文摘
背景。本研究旨在探索循环的变化和意义Th和Tfh细胞子集glucocorticoid-treated IgG4-RD病人。方法。39 glucocorticoid-treated IgG4-RD患者和22名健康对照组(HC)登记。外周血单核细胞分离,考察了循环Th和Tfh细胞子集根据表面和流式细胞术在细胞核内的标记。IgG4-RD应答器访问的疾病活动指数(RI)得分。Th / Tfh子集数之间进行了相关分析和临床指标。接受者操作特征(ROC)曲线是用来评估Th和Tfh子集的功效区分活跃IgG4-RD患者缓解IgG4-RD病人。结果。循环Th1、Th17 Tfh1, Tfh17细胞活跃IgG4-RD患者显著增加而HC。Th1和Tfh1号码与血清IgG4水平呈正相关,IgG4-RD患者。同时,循环的绝对数字Th1和Tfh1细胞与IgG4-RD RI分数呈正相关。曲线下的面积(AUC) 0.8276为Tfh1 Th1和0.7310,Tfh17 Tfh2 0.5862, 0.6810。结论。增加循环Th1和Tfh1子集相关活动IgG4-RD患者血清IgG4水平升高在糖皮质激素治疗,过程中可能发挥重要作用IgG4-RD疾病,和可能的潜在生物标志物监测IgG4-RD疾病活动。
1。介绍
IgG4-related疾病(IgG4-RD)是一种慢性的免疫介导的块状病变,簇状fibroinflammatory障碍的特点是一个密集的lymphoplasmacytic渗透IgG4-positive浆细胞丰富,经常地散布纤维化,升高血清IgG4浓度(1]。大多数的小淋巴细胞浸润细胞主要是由T细胞分布广泛的病变和混合浆细胞(2]。浸润病变主要是活化的CD4 T细胞+T细胞,IgG4-RD[过程中起着重要的作用3]。
先前的研究已经报道,CD4细胞+细胞毒性T淋巴细胞(ctl)和卵泡辅助T (Tfh)病变是主要的CD4细胞渗透到组织+T细胞在IgG4-RD疾病网站(4- - - - - -8]。循环CD4+ctl和Tfh细胞被发现是扩大患者IgG4-RD [5,6,9]。循环CD4 T辅助(Th)细胞可分为Th1细胞(CXCR3+CCR6- - - - - -),Th2 +天真的CD4细胞+细胞(CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -,CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -CCR4+代表Th2细胞和CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -CCR4- - - - - -属于天真的CD4细胞)和(CXCR3 Th17细胞- - - - - -CCR6+)[10,11]。CD4+ctl表达ThPOK的转录因子,Runx3, T-bet,主要从Th1细胞分化12,13]。因此,循环CD4的扩张+ctl可能导致高架IgG4-RD患者的外周血Th1细胞。Tfh代表不同的CD4细胞+T细胞子集为他们提供关键信号B细胞分化为浆细胞分泌抗体的高亲和性的生发中心(14,15]。外周血CD4+CXCR5+T细胞被认为是一个循环池的内存Tfh细胞,可分为Tfh1 (CXCR3+CCR6- - - - - -),Tfh2 (CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -)和Tfh17 (CXCR3- - - - - -CCR6+)细胞,和他们有不同的能力来帮助B细胞分化的子集(16,17]。一些研究调查了循环CD4的角色+T细胞在IgG4-RD子集。然而,大多数以前的研究都集中在治疗IgG4-RD病人。很少有研究探讨CD4循环之间的关系+T细胞亚群和IgG4-RD治疗患者的疾病活动。
在这项研究中,我们的目标是确定循环Th和Tfh细胞子集之间的关系和血清IgG4水平以及疾病活动glucocorticoid-treated IgG4-RD病人。我们打算澄清循环的变化和临床意义和Tfh细胞IgG4-RD治疗患者的子集。
2。结果
2.1。IgG4-RD患者的临床特点
我们涉及患者39 IgG4-RD包括明确的诊断( ),可能的( ),和可能的( )IgG4-RD诊断结果,病人的临床和人口特征描述的补充表1。这些科目,38(97.4%)涉及≥2的器官。频繁的网站的初始器官参与包括颌下腺(13例,33.3%),泪腺体(7例,17.9%)、腮腺(1例,2.6%),胰腺(10例,25.6%),胆管(1例,2.6%),淋巴结(2例,5.1%)、腹膜后腔(3例,7.7%)、窦(1例,2.6%),肠系膜(1例,2.6%)。国际扶轮的这些IgG4-RD病人中值为5。这些患者被分为活跃的( )和缓解( )IgG4-RD患者根据国际扶轮的分数。
我们测量和IgG4水平相比,免疫球蛋白,IgE, C3, C4,和血清c反应蛋白的活性IgG4-RD病人,缓解IgG4-RD病人,和HC。如补充图所示1血清的浓度IgG4活跃IgG4-RD患者明显高于在HC和缓解患者(3.01 g / L和0.46 g / L和0.85 g / L; 和 ,分别)。同样,IgE活跃IgG4-RD患者明显升高而HC和缓解病人(103.40国际单位/毫升和24.94 IU /毫升和38.13 IU /毫升; 和 ,分别)。相比之下,患者血清C4水平明显降低活动IgG4-RD而HC (0.209 g / L和0.268 g / L, )。我们也分析了淋巴细胞和CD4水平+淋巴细胞百分比和发现淋巴细胞和CD4浓度升高+活跃IgG4-RD患者T细胞百分数与HC或缓解期患者(没有显示)。
2.2。增加IgG4-RD患者Th1和Th17细胞活跃
我们下一个测量Th细胞水平IgG4-RD病人和HC根据表面标记。被定义为CD3循环Th细胞+CD4+CXCR5- - - - - -Foxp3- - - - - -因为我们想排除细胞Foxp3的影响+调节性T细胞。Th1、Th2 +幼稚CD4和Th17细胞被定义为CXCR3子集+CCR6- - - - - -细胞,CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -细胞,CXCR3- - - - - -CCR6+内细胞CD3+CD4+CXCR5- - - - - -Foxp3- - - - - -Th细胞,分别。如图1绝对数量(每μL)循环Th1细胞显著增加在活跃的IgG4-RD病人相比HC和缓解病人(111.9细胞/μL和76.4细胞/μ细胞/ L和57.4μL; 和 ,分别)。此外,绝对数量(每μL)和频率的循环Th17细胞活跃IgG4-RD患者明显高于在HC /(76.4细胞μL和30.6细胞/μL, 0.107和0.070; 和 ,分别)。有趣的是,绝对数量(每μL)循环Th2加上天真缓解IgG4-RD病人的CD4细胞明显低于在活跃的病人和HC(197.9细胞/μL和400.9细胞/μ细胞/ L和374.6μL; 和 ,分别)。循环的频率Th2 +天真的CD4细胞在积极IgG4-RD比显著降低HC(0.611和0.745; )。
(一)
(b)
2.3。Tfh1和Tfh17细胞活跃IgG4-RD患者增加
接下来我们分析这些IgG4-RD患者循环Tfh细胞变化。循环Tfh被定义为CD3细胞+CD4+CXCR5+Foxp3- - - - - -细胞。Foxp3+细胞也被排除在外,因为我们想要排除卵泡调节性T细胞的影响。Tfh1、Tfh2 Tfh17细胞被定义为CXCR3子集+CCR6- - - - - -细胞,CXCR3- - - - - -CCR6- - - - - -细胞,CXCR3- - - - - -CCR6+内细胞CD3+CD4+CXCR5+Foxp3- - - - - -Tfh细胞,分别。如图2绝对数量(每μL)的循环Tfh1细胞活跃IgG4-RD患者显著增加而HC(26.2细胞/μL和17.4细胞/μL; )。此外,绝对数量(每μL)和频率的循环Tfh17细胞也显著增加患者积极IgG4-RD而HC(25.8细胞/μL和10.4细胞/μL, 0.226和0.145; 和 ,分别)。相反,循环Tfh2细胞的频率显著降低活跃IgG4-RD患者相比HC和缓解患者(0.424和0.612和0.572; 和 ,分别)。
(一)
(b)
2.4。循环Th1细胞与IgG4水平呈正相关,国际扶轮IgG4-RD患者的得分
确定协会Th细胞与临床指标子集,Th细胞的相关子集和血清IgG4 RI在IgG4-RD病人进行评分。如图3绝对数量(每μL)的Th1细胞被发现呈正相关,血清IgG4水平和IgG4-RD RI的评分( 和0.4457; 和 ,分别)。同样,Tfh细胞的相关子集和血清IgG4 RI分数IgG4-RD患者也进行了分析,分别(图4)。有趣的是,我们发现Tfh1细胞的数量也与血清IgG4水平呈正相关,IgG4-RD RI的评分( 和0.3568; 和 ,分别)。
2.5。Th1和Tfh1细胞数量可以作为潜在生物标志物IgG4-RD疾病活动监视
因为Th1和Tfh1子集数显著增加活跃IgG4-RD病人与疾病活动有显著的正相关性,我们进一步探讨是否可以作为潜在的标记IgG4-RD疾病活动监视。如图5,我们使用Tfh1和Th1细胞数量来区分积极IgG4-RD缓解IgG4-RD和生成ROC曲线。曲线下的面积(AUC) 0.8276 0.7310 Th1细胞和Tfh1细胞。我们也使用其他细胞的疗效分析诊断的子集。曲线下的面积(AUC) 0.7586 Th2 +天真对Th17细胞CD4细胞和0.6517,0.5862和AUC Tfh2细胞(图0.6810,Tfh17细胞5)。
3所示。讨论
在这个研究中,我们研究了循环的变化和意义Th和Tfh细胞子集glucocorticoid-treated IgG4-RD病人。我们发现循环Th1和Tfh1子集被增加,血清IgG4水平和RI分数有关的活跃IgG4-RD病人,IgG4-RD可能发挥重要作用,可能是潜在的生物标记物监测疾病活动IgG4-RD治疗期间。
IgG4-RD常出现的水平升高血清IgG4 [18,19]。血清免疫球蛋白e浓度也增加了在一些病人20.]。在目前的研究中,我们还发现,血清的浓度IgG4 IgE活跃IgG4-RD患者显著增加。相反,血清C4含量显著降低活跃IgG4-RD比HC患者。减少血清C4水平在这些活跃的病人可能表明,特定的抗体绑定到目标抗原和激活补体系统是常见的疾病。
扩大CD4+ctl已报告的发病机制中扮演重要角色IgG4-RD [4,20.- - - - - -23]。CD4+ctl区分主要来自Th1细胞。因此,我们研究了循环IgG4-RD患者Th子集。循环Th1细胞的数量显著增加活跃IgG4-RD病人。与我们的结果一致,增加循环Th1细胞IgG4-related涎腺炎患者已经太等人报道,Higashioka et al。24,25]。在这里,我们使用表面分子的Th小组提供未来潜在的诊断应用。我们还发现,循环Th1细胞的数量与血清IgG4水平相关,这表明扩大Th1细胞可能参与血清IgG4的高程。同样,前原诚司等人报道,CD4的比率+ctl患者病变组织从IgG4-related泪腺炎和sialoadenitis呈正相关,血清IgG4浓度(4]。Upregulation Th1细胞和CD4细胞+ctl将导致更多的干扰素的生产γ,和过度IFN -γ被认为导致致病性Tfh积累细胞,进而导致异常的生发中心的形成和自身抗体的产生26]。这间接影响可能解释Th1细胞和IgG4之间的正相关关系。此外,我们发现循环Th1细胞的数量与IgG4-RD RI分数呈正相关。这意味着循环Th1细胞反映IgG4-RD的疾病活动。原因可能是因为Th1细胞能产生炎性细胞因子(IFN -γ等)和溶细胞的分子(穿孔素和granzyme),与疾病相关的活动。
之前的研究在IgG4-RD Tfh细胞子集的角色进行了调查。然而,结果仍有争议。秋山等人报道,激活循环Tfh1 IgG4-RD Tfh2细胞增加,Tfh2细胞的数量与血清IgG4水平(27,28]。陈等人报道,频率循环Tfh1和Tfh2 IgG4-RD患者细胞显著增加(8]。多等人发现,T细胞循环极化向Th2 / Tfh2和Th17 / Tfh17 IgG4-RD患者(29日]。最近的一项研究表明,所有PD-1传播+Tfh细胞扩大子集IgG4-related硬化性胆管炎、胰腺炎,但只有激活Tfh2细胞与疾病相关的活动(30.]。il - 4+据报道Tfh细胞显著增加在二级淋巴器官和病变组织在IgG4-RD [7),而这些il - 4+而不是GATA-3 Tfh细胞表达BATF,被确认为一个主循环Tfh2转录因子(10]。CXCR3和CD4 CCR6被发现调节+Tfh IgG4-RD患者的细胞在病变组织(4),这表明在IgG4-RD可能CXCR3 Tfh增加+Tfh和CCR6+Tfh细胞。在这里,我们发现循环Tfh1细胞的数量明显高于IgG4-RD患者的活跃。此外,循环Tfh17细胞的数量和比例明显高于患者积极IgG4-RD HC。相比之下,循环Tfh2细胞的比例显著降低活跃IgG4-RD病人。同时,循环Tfh1细胞的数量呈正相关,血清IgG4水平和IgG4-RD RI分数,这表明增加Tfh1细胞可能与升高IgG4和IgG4-RD。
结论不一致的原因之一是不同的标准包含的病人。我们在这项研究包括病人接受糖皮质激素治疗。Th的变化和Tfh亚种群在这些患者在治疗过程中非常不同于新出现或治疗后。因为大多数IgG4-RD病人往往在开始治疗,很难收集最近诊断为病人,但我们的研究结果更具有参考意义,因为它反映了大多数病人来医院的情况。这也是第一次系统地研究Th和Tfh子集的变化与糖皮质激素治疗的患者。我们怀疑糖皮质激素可以影响循环T细胞亚群,和T细胞亚群的变化也反映了治疗的效果。
在此基础上,我们也进行了初步探索Th和Tfh子集的诊断价值和使用ROC曲线评价这些子集的有效性区分活动和缓解IgG4-RD患者在糖皮质激素治疗的地位。根据我们的结果,曲线下的面积(AUC) 0.8276为Tfh1 Th1和0.7310,这表明Th1和Tfh1号码可能是潜在的诊断制造商监控IgG4-RD疾病活动。我们的研究使用流式细胞仪检测外周血细胞表面的分子。如果它可以达到的目的评估病人的治疗,会有很好的应用前景。然而,由于样本量不够大,有必要在未来扩大样本量澄清Th1和Tfh1的诊断价值。
总之,我们的研究表明,积极IgG4-RD特点是循环T细胞极化对Th1 / Tfh1和Th17 / Tfh17在糖皮质激素治疗。积极传播Th1和Tfh1水平与血清IgG4水平和IgG4-RD患者的疾病活动,这可能IgG4-RD过程中起着重要的作用,并且可以IgG4-RD疾病活动监视潜在的生物标记物。
4所示。材料和方法
4.1。主题
患者共39 IgG4-RD(24男性,女性15;年龄中位数:62年)和22名健康对照组(HC)(13个男性,女性9;年龄中位数:66年)招募了来自北京大学人民医院的门诊和住院部分在2018年12月和2019年5月之间。IgG4-RD的诊断是根据2011年的全面诊断标准(31日]。所有IgG4-RD患者接受糖皮质激素治疗。大多数病人已经标准化剂量:强的松0.6毫克/公斤/天为2 - 4周,然后剂量减少到5 mg / d 3 - 6个月后,预期的停止治疗2 - 3年。IgG4-RD应答器指数(RI)得分是用于评估疾病活动(32]。每个受影响的器官分别得分,所有单个器官分数求和计算整体国际扶轮。本研究所有国际扶轮的分数计算的包含血清IgG4水平。IgG4-RD国际扶轮 被认为是一个活跃的疾病,和< 3分为缓解(21]。这项研究是通过北京大学人民医院伦理委员会和执行遵循赫尔辛基宣言的道德标准。
4.2。临床指标测量
血清水平的IgG4被浊度测定法测量使用西门子BN二世浊度计(西门子医疗诊断;Malburg、德国)和西门子(Siemens)试剂。血清免疫球蛋白浓度、C3和C4浊度测定法是用贝克曼库尔特“800浊度计(贝克曼库尔特爱尔兰有限公司;美国CA)和贝克曼库尔特试剂。血清中c反应蛋白是由immunoturbidimetry用贝克曼库尔特化学分析仪测试AU5800(贝克曼库尔特爱尔兰有限公司;美国CA)和贝克曼库尔特试剂。血清IgE水平测试由Cobas e601电化学发光免疫测定分析仪(罗氏公司;德国曼海姆)。白细胞和淋巴细胞计数测定Sysmex xe - 2100 (TOA医疗电子产品;神户,日本)。
4.3。流式细胞术
外周血单核细胞(PBMCs)是由梯度离心分离与人类淋巴细胞分离介质(Dakewei生物技术有限公司。深圳,中国),然后用PBS洗两次。丰富PBMCs立即被染色30分钟以下抗体:CD3-APC, CD4-PerCP / Cy5.5 CXCR5-APC / Cy7 CXCR3-PE, CCR6-PE / Cy7。细胞内染色的具体执行使用一个转录因子染色缓冲区工具包(热费希尔Scientific-eBioscience;美国圣地亚哥,CA),根据制造商的指示。固定和透化作用后,细胞被孵化与anti-Foxp3 allophycocyanin 30分钟。荧光抗体都是购自BioLegend(美国圣地亚哥,CA)。样本分析FACSCanto使用天后软件(BD生物科学;美国加利福尼亚州圣何塞)。基于完整的血液中淋巴细胞计数的数量和每个子组的淋巴细胞的比例由流式细胞术,绝对计数(每μL)计算每个子群。
4.4。统计数据
连续变量与平均25所示th-75年th百分位数。多组比较使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行了分析。的Mann-Whitney测试是用于比较两组。接受者操作特征(ROC)曲线,分析探讨参数的效率评估IgG4-RD疾病活动和AUC值确定。统计学意义是决定使用软件V.7.0 GraphPad棱镜(GraphPad软件;美国圣地亚哥,CA)。统计数据与值小于0.05被认为是重要的。
缩写
| AUC: | 曲线下的面积 |
| FCM: | 流式细胞术 |
| IgG4-RD: | IgG4-related疾病 |
| 国际扶轮: | 应答器指数 |
| HC: | 健康对照组 |
| ctl: | 细胞毒性T淋巴细胞 |
| 中华民国: | 接受者操作特性 |
| Th: | 辅助T细胞 |
| Tfh: | 卵泡辅助T细胞 |
| PBMCs: | 外周血单核细胞 |
| 白细胞: | 白细胞。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可能昌盛夏博士在应用发布,可以联系谁(电子邮件保护)。
的利益冲突
没有经济利益竞争关系描述的工作。
作者的贡献
CS。x和c . l .设计研究;CY。L。,Y. L., and LJ. X. performed the experiments; YY. L. was responsible for subject recruitment; CS. X. and C. L. wrote the paper.
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81871230)、中国教育部博士基金(20120001120053)、北京大学人民医院科研发展基金(RDT2020-01)和北京自然科学基金(7163228)。
补充材料
补充图1:主动IgG4-RD患者的血清学标志物的水平,缓解IgG4-RD患者和健康对照组。补充表1:IgG4-RD患者的临床特点。(补充材料)