄糖浓度减去培养基中测定的葡萄糖浓度来计算。根据制造商的说明，使用乳酸含量测定试剂盒(BioVision, Mountain View, CA)检测培养基中的乳酸含量。结果根据每个样品的总蛋白浓度归一化[11.］．

所有入组患者在纳入研究前均获得书面知情同意，研究按照《赫尔辛基伦理指南宣言》进行。本研究经上海交通大学医学院仁济医院伦理委员会批准。

3.统计分析

使用SPSS 22.0 for windows (IBM)进行统计分析。卡方检验和学生的 -组间比较采用检验法。的值 被认为具有统计学意义。

4.结果

4．1.NE在胃癌组织中高表达

本研究以上海交通大学医学院仁济医院15例胃癌患者为研究对象，分析其神经递质E、NE、DA和5-HT在胃癌组织和正常组织中的表达差异。采用高效液相色谱法检测上述神经递质表达水平。NE在胃癌组织中的表达高于正常组织( ）(图1(一))，而其他神经递质E ( )，5-HT（ )，和da（ )，在肿瘤组织和正常组织中表达无显著性差异(图1 (b)- - - - - -1 (d))．

4．2．单胺类神经递质降解酶MAOA和MAOB在胃癌组织中低表达

为了进一步研究NE合成酶和降解酶在肿瘤和正常组织中的表达情况，我们在TCGA数据库中分析了415例胃癌组织和35例正常胃组织。MAOA ( ）和maob（ ）正常组织的mRNA水平明显高于肿瘤组织(图)2(一个)和2 (b))．其他NE合成酶和降解酶DBH ( )，TH ( )，监护系统( )，和转移酶( ）在胃癌和正常组织中（图2 (c)- - - - - -2 (f))．随后，我们分析了32对肿瘤-正常组织样本中NE合酶和降解酶mRNA在TCGA数据库中的表达情况，以及MAOA ( ）和maob（ ）mRNA水平在正常组织中表现出显着更高的表达，而不是配对肿瘤组织（图2 (g)和2 (h))．对于其他NE合成酶和降解酶DBH（ )，TH ( )，监护系统( )，和转移酶( ）在胃癌与正常配对组织中表达，无显著性差异(图2(我)- - - - - -2（l）)．

4.3。Maoa和Maob表达显示与糖酵解和免疫相关的信号通路密切相关

接下来，我们利用GSEA进一步挖掘TCGA数据库中与MAOA和maob相关的信号通路。我们用GSEA比较MAOA和MAOB mRNA表达量最高的100例和表达量最低的100例，以鉴别其最高和最低组的信号通路差异。对于MAOA，糖酵解途径( ）和干扰素 -γ通路( ）在高表达组和低表达组有显著差异(图3(一个)和3 (b))．关键糖酵解途径和干扰素-γ通路基因在MAOA低表达组中高表达或被激活。MAOB分析的结果和趋势与MAOA分析相同，其中糖酵解途径( ）和干扰素 -γ通路( ）显示出显著差异(图3 (c)和3 (d))．

4．4.NE促进肿瘤细胞糖酵解

为了研究NE对肿瘤细胞糖酵解的影响，我们检测PBS和NE照射后关键糖酵解酶的mRNA表达水平。胃癌BGC-823细胞中，NE治疗组Pkm、Pfkl、Ldha、Eno1、Pgam2 mRNA表达水平显著升高。另一株HGC-27癌细胞中，NE治疗组Pkm、Pfkl、Ldha、Eno1 mRNA表达水平显著升高(图)4(一))．然后采用海马实验检测NE对肿瘤细胞ECAR和OCR的影响。NE处理后，与PBS处理相比，BGC-823细胞EACR升高，OCR降低。在糖酵解方面，NE和PBS处理组的糖酵解能力、ATP产量和最大呼吸量均有显著差异(图)4 (b)和4 (c))．随后，在PBS和NE处理的BGC-823和HGC-27细胞中检测乳酸生成和葡萄糖摄取。在BGC-823和HGC-27细胞中，NE处理组的乳酸生成和葡萄糖摄取比PBS处理组更强(图)4（d）和4（e）)．

4．5.MAOA和MAOB的表达与糖酵解活性呈负相关

考虑到胃癌患者的PET-CT可以代表患者的糖酵解活性，我们使用患者PET-CT图像评估MAOA和MAOB的表达。我们发现病例1的SUVmax值和糖酵解值较高，但肿瘤组织中MAOA和MAOB表达较低。病例2,SUVmax值低，糖酵解低，肿瘤组织中MAOA和MAOB表达高(图)5（a）和5（b）)．为了进一步说明MAOA和MAOB表达与PET-CT SUVmax值的相关性，我们评估了15例术前PET-CT患者。两种MAOA的mRNA表达量( ）和maob（ ）与PET-CT SUVmax值呈负相关(图5（c）和5（d）)．

4.6。MAOA表达与患者临床病理特征的相关性研究

最后，分析52例MAOA表达的胃癌患者的临床病理特征，如PD-L1表达、微卫星状态、TNM分期、病理类型、肿瘤直径等。MAOA高表达21例，低表达31例。低表达maa的患者组中pd - l1阳性患者的比例大于高表达maa的患者组。MAOA低表达组8例，高表达组1例pd - l1阳性。在低maa表达的患者队列中，微卫星状态与PD-L1表现出相同的趋势，因为更大的MSI比率。然而，上述差异不显著( 和 ）(数据6（a）和6（b）)．在TNM分期、病理类型、肿瘤直径分析方面，高表达组与低表达组之间无显著差异( ， ，和 ）(数据6 (c)- - - - - -6 (e))．

5.讨论

单胺类神经递质包括儿茶酚胺和吲哚胺。儿茶酚胺包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E);吲哚胺主要由5-羟色胺(5-HT)组成。本研究检测了DA、NE、E、5-HT在胃正常和肿瘤组织中的表达水平。NE在胃癌组织中高表达，其他单胺类神经递质无明显差异。随后，NE合成酶酪氨酸羟化酶(TH)、多巴脱羧酶(DDC)和多巴胺-β在TCGA胃癌数据库中分析-羟化酶(DBH)、降解酶单胺氧化酶A和B (MAOA和MAOB)、儿茶酚- o -甲基转移酶(COMT)。MAOA和MAOB在胃癌组织中均较正常组织低表达。NE也被称为一种应激神经激素，主要由肾上腺髓质和交感神经释放，来源于氨基酸酪氨酸。根据以前的研究，越来越多的证据表明神经递质NE影响某些癌症类型。长期使用β -阻断药物可降低乳腺癌的复发、进展或死亡率[12.，13.]及恶性黑素瘤[14.，15.］．临床前研究表明，用药物操纵NE的水平或受体会影响实验诱导的癌症。该机制被认为是以下：NE可以通过与已经涉及异常细胞复制的分子途径相互作用，例如P38 / MAPK途径，或通过氧化应激来影响癌症[16.］．

NE与肿瘤微环境中癌细胞存活、增殖、抗凋亡、侵袭、转移和血管生成等多种生物学行为密切相关[17.- - - - - -19.］．为了探索其在胃癌中的潜在通路，我们将ne降解酶MAOA和MAOB分为高表达组和低表达组，寻找潜在的相关信号通路。糖酵解途径和干扰素-γ通路在MAOA和MAOB低表达组中均相对活跃。近年来有神经递质调节葡萄糖代谢的报道。例如，5-HT通过调节有氧糖酵解促进代谢应激下胰腺癌细胞的生长[11.］．另一项研究发现，有氧糖酵解发生在大脑激活期间，并在星形细胞代谢中受到NE的调控和影响[20.]，表明神经递质在正常细胞或肿瘤细胞中在有氧糖酵解中发挥着重要作用。另一项关于NE在前列腺癌中血管素开关的影响的研究表明，NE与其受体结合激活了“血管素开关”，其改变了细胞代谢葡萄糖的方式。从神经中释放的NE的刺激促进内皮细胞以维持使用糖酵解的使用，使前列腺癌从低级癌前阶段迅速进展到高级恶性阶段[21］．在我们的研究中，无论是在胃癌细胞系水平上，还是在癌症患者PET-CT影像学表现上，神经递质NE与糖酵解密切相关。因此，我们推测神经递质NE可能调控胃癌细胞的糖酵解，这一假设还需要进一步的实验来证实。

接下来，本研究探讨神经递质NE表达水平与免疫特性的关系。在以往的黑色素瘤研究中，NE上调肿瘤细胞系中原细胞因子VEGF、IL-8、IL-6和金属蛋白酶的表达[22- - - - - -24］．在卵巢癌中，NE增加IL-8的产生，刺激肿瘤细胞的生长[25］．因此，NE已被证明能影响癌症中的炎症免疫细胞。肾上腺素受体(β-ARs)存在于许多类型的免疫细胞中，如辅助和T抑制淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞[26］．此外,β-AR介导的激素信号通路调节巨噬细胞分化[27，28和抗原特异性T细胞[29］．挡住了β-AR信号通路或化学交感神经切除术有效地消除了NK细胞富集环境的作用，减弱了抗肿瘤作用[30.］．鉴于NE与肿瘤免疫微环境中众多免疫细胞的调控密切相关，我们通过分析相关指标，临床评价其降解酶MAOA的免疫治疗效果。而本研究中，在MAOA表达较低的患者中，PD-L1阳性率及MSI比例较高，两组间差异无统计学意义。可能需要更大的样本量来验证相关性。综上所述，这些发现表明东北因子及其作用正在显现β- 免疫治疗评估中的信号通路。此外，如果毛泽表达低的患者的存活预后差和对免疫疗法的良好反应，则这些患者的预后将得到大大提高。

肿瘤代谢与免疫治疗之间存在着密切的关系，通过干扰肿瘤细胞或免疫细胞的代谢可以增强免疫治疗的效果和反应[31，32］．综上所述，我们检测了单胺类神经递质在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，发现NE在胃癌组织中高表达。接下来，我们分析了TCGA数据库中NE合成酶和降解酶的表达情况，发现两种降解酶MAOA和MAOB的表达存在明显差异。通过GSEA，我们发现MAOA和MAOB高表达组和低表达组的富集都包含糖酵解和干扰素γ途径。随后，我们分析了NE的表达与糖酵解活性的相关性，发现胃癌细胞或组织中NE的高表达可能促进糖酵解。确切的机制需要进一步验证。胃癌组织NE高表达与PD-L1阳性和MSI有一定关系，但由于样本量有限，差异无统计学意义。未来可加大样本量，明确NE表达与免疫治疗效果的相关性，为评价免疫治疗效果提供更多参考指标。其机理还需要进一步的实验研究和验证。

数据可用性

目前研究中分析的TCGA数据库可在癌症基因组图谱网站(https://cancergenome.nih.gov/)及GSEA (http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)．支持本研究发现的其他数据可通过电子邮件(microzhaohao@163.com.)．

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

王阳阳、王书昌和秦阳是共同第一作者。

致谢

作者感谢上海交通大学医学院仁济医院病理科全体成员的帮助。上海交通大学医学工程联合项目(no . YG2019QNB20)。

补充材料

补充表1:本研究使用的引物。（补充材料）

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