文摘

的目标是。迄今为止,ROS-generating能力不同激活巨噬细胞的状态还没有彻底的比较。本研究的目的是确定的性质和水平ROS生成刺激后常见的活化剂M1和M2巨噬细胞纤维化和调查的潜在影响。结果。人类主要和THP-1巨噬细胞与干扰素治疗γ+有限合伙人或IL-4-activating刺激,mRNA的表达建立M1 (CXCL11、CCR7、il - 1β)和M2 (MRC-1 CCL18 CCL22)标记被用来确认激活。评估了过氧化物生成l - 012增强化学发光和M (IFN -增加γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,比unpolarised巨噬细胞(MΦ)。这个信号与NOX2 siRNA减毒。增加p47phox表达式和p67phox NOX2氧化酶复杂的子单元明显M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,分别。Amplex红色和DCF荧光化验检测增加过氧化氢与il - 4代后刺激,但不是干扰素-γ+有限合伙人。Coculture与人类主动脉外膜成纤维细胞表明M (il - 4),但不是M (IFN -γ+ LPS)、增强纤维母细胞胶原蛋白1蛋白表达。巨噬细胞与过氧化氢清除剂预处理,PEG-catalase,减毒效果。结论。我们表明,超氧化物生成不仅是增强刺激与M1与M2巨噬细胞激活,还刺激il - 4。巨噬细胞激活和il - 4还表现出增强的过氧化氢生成进而增加主动脉成纤维细胞胶原蛋白的生产。因此,M2 macrophage-derived ROS主动脉纤维化被确定为一个重要的潜在因素。

1。介绍

巨噬细胞是关键细胞的先天免疫系统和他们的激活和功能是很重要的在组织内稳态,疾病发病机制和免疫调节(1]。巨噬细胞存在异构人口,不断应对局部微环境信号(2]。近年来,研究探讨了一般反对两大巨噬细胞的数量的角色,“经典激活”促炎性巨噬细胞M1和M2巨噬细胞或者激活。代表的两端的激活或“两极分化”,M1和M2巨噬细胞被认为扮演主要角色在炎症和组织修复,分别,虽然这种模式现在被认为是过于简化(1- - - - - -3]。现在认识到,精确的刺激激活的重要决定的特点和表达谱激活巨噬细胞,它可以跨不同而大相径庭在体外和在活的有机体内上下文(3]。尽管如此,理解巨噬细胞如何应对不同的细胞因子和微环境因素可以通知他们的贡献对各种疾病和确定新的治疗目标。迄今为止,活性氧(ROS)模型能力的巨噬细胞在不同的激活状态尚未彻底相比。

巨噬细胞的初始渗透的受伤导致促炎细胞因子和ROS的生成。同时这种防御机制有助于微生物杀死,也会加剧炎症疾病。M1巨噬细胞激活这些促炎细胞因子(例如,IFN -γ这个设置)发挥主导作用,ROS对这些过程的贡献是显而易见的(4]。因此,M1 macrophage-derived超氧化物和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)中一氧化氮(NO),会导致强大的氧化剂的生成、过氧硝酸盐。当过氧亚硝基病原体杀死的核心,它也可以导致氧化和硝化的蛋白质和脂类。重要的是,M1的ROS-generating能力巨噬细胞是依赖主要的活动NOX2同种型的NADPH氧化酶(NOX)家族在巨噬细胞酶的高表达。炎症刺激增加NOX2氧化酶的表达和活性微生物杀死[作为一个重要的机制5- - - - - -7]。考虑到他们公认ROS-generating能力(8,9),M1巨噬细胞已被证明有助于炎症反应器官损伤(10),观察到疾病,如高血压、糖尿病、肾脏疾病(11- - - - - -13]。

在后期阶段的疾病过程,巨噬细胞释放抗炎分子和生长因子,促进愈合和再生。虽然最初有益,康复过程是连续时便成了病态,导致细胞外基质的重塑。巨噬细胞招募这些过程,称为“平方米”或“或者激活巨噬细胞,通常由Th2细胞因子激活,抗炎细胞因子,生长因子(1]。这是特别相关的高血压的设置中,我们演示了M2巨噬细胞的积累,由表达式表示的标记CD206(也称为MRC-1),在与主动脉硬化,增加相关的血管壁胶原蛋白沉积(14]。M2的profibrotic影响巨噬细胞通常归因于他们的能力来生成转化生长因子-β(TGF -β)和血小板源生长因子(PDGF) [1,15),从而促进成纤维细胞的分化collagen-generating myofibroblasts [16,17]。值得注意的是,M2巨噬细胞也表达NOX2氧化酶和有能力生成活性氧(18]。因此,它是可能的,他们一代的ROS,尤其是过氧化氢,也可能导致这种profibrotic反应。证据支持这一概念来自于观察到NOX-derived可以迅速转化为过氧化氢过氧化物,这已经被证明可以直接刺激成纤维细胞的胶原蛋白生产和myofibroblast分化在体外(19]。此外,profibrotic coculturing肺成纤维细胞与巨噬细胞的影响是减少了氮氧化物的抑制剂apocynin [20.]。因此,ROS可能代表小说中介改造行动的M2巨噬细胞中观察到纤维化疾病,如肺纤维化、肌肉萎缩症(21,22和主动脉硬化与高血压有关14]。

到目前为止,它已经普遍认为M1巨噬细胞有一个增强的氧化能力(2,8,9),导致其促炎属性和组织破坏性影响。因此,ROS生成被认为是“M1”功能。然而,没有研究直接氧化能力相比,NOX2活动,与自然产生的ROS M1和M2巨噬细胞。ROS生成的数量和类型是否影响功能的疾病,特别是关于纤维化还有待确定。不一致的术语和定义巨噬细胞子集之间的翻译和局限性在体外和在活的有机体内巨噬细胞最近承认(3]。本研究旨在阐明是否与常用的Th1 (IFN -巨噬细胞的刺激γ和有限合伙人)与Th2 (il - 4)刺激表现出一个微分产生活性氧的能力。我们也比较ROS生成的性质和目的调查这是否可能,反过来,影响他们profibrotic能力。这些巨噬细胞将被称为M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)根据Murray的建议等。3]。

2。材料和方法

2.1。主要人类单核细胞隔离

主要人类单核细胞与健康献血者巴菲外套(澳大利亚红十字会血液服务,墨尔本,澳大利亚)。淡黄色的外套是混合磷酸盐(PBS;没有这个2 +或毫克2 +;Sigma-Aldrich)补充0.5%胎牛血清(的边后卫;Sigma-Aldrich)和2毫米乙二胺四乙酸(EDTA;Sigma-Aldrich)和分层到Ficoll-Paque +(通用电气医疗集团。密度梯度离心法17 - 144)(400克,40分钟, , )。外周血单核细胞(PBMC)层收集使用人类锅单核细胞和单核细胞隔离隔离设备(Miltenyi研究。130-096-537),根据制造商的指示。单核细胞的纯度人口证实至少有85%是由使用CD14流式细胞术+/ CD16+表达式。

2.2。单核细胞巨噬细胞分化和激活巨噬细胞

博士提供的THP-1人类单核细胞的细胞系是Meritxell运河(纳什医药科学研究所,Parkville,澳大利亚)。THP-1细胞培养在high-glucose RPMI 1640中(Gibco生命技术),补充10% heat-inactivated的边后卫和生长在T75组织培养瓶血压得到较好的控制湿润孵化器维持在37°C公司为5%2(三洋MCO-18AIC有限公司2孵化器、量子科学)。THP-1单核细胞是通过每3 - 4天,播种6-well板( )RNA和蛋白质提取或96孔板( )过氧化物和过氧化氢检测。THP-1单核细胞分化的巨噬细胞(MΦ)通过添加100海里phorbol-12 13-dibutyrate (PDBu Calbiochem) 24小时。THP-1巨噬细胞随后不及时治疗(MΦ)或处理的组合5 ng / ml干扰素-γ(IFN -γ;Sigma-Aldrich没有。I3265)和10 ng / ml脂多糖(LPS);Sigma-Aldrich没有。L2630,大肠杆菌0111:B4应变)或25 ng / ml interleukin-4 (il - 4;Sigma-Aldrich没有。I4269)、24、48、72小时PCR,免疫印迹,ROS检测。巨噬细胞治疗的一个子集的小干扰rna (100 nM NOX2圣克鲁斯。小干扰rna (sc - 35503)或错义控制siRNA-A;圣克鲁斯。 sc-37007). These cells were transfected using Lipofectamine RNAiMAX (Gibco Life Technologies) in opti-minimum essential medium (Opti-MEM, Gibco Life Technologies) for 6 hours prior to polarisation in complete RPMI 1640 culture medium.

孤立的主要供体血液单核细胞( )被分化成巨噬细胞培养7天的RPMI 1640 GlutaMAX介质(Gibco生命技术),补充了10%的边后卫,1×抗生素/ antimyotic (Gibco生活技术,美国),1毫米丙酮酸钠(Sigma-Aldrich), 1×不必要的氨基酸(NEAA;Gibco生命技术),50 ng / ml巨噬细胞集落刺激因子(csf;Miltenyi研究。130-096-491)。后7天巨噬细胞分化,人类主要巨噬细胞都不及时治疗(MΦ),接受100 ng / ml有限合伙人和20 ng / ml IFN -γ或接受25 ng / ml il - 4 - csf的缺失。细胞治疗3、6、24小时实时PCR或24小时为西方墨点法和l - 012增强化学发光。

2.3。主动脉成纤维细胞Coculture M (IFN -γ+ LPS)或M (il - 4)巨噬细胞

主要人类主动脉外膜成纤维细胞(AoAF;Lonza没有。cc - 7014;Lonza)种植在基质细胞生长介质(SCGM;Lonza没有。cc - 3205),含有5%的边后卫和使用从段落2到8。成纤维细胞维持在t - 75烧瓶湿润孵化器在37°C公司为5%2。一旦支流,AoAFs通道在使用Trypsin-EDTA SCGM (Lonza没有解决方案。cc - 5012)细胞分离。coculture实验,THP-1第一次刺激巨噬细胞干扰素-γ/有限合伙人或il - 4的72小时完成RPMI 1640年24-well细胞培养介质插入(0.4μ米孔, , ;热费希尔科学)。THP-1介质代替血清RPMI 1640中、和插入被转移到井AoAF ( )在无血清SCGM。THP-1巨噬细胞刺激了10μ存在与否的PDBu 1000 U /毫升PEG-catalase (Sigma-Aldrich没有。C4963)和文化孵化为进一步溶解产物前24小时收获了西方墨点法。

2.4。RNA提取和实时PCR

从巨噬细胞总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。RNase-free DNase(试剂盒)被用来消除污染的DNA。RNA的数量在每个样本量化使用NanoDrop 1000 d分光光度计(热科学),测量吸光度在260 nm和280 nm。一个一个260年:一个280年比2个或更多的被认为是足够的纯。1μ克从每个样本反向转录成RNA cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)反应在热循环中运行(Bio-Rad MyCycler, Bio-Rad实验室)。合成cDNA被用作模板的实时PCR TaqMan®il - 1的引物和探针β,CCR7 CXCL11 MRC-1、CCL22 CCL18, CYBA (p22phox) CYBB (NOX2) NCF1 (p47phox) NCF2 (p67phox) NCF4 (p40phox) NOX1, NOX4, NOX5, SOD1, SOD2, SOD3(应用生物系统公司)。β肌动蛋白和18岁被用作看家基因。实时PCR是一式三份的CFX96触摸™实时PCR检测机(Bio-Rad实验室)。基因表达是正常β肌动蛋白或18岁和量化相对于平均水平Φ使用价值比较循环阈值(Ct)方法与公式: (23]。

2.5。蛋白质提取和免疫印迹

从巨噬细胞和成纤维细胞细胞总蛋白溶菌产物收集在1.5×Laemmli缓冲区(7.5%甘油;3.75%β巯基乙醇;2.25% SDS;75毫米Tris-HCl pH值6.8;0.004%溴酚蓝)和1×里帕裂解和提取缓冲(细胞信号技术,美国),分别。细胞碎片是通过离心(13000 rpm, 10分钟,4°C)和上层的收集。蛋白质浓度测定使用修改后的洛瑞协议(RCDC蛋白质比色试验设备;Bio-Rad实验室)或bicinchoninic酸- (BCA)基于比色定量(皮尔斯TMBCA蛋白质测定、热科学)。等效量的蛋白质在1.5×Laemmli缓冲区被加载到7.5%或10%聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质是由sds - page分离和转移到低荧光聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用Bio-Rad反式吸涡轮传输系统(Bio-Rad实验室)。膜被封锁Tris-buffered脱脂牛奶5%生理盐水(TBS;三,200毫米150毫米氯化钠,pH值7.5)有0.1% Tween-20 1小时,随后探讨了主要抗体NOX2 (1: 500;圣克鲁斯。sc - 130549 (CL5)), p47phox (1: 1000;BD转导实验室。610354),p67phox (1: 2000;EMD微孔。 07-002), SOD2 (1 : 1000; EMD Millipore no. 06-984), SOD3 (1 : 1000; EMD Millipore no. 07-704),αSMA (1: 2500;Abcam没有。ab5694)或胶原蛋白1 (1:1000;Abcam没有。ab34710),管家蛋白GAPDH (1: 20000;Abcam没有。ab8245)一夜之间在4°C。1小时孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭anti-rabbit (1: 10000;Dako)或anti-mouse (1: 10000;杰克逊ImmunoResearch实验室)二级抗体然后使用清晰呈现和蛋白质执行乐队ECL衬底(Bio-Rad实验室)和ChemiDoc议员系统(Bio-Rad实验室)。 Densitometries of protein bands were quantified using Image Lab Software (Bio-Rad Laboratories) and normalised to the housekeeping protein, GAPDH.

2.6。超氧化物通过l - 012增强化学发光检测

THP-1或人类初级巨噬细胞被播种和激活白色96孔细胞培养板(PerkinElmer) 和 ,分别。组与对照组游离设置一式五份,包括媒体,包括提供背景参考。当天实验,培养基被细胞被洗和孵化温暖Krebs-HEPES缓冲区(4.7毫米118毫米氯化钠,氯化钾,1.2毫米KH2阿宝4,1.2毫米MgSO4h·72啊,2.5毫米CaCl225毫米NaHCO320毫米,11.7毫米葡萄糖,消息灵通的;pH值7.4)和背景化学发光测量30分钟。化学发光测定使用变色龙发光板读者(Hidex有限公司,图尔库,芬兰)和数据获得使用MicroWin (Mikrotek Overath,德国)数据采集系统。100年μM l - 012和光纯化学工业(kouichi)被添加到每个好,和基底超氧化物含量监测30分钟。最后,蛋白激酶C (PKC)的激活PDBu (10μ米)被添加到每个和过氧化物生产然后测量进一步30分钟。PDBu-stimulated过氧化物生产量化的平均信号峰值超过5分钟。每个信号的基底信号减去(平均在最后5分钟)。在一个子集的实验中,细胞治疗与超氧化物歧化酶(SOD);1000 U /毫升;人类重组,表达大肠杆菌;Sigma-Aldrich S9076)试验开始前,确认信号特异性超氧化物。

2.7。过氧化氢检测通过Amplex红色

THP-1巨噬细胞被播种和激活在黑色96孔细胞培养板(PerkinElmer) 一式五份。当天实验,媒体被细胞与Krebs-HEPES溶液清洗,Krebs-HEPES添加到每个在没有或1000 U /毫升草皮或PEG-Catalase的存在。工作Amplex红色的解决方案(表达载体),包括Amplex红(5μ0.2米)和合(U /μl),然后添加到样本井和荧光检测到超过90分钟使用Hidex变色龙板读者在37°C (520 nm激发过滤器,590海里排放过滤器)。与10细胞离开如果或刺激μM PDBu立即前阅读。最后从每组荧光测量是安装在一个过氧化氢标准曲线(0 - 5μ米)。折叠过氧化氢浓度的变化计算相对于MΦ值记录在同一天。

2.8。细胞内活性氧检测通过贴现

与干扰素- THP-1巨噬细胞被刺激γ/有限合伙人或il - 4 1640年完成RPMI 72小时中6-well盘子上 。贴壁细胞被洗与温暖PBS孵化前细胞渗透ROS-sensitive染料,5 - (6)-chloromethyl-2 ,7 - - - - - -(CM-H dichlorodihydrofluorescein二乙酸,乙酰酯2DCFDA;贴现;1μ米,Sigma-Aldrich没有。D6883) 30分钟37°C。细胞然后用10左如果或刺激μM PDBu进一步30分钟。在实验的一个子集,巨噬细胞被孵化与1000 U /毫升PEG-Catalase PDBu刺激前15分钟。刺激后,细胞分离与Accutase®方案(Sigma-Aldrich),在1500转离心5分钟和resuspended PBS。LSR II上细胞进行流式细胞分析仪(BD生物科学)。褶皱DCF荧光的变化计算相对于MΦ值记录在同一天。

2.9。统计分析

所有的数据表示为 。比较多种治疗组用一个普通或重复措施单向方差分析(方差分析),Dunnett或Sidak事后测试,分别。当比较两组学生的未配对 - - - - - -测试使用。 被认为是显著和数据绘制图表和分析使用GraphPad Prism 7.02软件。

3所示。结果

3.1。M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞表达M1和M2标记,分别,表型演示增强超氧化物的一代

治疗的PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞和人类初级monocyte-derived M-CSF-differentiated巨噬细胞,与干扰素-的结合γ和有限合伙人,会导致显著增加在M1基因的表达(CXCL11、CCR7和il - 1β)。在THP-1细胞,CXCL11(图1(一))和CCR7(图1(b)增加了1000倍,最大的变化观察治疗后24小时。il - 1β表达增加与5 - 10倍在72小时治疗期(图1(c))。的大小增加M1基因在原发性巨噬细胞较大,CXCL11 ~ 5000倍的增加(图1(d)), CCR7(图~ 2000倍1(e))和il - 1 ~ 200倍β明显(图6小时1(f))。il - 4治疗导致M2增加标记MRC-1 (CD206)在治疗期约5倍THP-1和初级巨噬细胞(数字1(g)和1(j))。M2增加时间标记CCL18和观察CCL22 CCL18升高15 - 800倍(数字1(h)和1(k)和CCL22 20 -和5倍(数字1(我),1(左)),分别在THP-1和初级巨噬细胞。


图1
时间的mRNA表达人类巨噬细胞M1和M2标志。PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞或M-CSF-differentiated人类初级巨噬细胞是不及时治疗(MΦ)或与干扰素治疗γ和有限合伙人(THP-1: 5/10 ng / ml;主:20/100 ng / ml;干扰素-γ+ LPS)或il - 4 (25 ng / ml) 3 - 72小时。信使rna的表达M1 (CXCL11 (a, d);CCR7 (b, e)和il - 1β(c、f))和M2 (MRC-1 (g, j);CCL18 (h, k);CCL22 (l)我)标记由RT-qPCR并表示相对于未经处理的巨噬细胞(MΦ)。结果提出了 , 。 , 与米Φ(1路的方差分析其次是Dunnett事后测试)。

在证明微分激活巨噬细胞,我们下一个评估基底,在M (IFN - PDBu-stimulated超氧化物的一代γ+ LPS)和M (il - 4)后72小时和24小时,THP-1和人类主要的巨噬细胞,分别。THP-1细胞,而基过氧化物水平激活巨噬细胞在不同国家之间没有显著差异,PDBu-stimulated过氧化物生成增加了115% ~ 219%,~ M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,分别比未经处理的巨噬细胞(数字2(一)和2(b))。值得注意的是,基底和PDBu-stimulated超氧化物信号在初级巨噬细胞大得多比THP-1(数字2(c)和2(d))。峰值超氧化物生成响应PDBu在未经治疗的原发性巨噬细胞( 数/秒)~ 30倍比未经处理的THP-1巨噬细胞( 数/秒)。尽管如此,PDBu-stimulated过氧化物生成类似于主M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞和91%大于观察MΦ(图2(d))。l - 012化学发光信号被确认为超氧化物通过特定的治疗与超氧化物歧化酶(补充图1模拟)。


图2
PDBu-stimulated过氧化物生成在人类巨噬细胞激活。PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞(a, b)或M-CSF-differentiated人类初级巨噬细胞(c, d)不及时治疗(MΦ)或与干扰素治疗γ+有限合伙人(M1)或il - 4 (M2) 24 (THP-1)或72小时(初级巨噬细胞)和超氧化物生成通过l - 012增强化学发光检测。左手边(lh):平均记录展示初始背景阅读(min)外墙面,基底超氧化物作为之后发现添加l - 012 (100μM;31-60和PDBu(10分钟)μ米)刺激过氧化物生成(61 - 90分钟)测量发光强度在任意单位(a.u)(一)THP-1和(c)主要的巨噬细胞。右手边(RHS):峰值PDBu-stimulated(基底信号减去)过氧化物生成(b) THP-1和主巨噬细胞(d)。所有的结果作为 , 。 , 与米Φ(1路的重复测量方差分析其次是Dunnett事后测试)。
3.2。微分调节NOX2氧化酶亚基表达干扰素-γ+ LPS刺激与il - 4

检查机制导致增加M (IFN -过氧化物生成γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,氮氧化物同种型和亚基表达进行了评估。因此,NOX2氧化酶包括膜结合催化亚基,NOX2 p22phox,胞质调节亚基一起p47phox, p67phox, p40phox。在THP-1巨噬细胞,NOX2信使rna干扰素-后增加约2倍γ+ LPS激活,激活巨噬细胞il - 4(图中保持不变3(a))。有趣的是,mRNA的表达p47phox亚基在M (IFN -调节γ在24小时+ LPS)巨噬细胞(20倍;3年来在48和72小时,图3(b)),而p67phox亚基在M (il - 4)调节巨噬细胞(3年来在48和72小时,图3(c))。p22phox和p40phox子单元持平(补充图2 a和b)。NOX2蛋白表达似乎没有巨噬细胞在不同的激活状态(图之间的不同3(d));然而,观察p47phox和p67phox mRNA的变化被发现转化为增加蛋白表达。p47phox蛋白质在M (IFN -增加了约2.5倍γ+ LPS)巨噬细胞(图3(e))而p67phox蛋白质增加约2倍在M (il - 4)巨噬细胞(图3(f))。THP-1巨噬细胞相比,干扰素-γ+ LPS刺激人类主要的巨噬细胞与NOX2亚基的改变无关mRNA的表达。虽然减少NOX2 mRNA在M (il - 4)巨噬细胞在24小时(图3(g)), NOX2持平于蛋白质(图的水平3(j))。当时间增加p47phox mRNA(6小时,图3(h)和p67phox mRNA(24小时,图3(我)也与M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)刺激,分别在人类原发性巨噬细胞,这些变化并没有观察到的蛋白(数字3(k)和3(左))。此外,观察p22phox mRNA表达无显著差异。p40phox亚基在mRNA水平下降主要M (IFN -γ+ LPS)巨噬细胞(补充图2 d和e),但这是否翻译减少p40phox蛋白质还没有得到确认。NOX1和NOX4 mRNA无法检测到THP-1或初级巨噬细胞的激活状态( )。观察NOX5 mRNA表达但是THP-1细胞系和增加巨噬细胞激活时il - 4(补充图2 c和f)。


图3
NOX2氧化酶亚基表达人类巨噬细胞激活。PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞或M-CSF-differentiated人类初级巨噬细胞是不及时治疗(MΦ)或与干扰素治疗γ+有限合伙人(M1)或il - 4 (M2) 3 - 72小时。时间进程NOX2 (g), p47phox (b、h)和p67phox (c i) mRNA表达由RT-qPCR并表示相对于平均MΦ(治疗)的价值。蛋白质的表达NOX2 (d, j), p47phox (e、k),和p67phox (f、l) 24(初级巨噬细胞)或72小时后(THP-1巨噬细胞),通过西方墨点法确定。代表的屁股,描绘 ,下面显示了每个图GAPDH用作加载控制。所有的结果作为 , 。 , , 与米Φ(1路的方差分析其次是Dunnett事后测试)。

确认超氧化物信号THP-1巨噬细胞确实是NOX2 oxidase-derived, NOX2 siRNA是利用击倒所有巨噬细胞表型的表达。在M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,NOX2 mRNA表达降低了74%(图4(一))和79%(图4(d)),分别后NOX2 siRNA治疗相比,巨噬细胞处理错义核。在巨噬细胞的表型,有一个趋势错义核增加PDBu-stimulated超氧化物水平高于vehicle-treated细胞(数字信号4(c)和4(f))。尽管如此,显著减少NOX2表达式M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞减毒超氧化物信号类似于未经处理的巨噬细胞中观察到的水平。具体来说,治疗NOX2 siRNA降低了峰值PDBu-stimulated超氧化物信号M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4) 71%(图4(c))和78%(图4分别(f))。


图4
影响NOX2 siRNA M1和M2 macrophage-derived超氧化物。击倒THP-1 NOX2 mRNA表达的巨噬细胞使用NOX2 siRNA证实了在巨噬细胞与干扰素治疗γ+有限合伙人(a)和il - 4 (d)巨噬细胞通过RT-qPCR 72小时,并表示相对于平均水平Φ(治疗)的价值。NOX2 siRNA效果和错义siRNA PDBu-stimulated超氧化物信号M (IFN -γ/有限合伙人)和M (il - 4)巨噬细胞通过l - 012增强化学发光检测。(b, e)平均记录展示初始背景阅读(min)外墙面,基底超氧化物作为之后发现添加l - 012 (100μM;31-60 min), PDBu (10μ米)刺激过氧化物生成(61 - 120分钟)测量发光强度在任意单位(a.u) M (IFN -γ/有限合伙人)(b)和M (il - 4) (e)巨噬细胞。(c、f)峰值PDBu-stimulated(基底信号减去)过氧化物生成在M (IFN -γ+ LPS) (c)和M (il - 4) (f)巨噬细胞。所有的结果作为 , 。 , 与米Φ(1路的重复测量方差分析其次是Dunnett事后测试)。
3.3。米(il - 4)巨噬细胞活化与过氧化氢生成增加

除了过氧化物、过氧化氢生成评估在两极分化THP-1巨噬细胞使用两种方法,Amplex红色细胞外和H2DCFDA (DCF)细胞内检测。值得注意的是,一个健壮的基底过氧化氢信号检测,Amplex红和DCF,巨噬细胞表型和没有进一步调制PDBu刺激(补充图1 e和f)。然而,后续实验比较过氧化氢生成激活巨噬细胞在不同状态之间结合PDBu。Amplex红色荧光,PDBu刺激90分钟后,显示的意思是过氧化氢的浓度大约2μ相比,M为M (il - 4)巨噬细胞为1μ在两米(IFN - Mγ+ LPS)和MΦ(图5(b))。当计算相对于MΦ信号,增加了1.5倍后过氧化氢生成M (il - 4) M (IFN -激活没有变化γ+ LPS)巨噬细胞(图5(c))。过氧化氢信号被废除的过氧化氢基清除剂,PEG-catalase,与超氧化物歧化酶和放大,证明分析是专门针对过氧化氢(补充图1 g和h)。进一步证明增加过氧化氢生产M (il - 4)巨噬细胞,细胞内ROS指示器DCF通过流式细胞仪和荧光检测(使用数字5(d)和5(e))。与Amplex红试验、过氧化氢含量显著大于M (il - 4),比M (IFN -γ+ LPS)巨噬细胞(图5(e))。如代表直方图(图所示5(d)), PEG-catalase减少了信号M (il - 4)巨噬细胞,这表明它主要是过氧化氢被发现。


图5
PDBu-stimulated过氧化氢生成在人类巨噬细胞激活。不及时治疗(M PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞Φ)或激活干扰素-γ+有限合伙人或il - 4为72小时。(一)平均跟踪描绘PDBu(10的积累μ米)刺激过氧化氢在文化媒体超过90分钟通过Amplex红色荧光检测。(b)过氧化氢浓度在90分钟计算,表示为 。(c) M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)过氧化氢浓度表示为一个褶皱变化相对于未经处理的巨噬细胞(MΦ)控制, 。(d)代表对DCF直方图和控制策略+巨噬细胞,描绘M1和M2两极分化和catalase-polyethylene醇的影响(PEG-Cat;1000 U /毫升)M2的信号。(e)意味着贴现+未经处理的巨噬细胞(巨噬细胞,正常反应Φ), 。SOD2 SOD1 (f) (g),和(h) SOD3 mRNA表达THP-1激活巨噬细胞在24日,48岁,72小时,由RT-qPCR表示相对于平均水平Φ(治疗)的价值, 。(我)SOD2和(j) SOD3蛋白表达在72小时THP-1激活巨噬细胞,由西方墨点法, 。代表的屁股,描绘 ,上显示,与GAPDH作为加载控制。所有的结果表示为 , , (1路的方差分析Dunnett紧随其后的事后测试(g、h、i)或学生的未配对 - - - - - -测试(c, e))。

阐明潜在机制增加过氧化氢生成il - 4激活后,我们评估的mRNA表达不同的超氧化物歧化酶亚型。而SOD1(细胞质)表达式没有改变(图5(f)), SOD2(线粒体)mRNA表达干扰素-增加γ+ LPS-activated巨噬细胞在24小时25倍和10倍(图48和72小时5(g))。这种变化反映在蛋白质水平,增加了三倍在M (IFN - SOD2的表情γ(图+ LPS)巨噬细胞在72小时5(我))。SOD3(细胞外)mRNA表达在应对干扰素-不变γ+ LPS激活但增长了4倍IL-4-activated巨噬细胞在72小时(图5(h))。但是,没有改变SOD3观察蛋白表达(图5(j))。

3.4。过氧化氢生成有助于Profibrotic M (il - 4)巨噬细胞的活性

调查是否米(il - 4) macrophage-derived过氧化氢的profibrotic行动可能导致M2巨噬细胞在血管壁巨噬细胞与人类cocultured主动脉外膜成纤维细胞和纤维化的标记(胶原蛋白1,αSMA)测量。Coculture主动脉成纤维细胞与米(il - 4)巨噬细胞增加了成纤维细胞胶原蛋白1表达,与未经处理的(M Coculture相比Φ巨噬细胞(图)6(a))。PEG-catalase治疗显著减弱这种影响(图6(a))。主动脉纤维母细胞αSMA表达没有回应coculture差异(图与巨噬细胞在不同的激活状态6(b)),这表明缺乏macrophage-derived过氧化氢对myofibroblast分化的影响。


图6
影响巨噬细胞在胶原蛋白和alpha-smooth coculture肌肉肌动蛋白表达在人类主动脉外膜成纤维细胞。不及时治疗(M PDBu-differentiated THP-1巨噬细胞Φ)或激活干扰素-γ+有限合伙人或il - 4 72小时在细胞培养中插入。THP-1巨噬细胞随后被转移到井包含主动脉外膜成纤维细胞,刺激和10μM PDBu没有PEG-catalase或存在1000 U /毫升、和孵化24小时。(一)胶原蛋白1和(b)αSMA蛋白质测定主动脉外膜成纤维细胞, 。(c)代表污点,描绘 ,显示与GAPDH用作加载控制。结果提出了 , , (1路的方差分析其次是Sidak事后测试)。

4所示。讨论

M1巨噬细胞渗透到组织炎性疾病的标志,和NOX2氧化酶活动长期以来一直与M1相关函数(2]。在这项研究中,我们挑战ROS生成的想法是完全M1巨噬细胞的功能。具体来说,我们表明,活化的巨噬细胞il - 4增强超氧化物生成同等程度上激活的巨噬细胞与干扰素-γ有限合伙人和增加过氧化氢生产。主动脉硬化,特别相关的一个重要的发展过程和临床高血压的后果24,25),我们揭示潜在的角色M2 macrophage-derived过氧化氢在促进profibrotic主动脉外膜成纤维细胞的反应。

Upregulation NOX2氧化酶的活动中观察到巨噬细胞与Th1细胞因子刺激干扰素-γ或细菌组件有限合伙人作为回应的一部分微生物感染(5,7]。这通常被认为是一个特定的M1巨噬细胞功能(15]。虽然il - 4可以抑制LPS-stimulated,但提高干扰素-γ刺激,巨噬细胞的活性氧产量(26),我们是第一个证明它可以驱动增加巨噬细胞过氧化物生产。重要的是,超氧化物信号在两个激活巨噬细胞的数量至少是2倍比未经处理的巨噬细胞和被证实使用NOX2 siRNA NOX2-derived。我们的发现与Th2细胞因子刺激巨噬细胞il - 4的结果增加NOX2-derived ROS进一步支持NOX2的贡献对M2巨噬细胞表型的激活,建议在先前的研究[27,28]。应该注意的是,我们的研究结果是不一致的与Kraaij et al .(2013)的研究,报告减少ROS当巨噬细胞分化发生在il - 4的存在。然而,不同的方法论的方法也许可以解释这些明显的差异。因此,Kraaij et al。(2013)治疗人类主要单核细胞中il - 4 7天- csf分化期(18),而不是postdifferentiation, M2巨噬细胞激活的更普遍接受的方法29日- - - - - -31日]。因此,先前的研究可能表明il - 4的影响在单核细胞向巨噬细胞分化而不是巨噬细胞ROS生成本身。

尽管公认法则相反,M1巨噬细胞是主要ROS-generating巨噬细胞表型(2,9),我们观察到米(il - 4)巨噬细胞功能还可能涉及到ROS或许并不出人意料。M2巨噬细胞吞噬细胞碎片作为组织修复功能的一部分(32)和角色ROS的吞噬作用是有据可查的33]。的确,ROS已被证明发挥重要的信号作用激活的巨噬细胞对M2在人类和小鼠表型(27,28)和M2巨噬细胞积累和伤口愈合反应在活的有机体内没有NOX1受损和NOX2老鼠(27]。除了潜在的角色在伤口愈合、炎症的贡献NOX2-derived ROS的决议也出现了(34,35]和M (il - 10) macrophage-derived ROS已被证明诱导t调节细胞的激活(36]。总的来说,这些先前的研究支持NOX2氧化酶的参与我们的研究,不仅在促炎M1巨噬细胞的功能,还在其他激活状态,显示角色在免疫调节和profibrotic响应NOX2除了著名的角色在炎症和微生物杀死。

进一步研究NOX2氧化酶的作用在M (il - 4)巨噬细胞活性氧生成,我们检查了个人NOX2氧化酶亚基的表达。我们的发现对于NOX2亚基表达表明每个巨噬细胞表型的机制增加超氧化物不同。Upregulation p47phox,程度较轻,NOX2催化亚基似乎M (IFN -驱动增加γ+ LPS)巨噬细胞超氧化物的一代。角色的每个子单元在促进NOX2活动已被证明之前(37,38]。此外,我们的结果在THP-1人类单核细胞巨噬细胞与先前的研究一致(MonoMac1细胞株)的促炎细胞因子,肿瘤坏死因子α、增强p47phox、p67phox NOX2表达式的等级次序表达式被p47phox(高达20倍)> p67phox(5倍)> NOX2(2.5倍)37]。NOX2和p47phox表达促炎的下游信号通路包括转录因子与M1巨噬细胞激活,如核转录因子激活B细胞(NF的轻链增强剂κB) (39)、信号传感器和转录激活(STAT) 140),而干扰素调节因子- (IRF) 1 (40,41]。这些增长在M (IFN - NOX2亚基的表达γ+ LPS)因此预期。相比之下,il - 4的治疗与upregulation p67phox亚基的孤独。虽然有待调查,这可能是通过诱导STAT3 (42,43)和p38增殖蛋白激酶(MAPK) [44- - - - - -46通过il - 4],利用信号通路。应该承认,当前研究的一个限制是,我们的研究结果增强p47phox和M (IFN - p67phox表达式γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞并没有观察到蛋白质水平在人类主要的巨噬细胞。这可能是由于供体血液单核细胞的异质性而THP-1行盛行不衰,但质疑这些结果的相关性并突出确认主细胞中观察的重要性。

总的来说,我们的数据支持NOX2氧化酶的主要角色从激活巨噬细胞过氧化物的生成。然而,在协议与最近的报告47,48),我们也观察到NOX5表达式,至少在mRNA水平,巨噬细胞表型。此外,NOX5 mRNA表达被THP-1细胞中il - 4调节。尽管NOX2 siRNA治疗显示,超氧化物信号主要NOX2-derived,贡献的NOX5信号不能被排除在外,尤其考虑到它也可以通过PKC激活(PDBu刺激引起的)49,50]。尽管如此,我们首次展示,M (IFN -过氧化物生成能力γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞是等价的,主要通过NOX2氧化酶。

代后,过氧化物可以与一氧化氮形成强大的氧化剂,过氧亚硝基,或者dismutated形成过氧化氢。考虑M1和M2巨噬细胞的促炎和赔偿的性质,分别,我们建议在两个表型产生类似水平的过氧化物,最终氧化最终产品可能有所不同。重要的是,我们证明了增加细胞外和细胞内过氧化氢活化后对M2表型与il - 4, M1的效果并没有明显激活干扰素-γ和有限合伙人。同意这一发现il - 4的刺激,一项研究报道,增强macrophage-derived过氧化氢和铜、Zn-SOD (SOD1)表达与M2两极分化在肺纤维化的设置51]。虽然我们没有检测SOD1 mRNA的变化,适度增加细胞外SOD (SOD3) mRNA观察il - 4的治疗后,虽然这并没有转化为增强SOD3巨噬细胞溶菌产物的蛋白质。应该承认,我们调查的M2巨噬细胞过氧化氢生成需要进一步探索确定精确的机制。还有待决定如果过氧化氢酶的调节或抗氧化酶如glutathionine过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)表达也可能影响这些细胞过氧化氢含量。此外,NOX2-derived超氧化物歧化作用不一定是过氧化氢信号观测的主要来源。由于缺乏PDBu刺激本身对过氧化氢的影响,一个既定的活跃peroxide-producing氢酶,如NOX4,可以参与。虽然我们没有检测NOX4 mRNA在任何我们的巨噬细胞样本,NOX4 mRNA和蛋白表达在最近的两项研究已经观察到人类主要的巨噬细胞(52,53]。进一步调查NOX4蛋白质的表达和使用NOX2和NOX4 siRNA将帮助识别的M2 macrophage-derived过氧化氢的来源。未来的研究应该解决这些限制除了在活的有机体内实验描述M2巨噬细胞过氧化氢生产组织,例如在血管壁内,在高血压。

有点令人吃惊的是,M (IFN -γ+ LPS)巨噬细胞并没有表明过氧化氢产量的增加,尽管增加超氧化物生产SOD在这些细胞的观察和表达。虽然不是调查在这项研究中,伊诺是常用的标记M1巨噬细胞(2]。潜在的,进气阀打开这些细胞SOD体型,因此,产生的过氧化物与一氧化氮生成过氧亚硝基反应迅速,而不是dismutated形成过氧化氢。这还有待全面调查。有趣的是,潜在的增加了线粒体过氧化氢生成M1观察巨噬细胞在我们的研究中线粒体SOD同种型upregulation强劲,SOD2,联合干扰素-γ/ LPS刺激。这符合toll样受体激活后发现和LPS刺激的巨噬细胞54,55]。虽然增加SOD2的表情并没有增加在M (IFN -过氧化氢生成γ+ LPS)巨噬细胞在我们的研究中,我们没有专门研究线粒体ROS,它不会释放细胞。很有可能SOD2 upregulation可能机制M1巨噬细胞在感染和防止氧化应激可能与线粒体功能障碍,M1激活转移细胞从氧化糖酵解代谢56,57),而M2激活增加线粒体所示内容和氧化磷酸化57]。因此,巨噬细胞表型可能影响线粒体ROS生产和线粒体功能障碍可能导致整个氧化M1巨噬细胞的能力。有趣的是,巨噬细胞硫醇氧化应激增加,与代谢相关的压力,已经被证明可以增强导致增强巨噬细胞趋化性招聘在动脉粥样硬化的设置58]。将是有趣的调查我们是否激活巨噬细胞文化也证明改变在谷胱甘肽(GSH) /二硫化谷胱甘肽(GSSG)比和趋化现象的反应,这是否也可能与这些细胞的生物能学的差异。

尽管进一步调查的讨论机制很重要,过氧化氢生成似乎是一个函数的M (il - 4)巨噬细胞和可能涉及纤维化疾病。ROS已被证明有助于多种profibrotic和改造在血管壁的行为(59- - - - - -62年]。因此提高过氧化氢在血管和心脏细胞ROS生产在体外(19,63年)在完整的血管,促进改造(59]。我们下一个试图确定如果M (il - 4) macrophage-derived过氧化氢可以促进血管纤维化。的确,coculture IL-4-stimulated巨噬细胞与主动脉成纤维细胞导致成纤维细胞胶原蛋白1表达,增加一个否定的过氧化氢基清除剂效果,PEG-catalase,与M (IFN -不明显γ+ LPS)巨噬细胞coculture。值得注意的是,macrophage-derived过氧化氢,无论是来自MΦ,米(IFN -γ+ LPS),或者米(il - 4)巨噬细胞,似乎没有引起myofibroblast分化(检测到αSMA表达)。尽管如此,更大的能力(il - 4)巨噬细胞生成过氧化氢和促进胶原蛋白生产可能导致主动脉改造和加强反应观察到由于M2巨噬细胞聚集在高血压老鼠的血管壁14]。未来的研究应该调查profibrotic M2-derived过氧化氢的影响是否也观察到在其他细胞参与主动脉僵硬如血管平滑肌细胞和小鼠模型的验证结果高血压,以便对这些机制。

5。结论

本研究比较了ROS-generating M1和M2巨噬细胞的能力,发现之前的未被确认的ROS作用M2巨噬细胞的功能。虽然以往被视为一个关键M1巨噬细胞活动的中介,我们已经表明,增加NOX2-derived过氧化物生成IL-4-stimulated M2激活后也会发生。此外,我们表明,il - 4增加巨噬细胞过氧化氢,促进提高主动脉成纤维细胞胶原合成在主动脉纤维化强调潜在的作用。鉴于M2巨噬细胞的作用在高血压、主动脉硬化的发展我们的发现可能是特别重要的在这个设置和我们透露M2-derived ROS作为一个潜在的治疗目标。

数据可用性

RT-qPCR、免疫印迹和活性氧检测数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们承认Meritxell运河博士为我们提供THP-1细胞系和澳大利亚红十字会血液服务提供捐赠巴菲外套PBMC隔离。格兰特教授德拉蒙德的高级研究奖学金支持澳大利亚国家健康与医学研究理事会(NHMRC) (GNT1006017),当副教授Chrishan塞缪尔支持NHMRC高级研究奖学金(GNT1041766)。这项工作被NHMRC格兰特GNT1041326支持。

补充材料

过氧化物和过氧化氢生成在M (IFN-γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞。基底,在M (IFN - PDBu-stimulated超氧化物的一代γ+ LPS)和M (il - 4)后72小时和24小时,THP-1和人类主要的巨噬细胞,分别评估使用l - 012化学发光。l - 012化学发光信号被确认为超氧化物通过特定治疗超氧化物歧化酶模拟(补充图1)。除了过氧化物、过氧化氢生成评估在两极分化THP-1巨噬细胞使用两种方法,Amplex红色细胞外和H2DCFDA (DCF)细胞内检测。值得注意的是,一个健壮的基底过氧化氢信号检测,Amplex红和DCF,巨噬细胞表型和没有进一步调制PDBu刺激(补充图1 e和f)。过氧化氢信号被废除的过氧化氢基清除剂,PEG-catalase,与超氧化物歧化酶和放大,表明过氧化氢的测定是特定(补充图1 g和h)。微分调节NOX2氧化酶亚基表达后IFN-γ+ LPS刺激与il - 4。检查机制导致增加M (IFN -过氧化物生成γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞,氮氧化物同种型和亚基表达进行了评估。因此,NOX2氧化酶包括膜结合催化亚基,NOX2 p22phox,胞质调节亚基一起p47phox, p67phox, p40phox。没有观察到显著差异在THP-1 p22phox mRNA表达和初级M (IFN -γ+ LPS)和M (il - 4)巨噬细胞(补充图2 a和d)。p40phox亚基在mRNA水平下降主要M (IFN -γ+ LPS)巨噬细胞(补充图2 d和e),然而这个翻译是否减少p40phox蛋白还没有得到确认。NOX1和NOX4 mRNA无法检测到THP-1或初级巨噬细胞的激活状态( )。观察NOX5 mRNA表达但是THP-1细胞系和增加巨噬细胞激活时il - 4(补充图2 c和f)。(补充材料)