西尼罗河病毒疫苗设计的T细胞表位选择:在网上保护的分析,与人类基因组功能大,人口覆盖率

文摘

西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)引起使人虚弱和危及生命的人类神经系统疾病。50年前在非洲出现以来,西尼罗河病毒的新菌株,不断扩大地理分布增加了公共健康问题。没有获得许可的针对西尼罗河病毒的治疗,限制有效的感染控制。疫苗是最有效和高效的医疗干预。西尼罗河病毒表位疫苗仍显著underexploited。在这里,我们使用一个选择协议来确定一组守恒prevalidated免疫原性T细胞抗原表位组成的一个假定的西尼罗河病毒疫苗。通过实验验证的西尼罗河病毒免疫原性抗原表位和西尼罗河病毒序列从IEDB检索和西尼罗河病毒变异数据库。集群和多序列比对确定代表序列的一个小子集。蛋白质可变性分析确定进化保守序列,用于选择一组不同的免疫原性T细胞抗原表位的候选人。大和人类白细胞antigen-binding亲和性进行了评估,消除不合适的抗原决定基的候选人。 Population protection coverage (PPC) quantified individual epitopes and epitope combinations against the world population. 3 CD8+ T cell epitopes (ITYTDVLRY, TLARGFPFV, and SYHDRRWCF) and 1 CD4+ epitope (VTVNPFVSVATANAKVLI) were selected as a putative WNV vaccine, with an estimated PPC of 97.14%.

1。介绍

西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)是一种通过蚊子传播的黄病毒导致西尼罗热(疫区)和西尼罗河病毒神经感染性疾病(WNND)鸟类、人类和马(1]。起源于1937年乌干达西尼罗河地区,西尼罗河病毒现在已经成为一个普遍的人类感染。在1990年代中期之前,病毒局限于非洲和欧洲,然后传播到北美、中东、亚洲和西方。两个半百万病例报告在1999年到2010年之间,其中,12000人WNND,导致超过1300人死亡。因此,西尼罗河病毒已成为全球重大公共卫生问题。

西尼罗河病毒感染表现为三种疾病之一:无症状的载体,西尼罗河热(疫区)和西尼罗河神经感染性疾病(WNND) [1]。在最初的蚊虫叮咬之后,3 - 14天到期后的第一个症状,之后迅速发展。无症状携带者占所有病例的75%,有25%呈现与疫区或WNND [2]。疫区是一个温和的自限性疾病,一般表现为发热,不适,肌肉和胃肠疼痛(3]。总体死亡率但在WNND上升到9.6% ~ 4.2%。

西尼罗河病毒是黄病毒属的一部分,包含超过70个病毒和许多人类病原体,包括大量的蚊媒病毒(4]。西尼罗河病毒从受感染的主机通过蚊虫叮咬传播,主要由库蚊种虫害和一定程度上的伊蚊spp。5]。人类和马感染发生在自然传播周期持续的蚊子和鸟类之间(6]。马和人类是“终端”主机,无法使再感染蚊子由于病毒血症(不足4]。

西尼罗河病毒基因组组成的单链RNA nonsegmented积极意义~ 11000核苷酸(7]。是转录成一个多蛋白,由病毒蛋白酶裂解成十成熟的病毒蛋白质:三个5结构部分(C、人口、难民和移民事务局和E)和7个3非结构蛋白元素(NS1, NS2A、NS2B NS3, NS4A, NS4B, NS5)。系统发育分析显示,至少有7个不同的西尼罗河病毒血统(8]。而感染其他血统,爆发重大人类是从血统单独产生1、2和56]。

没有当前fda批准的西尼罗河病毒治疗。减少暴露在蚊子是主要的策略,通过蚊帐、防护服、杀虫剂和呆在室内8]。在缺乏可行的治疗干预措施,有效的疫苗可以提供长期的西尼罗河病毒防护。不存在任何商业载人西尼罗河病毒疫苗(9),但成功的疫苗Flaviviruses-Japanese脑炎病毒密切相关,蜱传播的病毒,和一个有效的黄热病virus-suggest,同时西尼罗河病毒疫苗是可行的(10]。自适应免疫反应促进病毒间隙和控制感染西尼罗河病毒(11]。一些新颖的候选疫苗目前在一期和二期临床试验12西尼罗河病毒),但临床试验面临几个挑战包括迟到或零星的症状,无症状携带者,矛盾爆发,审判物流、老年人及并发症(8]。

唯一的考题西尼罗河病毒灭活疫苗包括最低限度致病性Kunjin病毒潜伏在过氧化氢(9]。人口、难民和移民事务局的血统和E蛋白1和2被利用为亚单位疫苗。血统1和2可以提供对其他血统crossprotection表明一个通用流感疫苗是可行的(13]。最近的方法试图诱导中和抗体,针对高免疫原性抗原。利用成功的马疫苗PreveNile [12),最有前途的当前人类疫苗,黄热病ChimeriVax-WN02,采用17 d骨干将人口、难民和移民事务局和E基因(10]。三个基因突变(L107F、A316V K440R)减毒病毒(13]。

人口、难民和移民事务局,E、NS3 NS4B蛋白质通常ctl的目标(11]。持久的免疫力在第一阶段取得的亚单位疫苗试验使用佐剂和DIII地区的西尼罗河病毒E蛋白(4]。DNA疫苗表达NY99衣壳蛋白产生强大的CD4 +免疫反应显著升高和干扰素- - 2γ水平(12]。E蛋白的疫苗表达域II造就了WNV-neutralising抗体在第一阶段试验(9]。

缺乏现存的西尼罗河病毒疫苗提示我们评估潜在的抗原决定基合奏疫苗作为一种替代方法,利用我们的疫苗设计方法发展。我们已经为这个通过识别假定的丙型肝炎疫苗(14流感(),15],[疟疾16],巴尔病毒[17),结核(18,19),登革热(20.]。通过专注于高度保守的免疫原性抗原表位与广泛的人口覆盖率,我们确定了优化选择prevalidated证明免疫原性的抗原表位。为了避免干扰设计疫苗的免疫原性,我们扩展我们之前在这里工作与人类基因组过滤抗原决定基大。

2。方法

2.1。西尼罗河病毒鉴定CD8 +及CD4 + T细胞抗原表位

实验证实西尼罗河病毒抗原表位(身份证:11082)从免疫检索数据库和分析资源(IEDB) (http://www.iedb.org/)。抗原表位被限制举办“人类”、“T细胞分析”,“积极的化验,”和“任何MHC的限制。“CD8 +、CD4 +数据单独收集。

2.2。采集、处理和西尼罗河病毒多蛋白的结合

所有人类完整的西尼罗河病毒基因组序列变异和血统来自国家生物技术信息中心(NCBI)西尼罗河病毒变异数据库资源(网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/variation/WestNile/)。不完整的和重复的序列被移除。序列是集群使用CD-HIT(网址:http://weizhongli-lab.org/cdhit_suite/cgi-bin/index.cgi?cmd=cd-hit)形成一组有代表性的序列。确认截止0.99。集群序列相乘一致使用肌肉(网址:http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)形成多个序列比对(MSA)。

2.3。抗原决定基序列变异性分析

守恒的抗原表位被确定通过分析MSA的保护,使用蛋白质变异性服务器(pv) [21)(网址:http://imed.med.ucm.es/PVS/)。第一个序列对齐被用作参考。序列变异性是蒙面,只有片段长度大于或等于9。香农熵阈值是0.5。CD8 +及CD4 +抗原表位至少有50%的重叠保留进行后续分析。

2.4。分析抗原决定基大

分析了CD8 +大使用iCrossR(网址:http://webclu.bio.wzw.tum.de/icrossr/)在确定类我绑定配置文件,如下。不匹配的数量设置为“0、1、2和3”为每个绑定的预测。抗原表位与大指数(ICR) 0.01或更高版本被移除。

2.5。HLA绑定配置人口预测和计算保护覆盖(PPC)

绑定的守恒的CD8 +(上的相似之处http://tools.iedb.org/mhci/)和CD4 + (http://tools.iedb.org/mhcii/使用IEDB) T细胞抗原表位预测。HLA我参考集用于MHC抗原表位(Weiskopf,安吉洛et al . 2013年)和一个HLA II参考集用于MHC II抗原表位(Greenbaum et al。22类我绑定配置文件出现在顶部一百分等级被保留。MHC II级,抗原表位小于15个氨基酸长度和绑定配置文件取消了前五百分等级。守恒的CD8 +抗原表位进行分析使用EPISOPT(网址:http://bio.med.ucm.es/episopt.html)选择在美国各民族人口(白人,黑人,西班牙裔、亚洲和北美本土)和PPC 95%以上。全球高度保守的抗原表位的PPC值计算使用IEDB (http://tools.iedb.org/tools/population/iedb_input)。MHC I和MHC II抗原表位被PPC然后排名。抗原表位结合在每个类计算整体PPC值。创建一个潜在的“通用”候选疫苗CD8 +及CD4 +抗原表位结合和PPC计算使用IEDB如上所述。

3所示。结果

搜索IEDB确定165线性CD4 +和CD8 + T细胞抗原表位呈现给T细胞在西尼罗河病毒感染:53 HLA类112年我和HLA类II抗原表位。抗原决定基的长度范围从8到20种氨基酸。基因组序列代表所有西尼罗河病毒的变异株也从NCBI数据库。西尼罗河病毒变异检索126独特的蛋白质序列被检索。AJR27178、AJR27181 AJR27181;AJW82677 AKH144860;和AJW59216 AJW59220被发现是相同的。只保留独特的序列。序列聚类使用CD-HIT确定nonredundant序列代表的西尼罗河病毒序列。所有主要的人类血统在场;5序列生成两个代表血统2:AJW59217(美国,2002年),AJR27898(意大利,2014年),AHB37632(意大利,2013/08),AMZ00438(印度、1988/02/12)和ALK02494(澳大利亚,1991)。 AHB37632 was discarded due to sequence anomalies.

多序列比对(MSA)进行其余4序列。四个血统都是高度保守的:3069个职位相同的氨基酸(89.37%),只有64个职位显示变量氨基酸(1.87%)。其余部分是守恒的(3.17%)或高度保守的(5.59%)。植物状态分析表明,122年165年的抗原表位序列≥50%身份掩盖了西尼罗河病毒的参考序列:32 CD8 + 9事情三10即,和一个11 mer, 19个抗原表位显示100%序列的身份;86年CD4 +抗原表位≥50%序列的身份,与19 86抗原表位显示100%序列的身份。

治疗性多肽可以引起自身免疫反应,保护抗原表位筛选计算检测对人体组织不受欢迎的大。大(CR)是计算使用iCrossR HLA-I 9 mer抗原表位。输出为每个突变是平均计算整体大指数(ICR)。

我们的结果表明,没有一个抗原表位有ICR大于0.01;因此,它似乎不太可能发生自体抗原识别和毒性作用;测试在三个突变水平时,许多抗原表位展览CR。HLA-I绑定配置文件和PPC计算使用EPISOPT和IEDB。所有CTL 9 mer抗原表位被进入的PCC EPISOPT估计五我们民族(见表1)。ITYTDVLRY有最大数量的绑定等位基因(10)和PPC最高。EPISOPT分析表明,a 可以达到单独使用HLA-I等位基因。

使用三个抗原表位,PPC的最大值是97.65%,我限制与24个不同的类:TLARGFPFV GPIRFVLAL, ITYTDVLRY。190四个抗原表位的不同组合实现了 。TLARGFPFV和ITYTDVLRY在场最高得分抗原决定基集,与许多抗原表位缺席所有候选人集合体。

使用IEDB HLA-I绑定配置文件也被获得。肽在排名前1%留存,以确保强大的约束力和足够的免疫原性。抗原结合等位基因(14)被认为比HLAB (9)。IEDB PPC工具预测顶部EPISOPT合奏只有PPC 84.68%。实现PPC > 95%, 6需要抗原表位:TLARGFPFV, ITYTDVLRY, KSYETEYPK, SYHDRRWCF MPNGLIAQF, GPIRFVLAL(见表2)。

使用IEDB HLA-II绑定资料估计,保留抗原表位排名在前5%。PPC的计算表明,单个抗原表位有一个相对较高的PPC, 8有值超过50%。VTVNPFVSVATANAKVLI和GEFLLDLRPATAWSLYAV最高价值:70.55%。ILVSLAAVVVNPSVKTVR和VTVNPFVSVATANAKVLI取得了PPC的81.81%。进一步的抗原表位没有效果。许多CD4 +抗原表位结合其他抗原表位的子集的概要文件。这些抗原表位被移除,留下一组HLA-II等位基因覆盖所有抗原表位(见表3)。很多高分的抗原表位也有重叠的绑定配置文件。

CD4 +和CD8 + T细胞都是重要的病毒清除。CD8 +及CD4 +抗原表位结合计算PPC, IEDB使用PPC工具。结合前两从每个HLA抗原表位子集VTVNPFVSVATANAKVLI ILVSLAAVVVNPSVKTVR, ITYTDVLRY TLARGFPFV, PPC的96.36%。疫苗由ITYTDVLRY合奏,TLARGFPFV, SYHDRRWCF VTVNPFVSVATANAKVLI覆盖全世界97.14%的人口。这当使用11个抗原表位上升至99.52%(见表4)。

4所示。讨论

西尼罗河病毒已被公认为全球病原体重现。目前在非洲50多年来,最近的地理传输提高了配置文件作为一个公共卫生问题。目前没有有效的治疗方法,西尼罗河病毒发展的效益成本比管道很差。接种疫苗是一个关键的干预。一个有效的西尼罗河病毒疫苗可以显著全球人口中获益。密切相关的疫苗可用于黄病毒和马西尼罗河病毒,导致年死亡率显著降低。兽医疫苗Equilis西尼罗河是一种灭活全病毒疫苗包括应变称为黄色Fever-West尼罗河。疫苗是通过2肌内注射,马6个多月3到5周,一年后一个注射助推器。比较评估,相关的保护被治疗的89 - 94%的动物在不同的测试组。大多数以前的西尼罗河病毒候选疫苗已经依赖于B细胞介导的免疫反应。 Here, we attempt to identify highly conserved T cell epitopes that might form an epitope ensemble sufficiently immunogenic to protect against geographically diverse WNV strains.

抗原表位的过继免疫疗法可能出现不希望的副作用(23CR等),当外国肽序列与自身多肽足够启动一个不必要的自体免疫反应。添加计算CR预测我们design-by-selection协议在以前的工作上是一个关键的进步(14- - - - - -20.),应该加快安全疫苗的早期选择。当使用iCrossR [23),没有一个抗原表位被确定引起反应可交叉反应的人体组织。McMurtrey et al。24)和Kaabinejadian et al。25)识别的抗原表位抗原02:01和抗原11:01,许多人也选择我们的方法,包括RVL9 SVG9, TLA9, KYS9, AVV9, RLD10 ATW9, SLT9。YTM9、SLF9 KNM9被淘汰,因为他们缺乏病毒参考序列的身份≥50%。

没有一个西尼罗河病毒抗原决定基提供了保护。一个 只有当多个抗原表位结合。一个强有力的免疫反应需要CD4 +和CD8 + T细胞反应(26]。抗原表位结合产生T细胞反应大于单一抗原决定基,加强需要多个守恒的抗原表位(27]。至少有四个抗原表位被需要 。HLA类我9即(TLA9、SYH9 ITY9)加上一个HLA-II抗原决定基(VTV18n)给一个累积人口覆盖率97.14%。

病毒复制介绍突变,最终会生成新的菌株或改变现有的;然而,我们发现,90%的西尼罗河病毒序列是守恒的( )。这种多样性的缺乏是一个援助疫苗设计守恒的地区可以利用治疗靶点,为新兴的菌株保持守恒的氨基酸。CD-HIT被用来去除多余的蛋白质序列。而剩余序列代表西尼罗河病毒最常见的人类血统(1 a、1 b、2和5),共同的血统越少(3和4)被排除在外。生成一个真正的通用流感疫苗,crossprotection西尼罗河病毒对所有血统和菌株应该调查。因此,第二代西尼罗河病毒疫苗可能需要包含血统3和4。

所有的T细胞抗原表位疫苗包含在我们最后的组合都是位于E蛋白(VTV18), NS2A (ITY9)、NS3 (SYH9),或NS4B (TLA9)。发现高度保守的E蛋白抗原表位,NS3、和NS4B是可以预期的,因为之前的工作表明这些蛋白质高度免疫原性ctl和共同目标(11,28]。可变性的基因组是不均匀,结构蛋白是最少的变量(29日]。

C地区最高比例的残留变化(~ 23%)30.]。E蛋白已经在以前的疫苗设计:利用最新的DNA疫苗候选人对黄病毒蛋白质表达病毒E和人口、难民和移民事务局(31日]。Sarri和同事确定HLA等位基因负责西尼罗河病毒感染的易感性。他们分类HLA等位基因是“保护”,增加“敏感性”,或CNS-high风险(32]。没有保护绑定Sarri等人提出的等位基因被确定。这种“保护”功能的HLA等位基因可以被利用在西尼罗河病毒疫苗研发所有种族提供保护。

通过考虑与人类蛋白质功能大,这里描述的工作代表一个一步发展疫苗设计方法。工作基于天真的序列相似度没有以前被证明是有用的(33- - - - - -35]。这里,它证明了可能把4 epitopes-3 CD8 +、CD4 + T细胞epitopes-to 1实现全球PPC的97.14%。结合细胞毒性t淋巴细胞和CD4 +需要成功的病毒清除。识别整体是一个可行的起点为进一步体外表征或0期临床试验,因为我们可以假定这抗原决定基的选择可能是最安全和免疫原性在大多数人口。本文强调计算大预测疫苗的应用设计,只允许选择抗原表位的结构或人类基因组序列的相似性。总的来说,我们的工作提供了一个有前途的下一代西尼罗河病毒疫苗的探索的起点。

数据可用性

数据可以从http://www.iedb.com从作者和可用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

资金

这项研究受到了格兰特BIO2014:54164-R不相上下。

确认

我们希望感谢阿斯顿大学支持这项研究。

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