1。介绍
根据先前的研究,神经递质有密切与多种人类癌症恶性表型的关系。丰富的神经递质在胃肠道组织参与胃肠肿瘤的发生和发展
1- - - - - -
3]。在目前的研究中,去甲肾上腺素(NE)和糖酵解的病人之间的关系,以及之间的NE和免疫的特点,探讨了。
肿瘤细胞代谢不同于正常细胞,因为肿瘤缺氧微环境礼物和低博士因为恶性肿瘤需要快速扩散的能源供应,无氧糖酵解提供增殖细胞能量和细胞分裂和增殖的关键产品。肿瘤细胞糖酵解在有氧环境中也被称为Warburg效应,在肿瘤微环境中肿瘤细胞的特殊代谢(
4,
5]。
PD-L1表达式,EBV感染状态,微卫星状态和肿瘤突变负担与anti-PD-1治疗的结果是基于以前的研究(
6,
7]。在胃癌免疫治疗的应用变得越来越重要,与重要的生存利益。免疫治疗也已成为一个重要的治疗除手术治疗,化疗和靶向治疗晚期胃癌患者。
探索的微分表达式单胺神经递质在胃癌患者的肿瘤和正常组织,我们调查了东北的微分表达式及其降解酶单胺氧化酶。单胺神经递质不显示的表达水平与糖酵解活性密切相关。单胺氧化酶(MAOA)表达水平也在一定程度上预测免疫治疗反应。然而,它的功能和机制在未来必须进一步探讨胃癌。
2。材料和方法
2.1。免疫组织化学染色和评分
所有的组织样本被固定在磷酸盐中性福尔马林,嵌入在石蜡,然后切成5
μ米厚的部分。免疫组织化学(包含IHC)上执行的部分用MAOA特定抗体(Proteintech)和单胺氧化酶B (MAOB) (Proteintech)。短暂、组织部分deparaffinized,水化与分级乙醇与0.3%过氧化氢30分钟孵化,阻止了10% BSA (Sangon、上海、中国)。幻灯片在4°C首先使用抗体孵化过夜,然后贴上合第二抗体(热费希尔科学,Inc .)、美国)在室温下1 h。阳性染色与民建联可视化衬底液体(基因科技、上海),用苏木精复染色。所有的部分都是观察和拍摄用显微镜(德国卡尔蔡司)。
得分是根据positive-staining细胞的比例和强度,以及分数由两位病理学家独立决定。病理学家的得分是失明的方式(
8]。
2.2。高效液相色谱分析
神经递质被从人类胃癌组织中提取,用高氯酸配对正常组织。多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)和5 -羟色胺(5)分析了高效液相色谱法(HPLC) [
9]。神经递质浓度计算惠普积分器。
2.3。细胞培养和试剂
人类胃癌bgc - 823和HGC-27细胞系都维持在上海癌症研究所,瑞金医院。所有在rpmi - 1640细胞培养介质(北京Solarbio科技有限公司有限公司)或F-12介质(Gibco;热费希尔科学,Inc .)根据写明ATCC协议和补充了10% (
v
/
v
胎牛血清(的边后卫)和1%的抗生素(100
μ青霉素g / ml链霉素和100 U /毫升)在37°C在湿润孵化器有限公司5%2。细胞培养基是每2 - 3天更换一次,1 x PBS是用于细胞洗涤介质所取代(前
10]。去甲肾上腺素的浓度高于细胞治疗是100 nmol在这项研究。
2.4。反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)
热循环条件如下:60°C 34秒和95°C为15秒40周期。胃癌组织的总RNA提取或胃癌细胞系使用试剂盒试剂(热费希尔科学,Inc .)和反向转录使用PrimeScript rt - pcr试剂盒(豆类生物。公司,首先,日本),根据制造商的协议。与SYBR RT-qPCR进行预混料交货Taq(豆类生物。,Inc.) using a 7500 Real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific, Inc.). The 2-
ΔΔCq方法(15)被用来量化相对基因表达,这是标准化的
β肌动蛋白(
10]。引物用于这项研究补充表中可以找到
1。
2.5。TCGA数据库和基因集富集分析
450 GC TCGA样本数据库(
https://cancergenome.nih.gov/),不能合成和降解酶mRNA表达分析35 415年肿瘤组织样本和正常组织样本。和32配对肿瘤组织和正常组织也分析不合成和降解酶mRNA的表达。我们分析了100例mRNA表达最高的和最低的100例mRNA表达MAOA和MAOB通过使用基因集富集分析(GSEA,
http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)找到一个差分信号通路。
2.6。ECAR在海马和OCR测量实验
体外细胞代谢改变与海马XF96通量监测分析仪(海马生物科学),根据制造商的指示。bgc - 823细胞被播种XF96-well板,其次是PBS和NE刺激24小时。实时评估的糖酵解速率(ECAR),净质子损失的指标在糖酵解过程中,细胞与无缓冲的孵化中紧随其后的是10毫米的顺序注射葡萄糖,1毫米寡霉素(Sigma-Aldrich),和80毫米2-deoxyglucose (2 dg, Sigma-Aldrich D8375)。线粒体呼吸(OCR)评估使用顺序注射1毫米寡霉素,羰基氰化物4 - (trifluoromethoxy)苯腙(FCCP, Sigma-Aldrich C2920)和2毫米抗霉素A和鱼藤酮(Sigma-Aldrich)。为了达到最大OCR,抗霉素A和鱼藤酮抑制线粒体呼吸通过阻断复杂III(辅酶q:细胞色素c复杂)。ECAR和OCR测量归一化总蛋白质含量和报道pmoles /分钟为ECAR OCR和英里/小时/分钟(
11]。
2.7。葡萄糖摄取和乳酸生产测量
短暂,细胞被播种到6-well板文化菜肴和饥饿24小时后细胞附着。然后细胞表明拮抗剂治疗,疗程2小时,其次是刺激与NE(10毫米)额外的24小时。的培养基收集测量葡萄糖和乳酸浓度、蛋白质溶解产物和细胞收获。使用葡萄糖测定葡萄糖吸收测定了工具包(Sigma-Aldrich)。葡萄糖消耗被扣除计算测量葡萄糖浓度在中从最初的葡萄糖浓度。乳酸生产中检测到通过使用乳酸测定工具包(BioVision山景,CA)根据制造商的指示。结果规范化的基础上,每个样本的总蛋白浓度(
11]。
书面知情同意之前就从所有登记患者获得他们的包容在这项研究中,和研究进行了符合赫尔辛基宣言的道德准则。本研究瑞金医院伦理委员会的批准,上海交通大学医学院。
4所示。结果
4.1。东北是胃癌组织中高度表达
确定微分单胺神经递质表达在胃癌组织和正常组织,神经递质E, NE、DA,并分析了5 - 15胃癌患者接受手术在瑞金医院,上海交通大学医学院。上述神经递质表达水平测试使用高效液相色谱分析。NE胃癌组织中高度表达高于正常组织(
p
=
0.0036
)(图
1(一)),而另一种神经递质,E (
p
=
0.6835
)、5 (
p
=
0.3472
)和DA (
p
=
0.1654
),显示无显著差异表达在肿瘤和正常组织(数字
1 (b)- - - - - -
1 (d))。
NE胃肿瘤组织中高度表达高于正常组织,而另一单胺神经递质5 - E和DA没有显著的不同。
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4.2。单胺Neurotransmitter-Degrading酶MAOA MAOB显示低表达在胃癌组织中
进一步阐明NE合酶和降解酶的表达在肿瘤和正常组织,415年35岁胃癌组织和正常胃组织,TCGA数据库中进行了分析。MAOA (
p
≤
0.001
)和MAOB (
p
≤
0.001
)mRNA水平明显高于正常组织的肿瘤组织(数字
2(一个)和
2 (b))。没有发现显著差异对于其他NE合酶和降解酶的表达胸径(
p
=
0.0724
)、TH (
p
=
0.9846
),如DDC (
p
=
0.0724
)和COMT的(
p
=
0.6188
)在胃癌及正常组织(数据
2 (c)- - - - - -
2 (f))。随后,我们分析了32配对tumor-normal组织样本为NE合酶和降解酶TCGA mRNA表达数据库,和MAOA (
p
≤
0.001
)和MAOB (
p
≤
0.001
)mRNA水平显示在正常组织表达显著高于成对肿瘤组织(数字
2 (g)和
2 (h))。对于其他NE合酶和降解酶胸径(
p
=
0.0856
)、TH (
p
=
0.2124
),如DDC (
p
=
0.3169
)和COMT的(
p
=
0.4692
)表达在胃癌和正常配对组织,没有显著差异(数字
2(我)- - - - - -
2(左))。
单胺的mRNA水平neurotransmitter-degrading酶MAOA MAOB低在胃癌组织中,而其他的合成酶和降解酶,监护胸径和COMT的没有显著的不同。
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4.3。MAOA MAOB表达式显示了一个密切的关系和糖酵解和免疫细胞信号通路
接下来,我们进一步挖掘TCGA数据库MAOA——通过应用GSEA MAOB-related信号通路。我们比较了100例最高的mRNA表达和最低的100例mRNA的表达MAOA并使用GSEA MAOB确定微分信号通路在他们的最高及最低的组。对于MAOA,糖酵解途径(
p
≤
0.001
)和干扰素-
γ通路(
p
≤
0.001
显著不同的高和低表达组(数字
3(一个)和
3 (b))。关键的糖酵解途径和干扰素-
γ通路基因高表达或激活MAOA低表达组。MAOB分析显示相同的结果和趋势MAOA分析,糖酵解途径(
p
=
0.0320
)和干扰素-
γ通路(
p
=
0.0190
)表现出显著差异(数据
3 (c)和
3 (d))。
MAOA和MAOB显示的表达水平与糖酵解途径的负相关。免疫细胞干扰素γ信号通路的表达水平MAOA和MAOB呈负相关。
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4.4。促进肿瘤细胞糖酵解
调查的影响对肿瘤细胞糖酵解,信使rna表达水平的糖酵解的关键酶——接触PBS和NE后进行测试。关于胃癌细胞株bgc - 823, Pkm, Pfkl, Ldha,三,Pgam2 mRNA表达水平不治疗组明显升高。对于其他HGC-27癌症细胞系,Pkm是Pfkl, Ldha,三、mRNA表达水平明显升高的治疗组(图
4(一))。接下来,海马试验进行测试的效果不ECAR和OCR的肿瘤细胞。不治疗后,EACR增加和OCR减少bgc - 823细胞与PBS治疗。关于糖酵解,糖酵解能力、ATP生产和最大呼吸、NE和PBS治疗组显示显著差异(数字
4 (b)和
4 (c))。随后,乳酸生产和葡萄糖摄取被发现在bgc - 823和HGC-27接受PBS和NE细胞。bgc - 823和HGC-27细胞乳酸生产和葡萄糖摄取更增强东北比PBS治疗组治疗组(数字
4 (d)和
4 (e))。
不表达促进肿瘤细胞糖酵解。有关胃癌细胞株bgc - 823, Pkm, Pfkl, Ldha,三,Pgam2 mRNA表达水平明显升高在PBS不治疗组相比,治疗组。对于其他HGC-27癌症细胞系,Pkm是Pfkl, Ldha,和三、mRNA表达水平明显升高在PBS不治疗组相比,治疗组(a)。NE治疗后,EACR增加显然bgc - 823细胞与PBS治疗。关于糖酵解和糖酵解能力、NE和PBS治疗组显示显著差异(b),不治疗后,OCR减少bgc - 823细胞后与PBS治疗。关于ATP生产和最大呼吸、NE和PBS (c)治疗组显示显著差异。在bgc - 823和HGC-27细胞乳酸生产和葡萄糖摄取能力更加强的不治疗组比PBS治疗组(d, e)。
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4.5。MAOA MAOB表达式是糖酵解活性呈负相关
鉴于磁共振的胃癌患者可能是糖酵解活动的病人,我们评估MAOA MAOB表达式使用患者磁共振图像。我们发现病人案例1,高SUVmax价值和糖酵解,显示低MAOA MAOB表达在肿瘤组织。患者2例,低SUVmax价值和糖酵解,显示高MAOA和MAOB表达在肿瘤组织(数字
5(一个)和
5 (b))。进一步说明了pet - ct机MAOA和MAOB表达之间的相关性和SUVmax价值,我们评估15患者术前磁共振。的信使rna表达水平MAOA (
R
2
=
0.4871
)和MAOB (
R
2
=
0.3439
pet - ct机)负相关与SUVmax值(数字
5 (c)和
5 (d))。
MAOA和MAOB表达水平与糖酵解活动负相关。一个案例显示低MAOA MAOB表达式和高糖酵解活动(a)。另一个例子显示高MAOA和MAOB表达较低的糖酵解活动(b)。MAOA mRNA表达与pet - ct机的SUVmax价值负相关(c)。MAOB mRNA表达与pet - ct机的SUVmax价值负相关(d)。
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4.6。MAOA表达与患者临床病理特征之间的相关性
最后,胃癌患者的临床病理的特点,如PD-L1表情,微卫星状态,TNM阶段,病理类型、肿瘤直径,分析了52例MAOA表达式。21例患者显示高MAOA表达式和31显示低MAOA表达式。低MAOA-expressing病人队列显示更大的比率比高MAOA-expressing PD-L1-positive患者组。八个病人MAOA低表达组和1例高表达组PD-L1-positive状态。微卫星的状态显示,这一趋势在低PD-L1 MAOA-expressing病人群体,因为更大的MSI比率。然而,上述差异不显著(
p
=
0.0670
和
p
=
0.0927
)(数据
6(一)和
6 (b))。TNM阶段、病理类型、肿瘤直径分析,没有发现显著差异之间的高收入和低表达组(
p
=
0.7765
,
p
=
0.4828
,
p
=
0.3937
)(数据
6 (c)- - - - - -
6 (e))。
MAOA表达与患者临床病理特征之间的相关性。MAOA低表达患者的比率更大PD-L1积极性比高和MSI MAOA表达式。关于TNM阶段病理类型、肿瘤直径,没有发现显著的趋势之间的高收入和低表达组。
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5。讨论
单胺神经递质包括儿茶酚胺和吲哚胺。儿茶酚胺包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E);吲哚胺主要包括血清素(5 -)。在目前的研究中,DA的表达水平,NE、E,和5 -胃正常和肿瘤组织中检测到。东北是胃癌组织中高度表达,而另一单胺神经递质没有显著不同。随后,NE合成酶的酶酪氨酸羟化酶(TH)、多巴脱羧酶(DDC)和多巴胺-
β羟化酶(胸径),降解酶单胺氧化酶A和B (MAOA和MAOB),和catechol-O-methyl转移酶(COMT)分析了TCGA胃癌的数据库。MAOA和MAOB显示低表达在胃癌组织与正常组织。不也被称为压力神经激素来自于氨基酸酪氨酸和释放主要来自交感神经和肾上腺髓质。根据先前的研究,越来越多的证据表明,神经递质不影响一些癌症类型。慢性乙型阻断药物导致较低的复发、进展或乳腺癌的死亡率(
12,
13和恶性黑色素瘤
14,
15]。临床前研究表明,操纵水平或受体的药物不影响实验诱发癌症。机制被认为是以下几点:不可能影响癌症的分子途径相互作用已经涉及异常细胞复制,如P38 MAPK通路,或通过氧化应激(
16]。
NE深刻涉及多个生物行为的癌症,包括癌症细胞生存、增殖、抗凋亡、入侵、转移和血管生成,在肿瘤微环境(
17- - - - - -
19]。探索其潜在通路在胃癌,NE-degrading酶MAOA和MAOB被分成高和低表达组找到潜在的相关信号通路在我们的研究中。糖酵解途径和干扰素-
γ途径相对活跃在MAOA和MAOB低表达组。神经递质调节葡萄糖代谢近年来已报告。例如,5 -促进胰腺癌细胞的生长代谢压力下通过调节有氧糖酵解(
11]。另一项研究发现有氧糖酵解发生在大脑活动和监管,并受NE的星形新陈代谢(
20.),这表明神经递质发挥重要作用在正常细胞或肿瘤细胞的有氧糖酵解。另一项研究的影响不能在前列腺癌angiometabolic开关显示不绑定到其受体激活“angiometabolic开关,改变细胞代谢葡萄糖。不释放神经的刺激促进内皮细胞维持糖酵解的使用,使前列腺癌从低级的癌前阶段迅速进展到一个高档恶性阶段(
21]。在我们的研究中,无论是在胃癌细胞株水平或磁共振成像发现对于癌症患者,神经递质是糖酵解过程密切相关。因此,我们推测,神经递质不可能在胃癌细胞,调节糖酵解,还需要进一步的实验来证实这个假说。
接下来,神经递质之间的关系不表达水平和免疫特性是本研究探讨。在先前的研究黑色素瘤,移植protumorigenic细胞因子VEGF的表达,引发,il - 6和metalloproteases肿瘤细胞系(
22- - - - - -
24]。在卵巢癌中,不增加引发的生产,促进肿瘤细胞的生长(
25]。因此,不被证明影响炎症免疫细胞癌症。该项不受体受体(
βars)出现在许多类型的免疫细胞,如辅助和T抑制淋巴细胞,B淋巴细胞,NK细胞,巨噬细胞和树突细胞(
26]。此外,
β-AR-mediated激素信号通路调节巨噬细胞分化[
27,
28)和抗原T细胞(
29日]。挡住了
β基于“增大化现实”技术的信号通路或化学交感神经切除术有效破坏富含NK的环境的影响和变弱的抗肿瘤效应
30.]。鉴于不密切相关的规定许多免疫细胞在肿瘤免疫微环境,我们的相关指标进行了分析免疫治疗的临床评价结果与MAOA降解酶。然而,在这项研究中,患者低MAOA表达式,MSI的积极PD-L1速度和比例高,和两组之间的差异没有统计学意义。可能需要一个更大的样本量来验证相关。总的来说,这些发现表明NE和它的新兴角色
β基于“增大化现实”技术的信号通路在免疫治疗评估。另外,如果MAOA低表达患者生存预后不佳和良好的免疫治疗,这些患者的预后将会大大提高。
肿瘤代谢和免疫治疗之间存在密切的关系,和免疫治疗的效果和反应可以增强通过干扰肿瘤细胞或免疫细胞的新陈代谢
31日,
32]。总之,我们检测到的单胺神经递质表达在胃癌组织和邻近的正常组织,发现是胃癌组织中高度表达。接下来,我们分析了NE合成酶的表达和降解酶,TCGA数据库中,得知这两个酶MAOA退化和MAOB有明显表达差异。通过GSEA,我们发现MAOA的浓缩和MAOB高和低表达组包含糖酵解和干扰素γ通路。之后,我们分析了NE表达和糖酵解活性之间的相关性,发现高不表达在胃癌细胞或组织可以促进糖酵解。确切的机制需要进一步验证。高不表达在胃癌组织中与PD-L1积极性和MSI有一定关系,虽然没有发现显著差异,因为有限的样本大小。在未来,可以增加样本容量澄清不表达和免疫治疗的效果之间的相关性提供更多参考指标来评估免疫疗法的效果。的机制还需要进一步的试验研究和验证。