触发免疫反应引起的抗原决定共价与Immunoadjuvant-Pulsed树突状细胞作为一个有前途的癌症疫苗

文摘

肽链型树突状细胞(DC)的成功癌症疫苗主要取决于利用肽和选择一个适当的佐剂。在此,我们旨在唤起广泛的免疫反应在immunoadjuvant同时针对多个抗原表位。三个合成抗原0201 -限制肽分别与HMGB1-derived肽(SAFFLFCSE,表示HB_{100 - 108})作为immunoadjuvant通过双精氨酸(RR)链接和加载到人类monocyte-derived DCs。肽吸收被免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测。成熟和激活状态的脉冲DCs监控检测特定的标记和释放细胞因子的表达。peptide-pulsed DCs同种异体T细胞激活的能力评估了脱粒试验和分泌细胞因子检测。的溶解性活动效应T细胞对癌细胞体外分析乳酸脱氢酶(LDH)测定。结果显示,DCs有效吸收肽+ HB_{100 - 108}并表示更高水平的表面标记(HLA-ABC, HLA-DR, CD80、CD86 CD83、CD40, CCR7)和促炎细胞因子(il - 6,干扰素-γ肿瘤坏死因子-α比控制DCs和il - 12),免费peptide-pulsed DCs,免费乙肝_{100 - 108}脉冲直流组。此外,缩氨酸+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs能够激活同种异体T细胞和提高溶解性活动对胰腺癌细胞系(PANC-1)体外。这些发现表明,与乙肝抗原多肽共价相连_{100 - 108}/脉冲DCs可能是一个有前途的战略来提高当前位于癌症疫苗。

1。介绍

树突状细胞(dc)的独特特征是最强大的抗原递呈细胞(apc)导致他们被认为是一个有前途的工具对癌症免疫疗法(1]。在过去的几年里,已经被越来越多的兴趣肽,RNA和dna DC疫苗作为一种有效的方法对癌症免疫疗法由于其有前景的结果在实现意义和持久的治疗反应和轻微的不良事件(2,3]。肽链型疫苗提供了几个优势相比其他类型的癌症疫苗。他们很容易合成,在许多储存条件稳定的,安全的,他们可以提高有效的CD4和CD8免疫反应。然而,肽链型疫苗策略的成功主要取决于利用肽和选择适当的佐剂(4]。

高机动组框1 (HMGB1)在哺乳动物中是高度保守的蛋白质,把核调节基因表达和释放细胞损伤和炎症(5]。HMGB1两个dna结合蛋白组成的图案,盒,盒B,除了C尾巴(6]。已经发现,HP91短肽氨基酸对应91 - 108 B盒子里,有能力提高DCs的成熟和激活,诱导促炎细胞因子il - 6和il - 12的分泌,并触发Th1细胞的极化7- - - - - -9]。萨斯博士和他的研究小组证明HP91可以通过其余函数作为辅助体内细胞和体液免疫反应(10]。进一步的研究表明,该地区的HP91负责其免疫刺激性功能位于c端,对应氨基酸肽HMGB1的100 - 10810,11]。在这项研究中,我们表示这种短肽HB_{100 - 108}。

众所周知,没有单一的抗原肽可能足以实现一种有效的抗肿瘤免疫反应。因此,多个抗原表位需要引起广泛的免疫反应(12]。因此,结合多种肿瘤相关抗原(TAA)可能是一个更可取的策略引起强烈的抗肿瘤免疫应答。

大量的研究证实,肿瘤相关抗原后,存活素,人类表皮生长因子受体2 (Her2)和癌胚抗原(CEA),在多种肿瘤中,生存素的过表达在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、和黑素瘤13- - - - - -16];Her2过表达在乳腺癌、胃癌、卵巢、子宫浆液性子宫内膜癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌,头部和颈部,食道癌17,18];和CEA在胃、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌19]。

在这项研究中,人类monocyte-derived DCs (moDCs)脉冲和三个抗原肽,生存素,Her2,和CEA与HB共价相连_{100 - 108}通过protease-sensitive链接器(双精氨酸(RR))。结果显示,与HB多肽共价相连_{100 - 108}(表示为肽+ HB_{100 - 108})有效地由未成熟dc和显著诱导成熟和激活与自由肽没有乙肝_{100 - 108}(表示peptides-HB_{100 - 108})。此外,缩氨酸+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs大大诱导同种异体T细胞的活化和溶解性活动,他们表现出对体外肿瘤细胞的细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。直流一代

Monocyte-derived DCs生成从外周血单核细胞(PBMC)标准聚蔗糖密度离心(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)从病人隔离PBMCs leukapheresis样本。PBMCs镀在无血清AIM-V媒体(生活技术,大岛,纽约)和允许坚持0.22μ德国m filter-capped培养瓶(TPP)。2小时后,不依从细胞被移除,随后和附着单核细胞培养6天AIM-V包含50 ng / ml rhIL-4(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和100 ng / ml rhGM-CSF(赛诺菲,布里奇沃特,新泽西)。3天,一半的介质被新的取代介质包含gm - csf和il - 4。在一些实验中,一个包含100国际单位/毫升IFN -成熟的鸡尾酒γ,30μg / ml保利(我:C)和5μg / ml R848用于成熟生成的DCs。

2.2。合成肽

以下合成抗原0201 -限制肽,生存素(LTLGEFLKL), Her2 (RLLQETELV)、CEA (YLSGANLNL)和HB_{100 - 108}(SAFFLFCSE),合成了纯度大于95%。合成后,前三肽与HB_{100 - 108}通过protease-sensitive链接器(双精氨酸(RR)残留的序列)。预计,一旦DCs peptide-RR-HB内化_{100 - 108}构造,细胞内蛋白酶会裂开的RR站点和肽和HB分开_{100 - 108}从而可以提高的处理和表示吞没了肽(20.]。肽是购自上海Top-peptide生物有限公司有限公司(上海,中国)。DCs检查他们的吞噬作用,肽±HB_{100 - 108}是用FITC标记荧光染料n端。所有的肽都溶解在PBS。

2.3。肽吸收试验

生成不成熟moDCs,如上所述,被播种在24-well板和脉冲分别合成肽±HB_{100 - 108}耦合FITC (40μ每个肽g / ml)为1小时37°C, 5%的公司₂。与PBS三洗后,考察了细胞荧光显微镜和吸收是通过流式细胞仪分析量化。淬火细胞外FITC信号,50μ克/毫升的台盼蓝之前添加到细胞悬液流式细胞术分析。Unpulsed DCs作为消极的控制。细胞被发现阳性FITC视为细胞已经成功地吞没了肽。

2.4。流式细胞术

生成的DCs评估作为CD14的纯洁性^{- - - - - -}CD11C⁺通过染色 细胞与anti-CD11C-APC anti-CD14-FITC (BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。

不成熟的moDCs resuspended 细胞/毫升和含有肽±HB_{100 - 108}(40μ每个肽)或40 g / mlμ自由HB的g / ml_{100 - 108}在37°C, 5%的公司₂。一小时后,脉冲DCs被清洗和培养过夜。下面的单克隆抗体(mab)被用来描述dc的成熟和激活状态:anti-HLA-ABC-PE, anti-HLA-DR-PE / Cy7 anti-CD80-PE, anti-CD86-APC, anti-CD83-APC, anti-CD40-Alexa萤石700和anti-CCR7-PE / Cy7 (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)。Isotype-matched荧光抗体作为消极的控制。细胞培养与抗体在4°C 30分钟。洗后,样品被检测到FACSCalibur分析器(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。数据分析FlowJo软件(TreeStar)。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

不成熟的moDCs resuspended 细胞/毫升和含有肽±HB_{100 - 108}(40μ每个肽)或只有40 g / mlμ自由HB的g / ml_{100 - 108}在37°C, 5%的公司₂。一小时后,脉冲DCs洗,培养48小时。可以发现分泌il - 12的il - 12酶联免疫试剂盒(嘉汉生物、中国)根据制造商的协议。样品的光学密度(OD)是评估在550 nm使用微量滴定板分光光度计(美国贝克曼库尔特检测平台)。

2.6。脱粒试验和细胞因子检测

肽±HB_{100 - 108}/脉冲DCs中培养成熟的鸡尾酒(100国际单位/毫升IFN -γ,30μg / ml保利(我:C)和5μg / ml R848)为24小时。细胞被洗广泛和响应者同种异体T细胞在播种 细胞的比例1:10 18个小时。上层清液收集的文化,和细胞因子的生产检测用仪珠阵列(CBA)工具包(BD生物科学),遵循制造商的指示。

为CD107a脱粒试验,同种异体T细胞刺激与空DCs或肽±HB_{100 - 108}/脉冲DCs ( 细胞的比例1:10)在GolgiStop(莫能菌素,BD)和anti-CD107a-APC马伯(BD Pharmingen)。孵化后12小时37°C,细胞被收集并沾anti-CD8-PE马伯(BD Pharmingen)并通过流式细胞术分析。

2.7。癌症细胞

人类胰腺癌PANC-1细胞系(写明ATCC®crl - 1469™)在DMEM培养补充10%的边后卫和青霉素和链霉素37°C湿润有限公司5%₂的气氛。

2.8。细胞毒性检测

肽±HB_{100 - 108}脉冲DCs在成熟的鸡尾酒成熟,与同种异体T细胞coculturing紧随其后 细胞的比率1:10 24小时。然后,收集T细胞为效应细胞,Panc-1细胞作为靶细胞。效应细胞包括负对照组(T细胞没有precoculturing DCs),空DC组(T细胞刺激nonpulsed DCs), peptides-HB_{100 - 108}组(T细胞刺激与自由肽/脉冲DCs),和肽+ HB_{100 - 108}组(T细胞刺激与HB与多肽共价相连_{100 - 108}/脉冲DCs)。效应细胞和靶细胞(PANC-1癌症细胞株)的比率孵化5:1 4 h 37°C 96 -孔板。T细胞的活动与目标肿瘤细胞LDH测定的细胞毒性试验装备(Beyotime,中国)后,制造商的指示。的细胞毒性T细胞的比例计算特定细胞溶解使用以下公式: 。给出的数据 。

2.9。统计分析

统计分析进行了使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。的 确定每个治疗组在个人实验。使用学生的组间差异进行了分析 - - - - - -测试和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。不成熟的高效moDCs多肽共价与HB_{100 - 108}

在这项研究中,三个合成肽抗原(存活素、Her2和CEA)与HB共价相连_{100 - 108}(如immunoadjuvant)通过双精氨酸(RR)残留protease-sensitive链接器(图1(一))。检测是否与HB合成肽的共价连接_{100 - 108}通过RR链接器可以通过DCs加速收购,细胞被孵化与生存素±HB_{100 - 108},Her2±HB_{100 - 108}或东航±HB_{100 - 108}在培养基1小时37°C。所有的肽和FITC共轭。流式细胞术结果显示DCs更有效地吸收肽与HB共价相连_{100 - 108}比单身自由肽(图1 (b))。DCs的高效吞噬肽+ HB_{100 - 108}也证实了免疫荧光显微镜(图1 (c))。这些发现表明HB_{100 - 108}可以发挥重要作用的加速度由未成熟dc肽吞噬作用。

3.2。成熟的DCs和激活诱导多肽共价与HB_{100 - 108}

确定最优的浓度与HB多肽共价相连_{100 - 108}的最高水平,促进DC的成熟和激活,细胞含有不同浓度的缩氨酸+ HB_{100 - 108}(0、20、40、60μ每个肽g / ml) 1小时。收集细胞,洗,培养过夜之后,通过流式细胞仪检测表面标记。数据表明,肽+ HB_{100 - 108}诱导的表达水平HLA-ABC、HLA-DR CD80、CD83、CD40, CCR7在剂量依赖性的方式没有40到60之间的显著差异μ克/毫升(补充图1)。基于这些发现,40岁μ克/毫升的肽+ HB_{100 - 108}被用作最好集中在接下来的实验。

检测是否肽+ HB_{100 - 108}可能诱发dc的成熟和激活,未成熟dc被分为四组:组(1)细胞不及时治疗;组(2)细胞孵化与自由肽:生存素,Her2,东航;组(3)细胞存活素+ HB孵化_{100 - 108}Her2 +乙肝_{100 - 108},CEA + HB_{100 - 108};和组(4)细胞与免费HB孵化_{100 - 108}。1小时后,细胞被收集,清洗,培养过夜之后,通过流式细胞仪检测表面标记。结果表明,肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs HLA-ABC的表达表现出显著增加,HLA-DR, CD80、CD86, CD83、CD40, CCR7相比其他三组。重要的是,免费乙肝_{100 - 108}未能上调表达的标记脉冲DCs (HLA-DR和CD86除外)与控制和peptides-HB相比_{100 - 108}(图/脉冲直流组2)。这些数据表明,耦合与乙肝抗原肽_{100 - 108}可以作为一种有效的策略来提高DCs的成熟和激活。

3.3。与HB多肽共价相连_{100 - 108}/脉冲dc分泌大量的促炎细胞因子水平

调查的能力与HB多肽共价相连_{100 - 108}DCs增强促炎细胞因子的分泌,细胞被分成四组,作为上一节中提到的。1小时的潜伏期后,细胞被收集,清洗,培养48小时通过ELISA检测il - 12和24小时检测其他的细胞因子。收集上清液,il - 12水平使用流式细胞仪检测到一个CBA工具包。数据表明,肽+ HB_{100 - 108}/脉冲dc分泌il - 6的水平(图丰富3(一个)),干扰素-γ(图3 (b))、肿瘤坏死因子-α(图3 (c))和白介素(图3 (d)相比其他三组。符合表面标记的结果,这些细胞因子的水平控制DCs之间的可比性,peptides-HB_{100 - 108}和乙肝_{100 - 108}组。这些结果表明,肽+ HB_{100 - 108}有相当大的潜力,促进dc分泌促炎细胞因子,通过它们重要的T细胞反应的扭曲。

3.4。肽与乙肝_{100 - 108}/脉冲DCs引起同种异体T细胞产生一些细胞因子和诱导CD8的溶解性活动⁺T细胞

调查CD8的溶解性活动⁺T细胞同种异体T细胞与空DCs或肽cocultured±HB_{100 - 108}/脉冲DCs 12小时anti-CD107a-APC马伯的存在;然后,细胞被沾anti-CD8-PE马伯,流式细胞术分析。如图4(一),只有肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs能够诱导CD8的健壮的脱粒⁺T细胞,被表面标记CD107a的表达,表明这些T细胞可以分泌细胞毒性效应分子在遇到DC-loaded肽+ HB_{100 - 108},而空DCs和DC-loaded peptides-HB_{100 - 108}未能提高CD8的脱粒⁺T细胞。

评估DC-loaded肽的影响T淋巴细胞分泌的细胞因子,同种异体T细胞单独培养的是一种消极控制(组1)或与空cocultured DCs(组2),peptides-HB_{100 - 108}/脉冲DCs(组3),或肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs(4组) 细胞的比率1:10。18小时后,分泌细胞因子被CBA工具包上层清液中检测到。数据显示的水平分泌il - 4、il - 6、TNF -α和干扰素-γ在4组(肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs / T细胞)明显高于其他三个小组。重要的是,分泌il - 10的水平在4组明显低于2组(空DCs / T细胞)和组3 (peptides-HB_{100 - 108}(图/脉冲DCs / T细胞)4 (b))。总的来说,这些结果表明,肽与HB共价相连_{100 - 108}/脉冲DCs有力促进T细胞的溶解性活动,以及提高1型和2型细胞因子的分泌和减少抑制性细胞因子的分泌il - 10。

3.5。肽与乙肝_{100 - 108}/脉冲DCs诱导T细胞的溶细胞活性与PANC-1细胞株体外

记录,胰腺肿瘤细胞表达高水平的生存素,Her2,东航抗原肽(21]。测试是否肽±HB_{100 - 108}/脉冲DCs可以诱导T细胞对肿瘤细胞的溶细胞活性体外,同种异体T细胞与空首先cocultured DCs(组2),peptides-HB_{100 - 108}/脉冲DCs(组3),或肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs(4)组。治疗T细胞作为消极的控制(组1),24小时后收集T细胞为效应细胞和cocultured PANC-1癌症细胞作为靶细胞的比例5:1 ( )。T细胞的活动与目标肿瘤细胞LDH测定的细胞毒性检测设备。作为显示在图5肿瘤细胞溶解的百分比在肽/ HB_{100 - 108}组高于负控制和空DC组。更重要的是,T细胞在肽+ HB_{100 - 108}组显著诱导肿瘤细胞的裂解与其他三组相比,表明肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs可以刺激高溶细胞的活动对PANC-1体外T细胞。

4所示。讨论

免疫疗法基于肽具有许多优势,包括简单的合成,低分子量、低毒性、肿瘤细胞的具体目标。然而,肽链型抗癌疫苗遇到一些局限性在临床设置由于几个原因包括以下几点:(1)有CD4的缺乏⁺T细胞的帮助,(2)肽容易退化,(3)他们可能诱导,(4)诱导震级较低或瞬态免疫反应,和(5)有功能障碍的DCs癌症(4,22]。

近年来,已经有越来越多的兴趣,癌症的华盛顿疫苗由于他们有前景的结果在实现有意义的治疗反应和安全性(23]。它已被证明,相比之下合成短肽(SSPs),合成长肽(slp)有效处理和crosspresented DCs体内,导致两个CD4的启动⁺和CD8⁺T细胞反应(24,25]。几项研究表明,与短肽直接接种疫苗可能导致公差和无力,促进肿瘤细胞的生长26,27]。相比之下,前女友vivo-differentiated DCs含有短肽可能引起强大的体外和体内抗肿瘤免疫反应28,29日]。因此,DCs似乎是一个强大的肽链型疫苗载体。

如前所述,肽链型疫苗的成功主要取决于利用肽和选择一个适当的佐剂。,已经发现的共价连接辅助肿瘤相关抗原(taa)可能导致DCs在体外成熟和激活,诱导一种强有力的抗肿瘤免疫反应体内taa相比,他们身体与佐剂混合(30.,31日]。

众所周知,toll样受体(TLR)配体有一个强有力的活动来提高DCs的成熟,促进他们表达促炎细胞因子和costimulatory分子(32]。后来的研究表明,TLR配体可以有效地增加抗原crosspresentation在DCs的能力33]。HMGB1蛋白已经被证明可以激活免疫细胞,诱导信号通过与不同的互动通常(34]。因此,除了HMGB1蛋白或其衍生肽的肽链型亚单位疫苗可能是一个有前途的战略来提高crosspresentation crosspriming DCs。

在这项研究中,三个合成肽抗原,在多种癌症类型中,被共价与HMGB1-derived肽(HB_{100 - 108}通过双R)作为immunoadjuvant链接器和加载到未成熟dc。本设计包括三个主要优点:(1)合成肽,(2)immunoadjuvant的共价连接,和(3)RR链接器,由DCs的蛋白酶裂解,从而可以促进和增强的处理和显示加载肽。

完善,只有成熟的DCs costimulate幼稚T细胞激活和因此需要承认peptide-MHC复合物通过T细胞受体和costimulatory分子之间的相互作用(CD40、CD80和CD86)对DCs和CD28目标T细胞受体(35]。我们的数据表明,肽+ HB_{100 - 108}(但不是peptides-HB_{100 - 108}或免费乙肝_{100 - 108})/脉冲DCs表现出高水平的几个表面分子(HLA-DR, HLA-ABC、CD83、CD80、CD86和CD40),表明肽+ HB_{100 - 108}可以有效地触发未成熟dc的成熟和激活。此外,缩氨酸+ HB_{100 - 108}/脉冲CCR7、DCs表达高水平的中扮演着很重要的角色在DCs的迁移淋巴结幼稚T细胞激活和引起特异性免疫反应36]。

众所周知,炎性细胞因子的分泌DC-loaded抗原起着关键作用的抗原诱导抗肿瘤免疫反应(37]。在这项研究中,肽+ HB_{100 - 108}(但不是peptides-HB_{100 - 108}或免费乙肝_{100 - 108})/脉冲DCs分泌高水平的il - 6、TNF -α干扰素-γ,IL-12p70和低水平的il - 10。高水平和低水平的IL-12p70和il - 10,分别表明肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs向Th2可以诱导T细胞的分化表型(38]。

这些发现与之前的研究一致表明自由HMGB-1-derived肽几乎没有影响dc的成熟和激活31日]。他们也一致的结果研究表明,辅助共价链接到短肽抗原决定基识别可能会刺激高于同一分子的物理混合配方(39,40]。达到最大免疫刺激性影响,immunoadjuvant应该在近距离与抗原(41]。我们的数据表明,肽+ HB_{100 - 108},但不是免费乙肝_{100 - 108},有效提高DCs的成熟和激活后迅速的吞噬作用。潜在的原因是,连接与乙肝抗原表位_{100 - 108}可能促进肽multimerization并导致一个有效结合的受体DCs通过交联(10]。提到很重要的直接接种疫苗,而不是来自体内的直流负载,肽+ HB_{100 - 108}将提出的,相同的装甲运兵车,可以防止非特异性DC刺激。总之,乙肝_{100 - 108}可能表现出协同效应与抗原多肽共价链接时,从而可能导致最大化抗肿瘤免疫反应。

一些研究表明,有效的DC疫苗应该最后激活抗原T细胞反应。因此,细胞因子分泌的能力是至关重要的确认T细胞的激活状态时遇到了抗原的dc (42]。在目前的研究中,我们发现,il - 4的表达il - 6、TNF -α和干扰素-γ但不是il - 10后显著增加T细胞与肽+ HB_{100 - 108}/脉冲DCs,表明这种疫苗设计有能力对肿瘤抗原激活同种异体T细胞。

癌症疫苗的最终目标是驱动激活T细胞向肿瘤部位和选择性地杀死癌细胞。在这项研究中,T细胞激活的(生存素、Her2和CEA) + HB_{100 - 108}/脉冲DCs显示显著高对PANC-1细胞株体外溶细胞的活动。这表明T细胞刺激肽+ HB_{100 - 108}脉冲DCs可能发挥重要的抗原溶解在胰腺癌细胞表达生存素、Her2和CEA肽。

总之,我们的研究结果提供的证据表明,immunoadjuvant HB的共价连接抗原肽_{100 - 108}由DCs有效吞噬,诱导他们完全成熟和激活。这些激活DCs激活同种异体T细胞的能力,提高他们对癌细胞的细胞溶解的活动。这项工作提出了一个有效的策略来改善华盛顿肽的免疫治疗和支持进一步的研究在临床试验中测试这种疫苗的功效。

数据可用性

相关数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

这个研究是医学伦理委员会批准上海细胞疗法研究所和依法开展1964年赫尔辛基宣言》及其修正案晚些时候或类似的道德标准。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Chumeng陈和Mohanad Aldarouish贡献同样这项工作。

确认

这项工作由上海市自然科学基金支持19 zr1454200。

补充材料

补充图1:测定肽+乙肝的最佳浓度_{100 - 108}促进DC的成熟和激活的最高水平。(补充材料)

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