文摘
干扰素-γ和il - 22生成深入参与银屑病的发病机制,促进炎症基因的表达,改变角化细胞的增殖和分化程序。JAK1 / JAK2 / STAT1和JAK1 / TYK2 / STAT3通路引发的干扰素-γ分别和il - 22生成,在牛皮癣异常激活,也突出了这奇特的STAT1和STAT3签名在银屑病皮肤损伤。干扰素-限制有害的后果γ和il - 22生成过度刺激,银屑病角质细胞激活抑制细胞因子的信号(soc) 1和SOCS3,进而抑制分子信号通过抑制JAK1和JAK2。因此,木菠萝的目标似乎是一个合理的策略来治疗牛皮癣。Tofacitinib木菠萝蛋白的抑制剂,类似于soc,阻碍木菠萝磷酸化。在这项研究中,我们评估tofacitinib在表皮角化细胞的免疫调节作用在体外和在活的有机体内牛皮癣的模型。我们演示了tofacitinib的选择性抑制作用对干扰素-γ在TNF和il - 22生成,但不是-γ或IL-17炎性信号、抑制干扰素的表达γ端依赖炎性基因,恢复正常的增殖和分化程序改变银屑病角化细胞il - 22生成的文化。Tofacitinib也有效地减少了psoriasiform表型imiquimod-induced小鼠银屑病模型。最后,我们发现tofacitinib模仿SOCS1或SOCS3活动,因为它同样的分子途径在干扰素-受损γ或IL-22-activated角质细胞。
1。介绍
牛皮癣是一种免疫介导性皮肤疾病的特点是表皮异常和著名的炎性细胞浸润1- - - - - -3]。当前对银屑病的发病机制强调的角色驱动炎症细胞因子信号周期,树突细胞浸润和autoreactive T淋巴细胞,主要由IL-17-producing T细胞,T-helper-1 (Th1)和Th22细胞,释放IL-17,干扰素-γ、il - 22生成和肿瘤坏死因子-α。所有这些细胞因子诱导的角化细胞表达大量的免疫招聘中介因素和额外的树突状细胞和T淋巴细胞激活,进而加强致病性周期延续角化细胞激活(4- - - - - -6]。尤其是促炎细胞因子,il - 22生成和IL-17,还负责增生和改变终端角质细胞的分化,以及凋亡通路的障碍,所有牛皮癣的典型特征4- - - - - -6]。因此,干扰素,γ和炎性细胞因子il - 22生成深入参与银屑病的发病机理,及其Janus激酶(激酶)1 / JAK2 /信号传感器和转录的活化剂(STAT) 1和JAK1 /酪胺酸激酶(TYK) 2 / STAT3近端信号异常激活,也突出了STAT1和STAT3签名在银屑病皮肤损伤7- - - - - -10]。此外,IL-17和TNF -α促炎细胞因子引起的免疫反应在银屑病角质细胞,通过分子途径独立JAK / STAT和NF -κB、Act1 ERK1/2 [11,12]。
限制炎性细胞因子的过度刺激,角质细胞表达细胞因子信号的抑制(soc)分子,一个家庭的内源性抑制剂cytokine-dependent信号(6,13- - - - - -16]。SOCS1和干扰素- SOCS3函数作为强有力的抑制γ分别和角化细胞中il - 22生成信号传导等。在分子水平上,SOCS1和SOCS3抑制JAK1-2 pseudosubstrates功能,因此阻碍激活干扰素-γ和il - 22生成受体和下游统计数据。由于STAT1的丧失活动,角质细胞overexpressing SOCS1再也不能表达干扰素-炎症分子反应γ(13- - - - - -15]。同样,IL-22-induced角质化细胞增殖和antidifferentiative影响有效地抵消SOCS3-dependent STAT3抑制(15,17]。另一方面,在角化细胞soc不能影响JAK-independent分子通路,包括TNF -γ信号(13]。
因为在银屑病炎性细胞因子的重要性,木菠萝目标代表了一个逻辑策略来治疗这种疾病。各种激酶抑制剂在临床前开发或已在临床试验中测试。其中,tofacitinib是口服木菠萝抑制剂对木菠萝的细胞内机制的行动,已经在使用的全身治疗类风湿性关节炎(18),在评估斑块性银屑病的治疗(19和银屑病关节炎20.]。第三阶段是严重慢性斑块性银屑病患者的研究展现出的功效tofacitinib在改善临床结果(21]。木菠萝抑制tofacitinib强烈降低牛皮癣的临床症状,而有说服力地块通过常见的信号γ链工程受体,包括2、il - 4、IL-7 IL-9, IL-15,或通过规范化的受体细胞因子,如干扰素-γIL-21 il - 6,在较小程度上,il - 12和IL-23 [22]。在临床前模型,tofacitinib被证明影响先天和适应性免疫反应和抑制致病性T辅助(Th) 17细胞分化抑制IL-23表达式(23]。
而抑制t细胞活动的机制和调制tofacitinib分化的特征(23- - - - - -25),一些信息对psoriasis-related通路激活在居民角质细胞免疫调节的影响,或在其能力模仿soc存在这种药物抑制电路。在这项研究中,我们评估tofacitinib在表皮角化细胞的免疫调节作用在实验在体外和在活的有机体内牛皮癣的模型。特别是,我们研究了影响tofacitinib JAK / STAT通路和下游炎症分子在人类角化细胞文化激活与促炎的分子与牛皮癣有关,包括干扰素-γ,IL-17, TNF - il - 22生成γ,以及在活的有机体内咪喹莫特- (IMQ)诱导小鼠银屑病模型。我们也调查了影响tofacitinib其他蛋白质诱导干扰素-目标γ或者在角化细胞il - 22生成信号和模拟SOCS1 SOCS3活动。
2。材料和方法
2.1。角化细胞文化和治疗
人类角质细胞的主要文化从皮肤活检获得的银屑病患者( )传入在IDI-IRCCS第五皮肤病学单位和准备如前所述6]。患者明确plaque-type牛皮癣诊断根据标准标准,他们没有收到任何全身或局部治疗前至少1个月皮肤捐赠。皮肤活检后得到病人的知情同意书,IDI-IRCCS当地伦理委员会的批准(防。n 474/1/2016;研究:“工作室delle chinurenine在pazienti affetti da psoriasi”)。第二或第三段角化细胞被使用在所有的实验中,与细胞无血清培养系统在KGM (Clonetics,圣地亚哥,CA),至少3 - 5天(在60 - 80%融合)之前进行治疗。一些实验进行角化细胞文化接受终端分化,通过增加细胞融合的100% ( ),从而使他们在文化4 d。
刺激与200 U /毫升重组人类(rh)干扰素-γ(研发系统,明尼阿波利斯,美国),以及50 ng / ml rh TNF -α、il - 22生成或IL-17(从研发系统),在角化细胞进行基础培养基(KBM Clonetics)。Tofacitinib (CP 690550复合)是来自辉瑞公司(Peapack NJ)和由初加工文化细胞因子刺激前1 h。细胞毒性的tofacitinib之前测试通过测量活动的角化细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放文化,使用细胞毒性检测装备Plus-LDH(罗氏诊断、米兰、意大利),遵循制造商的指示。
2.2。免疫沉淀反应、免疫印迹和微
蛋白质的提取制备、免疫沉淀反应和免疫印迹进行相应的标准程序(6]。研究Abs用于如下:anti-IFN -γRα亚基(C-20) anti-IL-22R1 (3-RE40) anti-TYK2 (C-20)(从圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),anti-phosphotyrosine(克隆4 g10;生物技术,北部泰梅库拉,CA)、anti-JAK1 anti-JAK2(生物技术)北部,anti-phosphotyrosine——(pTyr701) STAT1(圣克鲁斯生物技术),anti-phosphoserine——(pSer727) STAT1 anti-phosphotyrosine——(pTyr705) STAT3和anti-phosphoserine——(pSer727) STAT3(细胞信号),anti-STAT1和anti-STAT3 (C-20)(圣克鲁斯生物技术),anti-phospho-ERK1/2 (E4;圣克鲁斯生物技术),anti-ERK1/2 (C-16;圣克鲁斯生物技术),anti-phospho-p65 (Ser276) anti-IκBα,HRP-conjugated anti-c-myc (9 e10汽油),anti-p63 (4 a4),反β肌动蛋白(所有从圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国),anti-keratin (KRT) 1,和anti-loricrin(来自Covance Meryville, CA)。过滤器与anti-mouse正确开发、抗体或anti-rabbit Ig Abs共轭合使用ECL-plus检测系统(Amersham、飞行、瑞士)或,否则,SuperSignal西方毫微微工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。免疫印迹实验受到微使用成像密度计模型分子支持的gs - 670 (Bio-Rad)分析师图像软件,和带强度评估在三个独立的实验。数据表示为褶皱感应±SD在实验时间进程相对于未经处理或tofacitinib-treated样本,而被赋予一个值为1。
2.3。瞬时转染和荧光素酶检测
培养角质细胞生长在six-well盘子是瞬变与STAT3-responsive质粒转染pLucTKS3(一个慷慨的礼物教授j . Turkson佛罗里达中央大学奥兰多FL)或pGASLuc质粒通过Lipofectin试剂(表达载体),根据制造商的指示。在24 h后转染,细胞使用tofacitinib 1 h,然后与il - 22生成或干扰素刺激γ8 h。在一个适当的缓冲细胞溶菌作用后(意大利Promega,意大利米兰),萤火虫荧光素酶活性测定使用Dual-Glo荧光素酶检测系统(Promega)。规范化的转染效率,pRL-null质粒编码的Renilla荧光素酶是包含在每个转染。荧光素酶活性进一步规范化细胞总蛋白质含量化验使用布拉德福德(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。
2.4。胞内信号数组
PathScan胞内信号阵列设备购买从细胞信号技术(细胞信号技术,贝弗利,马;目录# 7323)。这个数组允许18信号分子的同步检测磷酸化或裂解。包括ERK1/2, STAT1, STAT3 Akt (Thr308和Ser473磷酸化),AMPKa, S6核糖体蛋白,mTOR, HSP27、坏,p70 S6激酶,PRAS40, p53, p38, SAPK /物,PARP,半胱天冬酶3,GSK-3b。从角化细胞蛋白质溶解产物文化与干扰素治疗γ、il - 22生成或TNF -αtofacitinib的存在与否是准备用裂解缓冲后提供的设备和加工制造商的指示。Bio-Rad凝胶文档系统被用来拍详细的照片数组的使用数量一个软件使用ChemiDoc XRS函数。图表示为密度测量值单位和规范化的内部积极控制。
2.5。扩散分析
8×104细胞被播种在12-well盘子,KBM后的第二天,饿着。与干扰素刺激——文化γ、il - 22生成或TNF -α在进行tofacitinib的存在与否。治疗2 d后,细胞被台盼蓝排斥试验评估。结晶紫化验也执行评估增殖。因此,2×104细胞增长48 h 96 -孔板和结晶紫沾0.5%,其合并为540 nm的ELISA读者(3550型紫外ELISA读者;Bio-Rad大力神,CA)。
2.6。细胞凋亡分析
角化细胞的凋亡是评估使用FITC膜联蛋白V / propidium碘(PI)细胞凋亡检测设备(BD生物科学、米兰、意大利)。可行性、坏死和凋亡被流式细胞术分析。FACScan配备细胞细胞进行分析与探索软件。膜联蛋白V的百分比+π+和膜联蛋白V /π+角化细胞的细胞群进行评估文化不及时治疗或用干扰素治疗γ、il - 22生成或TNF -α在tofacitinib的存在与否。
2.7。RNA隔离和实时聚合酶链反应(PCR)
从角化细胞总RNA文化使用试剂盒提取试剂(表达载体);信使rna reverse-transcribed进cDNA,实时PCR分析。的表达人类SOCS3 S100A7, IL-20 HBD-2, LL-37, HPRT-1信使rna是评估7000年ABI棱镜SDS PCR仪器(应用生物系统公司、Branchburg新泽西),使用SYBR绿色PCR试剂或TaqMan PCR掌握混合。相同的PCR工具被用来分析小鼠IL-17A, il - 22生成时,干扰素-γ肿瘤坏死因子-αCXCL10 CCL2, CCL20 CXCL16, il - 6 mrna。正向和反向引物用于实时PCR SOCS3的5 - - - - - -AAGGACGGAGACTTCGATTCG-3和5 - - - - - -AAACTTGCTGTGGGTGACCAT-3 ,和LL-37 5 - - - - - -TTTTGCGGAATCTTGTACCCA-3和5 - - - - - -TCTCAGAGCCCAGAAGCCTG-3 。引物的序列β(-defensin) - HBD - 2 mRNA之前描述(26]。引物S100A7, IL-20, HPRT-1应用生物系统公司提供的(HS 00161488、HS 00218888 h 4333768,分别)。引物用于检测小鼠分子被从先前的研究27]。人类和小鼠规范化HPRT-1和mRNA水平值β分别2-microglobulin mRNA。一式三份试验得到的值是平均,和数据的意思是2−ΔΔCT±SD。
2.8。多路复用免疫测定和ELISA
媒体48 h的条件与干扰素刺激——银屑病角化细胞文化γ的存在与否或il - 22生成tofacitinib收获和过滤。同时定量测定细胞因子/趋化因子在少量的上层清液是通过使用xMAP多路复用技术实现(Luminex)和BioPlex 200系统配备磁性垫圈工作站Bio-Plex ProTM和管理软件6.1版(Bio-Rad实验室、意大利米兰)。特别是,一个人类细胞因子面板(Bio-Plex,是个正常人趋化因子40-plex面板,猫# 171 ak99mr2, Bio-Rad)是用来测量以下分析物:6 ckine / CCL21 BCA-1 / CXCL13 CTACK / CCL27, ena - 78 / CXCL5 Eotaxin / CCL11 Eotaxin-2 / CCL24 Eotaxin-3 / CCL26 Fractalkine / CX3CL1 GCP-2 / CXCL6, gm - csf, Gro -α/处于受控,Gro -β/ CXCL2、i - 309 / CCL1干扰素-γ,il - 1β2、il - 4、il - 6引发/ CXCL8, il - 10, IL-16, IP-10 / CXCL10 I-TAC / CXCL11 MCP-1 / CCL2, MCP-2 / CCL8 MCP-3 / CCL7 MCP-4 / CCL13, MDC / CCL22 MIF, MIG / CXCL9 MIP-1α/ CCL3 MIP-1δ/ CCL15 MIP-3α/ CCL20 MIP-3β/ CCL19 MPIF-1 / CCL23 SCYB16 / CXCL16 SDF-1α+β/ CXCL12 TARC / CCL17泰克/ CCL25, TNF -α后,制造商的指示。同时,CCL5测量与商用夹心酶联免疫试剂盒(研发系统)和ELISA读者3550型紫外(Bio-Rad)。银屑病角化细胞培养进行了重复使用两个不同的角化细胞菌株。数据表示的意思是pg / ml或ng / ml±SD。
2.9。IMQ-Induced Psoriasiform-Like模型
8周大雌性BALB / cJ老鼠(哈伦实验室、圣皮特al Natisone意大利)被使用在所有的实验。剃鼠标背侧皮肤治疗连续5天每天50毫克Aldara霜含有5% IMQ(梅达AB、桑纳、瑞典)。5天,治疗区域的全层皮肤活检收集8毫米活检穿孔机。皮肤是中性缓冲福尔马林固定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)进行组织病理学分析。在一些实验中,50μl Aldara奶油混合了tofacitinib(在DMSO溶液)的最终浓度10到0.5毫米。一群10小鼠被用于每个实验条件。5天,完整的皮肤是中性缓冲福尔马林固定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)进行组织病理学分析。否则,完整的皮肤在液态氮冷冻,进一步加工的RNA提取,这是由使用试剂盒试剂(表达载体)。每实验组小鼠RNA从十汇集,reverse-transcribed成cDNA、和实时PCR分析,如前所述。
2.10。组织病理学和免疫组织化学
固定的小鼠皮肤是嵌入在石蜡,组织部分deparaffinized和沾)进行组织学分析。表皮厚度和规模和细胞浸润数量分析作为参数的皮肤棘皮症和炎症。表皮和规模平均厚度被研究者忽视实验量化组织了5测量每个鼠标每三个部分。细胞渗透真皮也计入每个鼠标三个皮肤部分。免疫组织化学是由使用主要Abs与CD3 (Dako、斯特鲁普、丹麦),Ly6G, CD11c,和CD11b (BD生物科学),Ki67 (Novocastra、纽卡斯尔、英国),KRT10 (Covance) phospho-STAT3 (Tyr705)和phospho-STAT1 (Tyr701)(从细胞信号),IL-17A(研发系统)和il - 22生成(加拿大Oakdille罗福斯生物制品)和免疫反应性与二次开发的生物素化的马伯和染色包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。部分与迈耶的苏木精复染色,直观地分析了由两个在皮肤病理学家经验。积极评价5相邻领域的放大200倍。半定量的,四级评分系统应用,从消极的免疫反应性(0)强有力的免疫反应性(4 +)KRT10表皮。
2.11。稳定的角化细胞转染子
HaCaT细胞稳定转染myc/ SOCS1,myc/ SOCS2,myc/ SOCS3,或空pcDNA3(模拟)质粒之前报道(6,13]。HaCaT soc克隆服用干扰素-γ或il - 22生成时,而模拟克隆就用tofacitinib预处理,然后用干扰素刺激-γ或者在DMEM il - 22生成。
2.12。统计分析
为在体外研究,统计学意义是评估使用Wilcoxon签署等级测试(SigmaStat;Jandel圣拉斐尔、钙、美国)。的值 被认为是重要的。为在活的有机体内实验中,实验组差异的重要性(老鼠IMQ对待比老鼠接受IMQ + tofacitinb 100毫米和5毫米)被未配对学生的计算 - - - - - -测试。统计分析了棱镜v.5.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA),和值表示为均值+ SD动物。的值 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。Tofacitinib有效地抑制在干扰素- JAK / STAT-Dependent途径γ——或者IL-22-Activated角质细胞
我们最初研究tofacitinib对细胞内途径激活的影响在人类角质细胞的促炎细胞因子与银屑病的致病作用,包括干扰素-γil - 22生成,肿瘤坏死因子-α,IL-17。为此,主要从皮肤角化细胞文化建立了活检的银屑病患者( )。选择雇佣银屑病角化细胞文化从这些菌株更响应触发因素,相对于角质细胞获得健康的捐赠者,可能由于他们的遗传背景和促炎细胞因子(不同的易感性4,5]。Tofacitinib没有细胞毒性影响角质细胞即使在较高的浓度,作为测试通过测量乳酸脱氢酶的活动发布的文化(没有显示)。一小时预处理与不同剂量的tofacitinib (0.1 -10μ米)之后,角化细胞的刺激与rh IFN -文化γ(200 U /毫升),il - 22生成(50 ng / ml), TNF -α(50 ng / ml),或者IL-17 (50 ng / ml)不同时期(图1数据未显示)。Tofacitinib有效抑制干扰素-γ和il - 22生成时近端信号,减少了干扰素的磷酸化-γR、JAK1和JAK2以及IL-22R1 JAK1,但不是TYK2分别(数字1(一)和1 (b)(左)。由于近端信号抑制,下游STAT1和STAT3磷酸化是剂量依赖性抑制干扰素-γ刺激文化(图1(一),对吧)。phospho-ERK1/2激活也减少了tofacitinib,有趣的是,即使不那么有说服力地如果统计(图1(一),对吧)。类似于我们观察干扰素-γ,il - 22生成不能诱导STAT3或者ERK1/2磷酸化的tofacitinib(图1 (b),对吧)。为了评估行动的特异性的tofacitinib路径依赖木菠萝,我们分析了其对肿瘤坏死因子的信号——的影响α或IL-17,细胞因子可以激活NF -这出了名的κB和MAP激酶但不是木菠萝。如图1 (c),tofacitinib不能影响我的磷酸化κBα或p65 NF -κB亚基、ERK1/2 TNF -的反应α。相比之下,tofacitinib STAT3激活诱导减少了TNF -α,即使在一个较低的程度如果相比,观察干扰素-γ——或者IL-22-treated样本。值得注意的是,tofacitinib不能调节信号通路激活IL-17在角质细胞,包括NF -κ(数据未显示)。最后,tofacitinib强有力地减少了干扰素-γ——或者IL-22-induced transactivation STAT1 -或STAT3-binding发起人在角质细胞,作为评估文化与干扰素-转染γ诱导记者质粒,pGAS-Luc或IL-22-inducible记者质粒,分别pLucTKS3(图1 (d))。作为一个整体,这些数据表明tofacitinib完全废除JAK / STAT通路激活干扰素-γ和人类银屑病角质细胞il - 22生成,而不能影响JAK-independent分子通路,如激活TNF -γ或IL-17。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。分析Tofacitinib对干扰素引起的额外的分子途径的影响γ或者在角化细胞il - 22生成的文化
我们接下来决定蛋白质磷酸化的角化细胞文化接受刺激干扰素-γ、il - 22生成或TNF -α20分钟,进行预处理与tofacitinib与否。这个分析是由使用一个商业phospho-kinase数组工具(见材料与方法),检测细胞内激酶和信号节点分子,包括一种蛋白激酶,AMPKα,HSP27 mTOR坏,p53,物,p38, PARP,和半胱天冬酶3,除了STAT1和STAT3,特别是激活干扰素-γ和il - 22生成。如图2,tofacitinib可以显著降低干扰素-γ端依赖的一种蛋白激酶磷酸化upregulation Thr308和Ser473残留物,AMPKα,PARP p38和半胱天冬酶3,除了STAT1和STAT3(数据未显示)。在平行,减少一种蛋白激酶磷酸化Thr308和Ser473残留,AMPKα,HSP27 mTOR p38、物和STAT3,激活il - 22生成治疗角化细胞文化(图2)。然而,tofacitinib这些额外的分子途径的抑制弱如果相比,观察统计,TNF -α全身的细胞内激酶模式不能受到tofacitinib治疗,除了STAT3(图2)。
3.3。Tofacitinib在角化细胞增殖、分化和凋亡过程
我们评估是否tofacitinib监管的角化细胞生长和增殖,分化和细胞凋亡在银屑病角化细胞文化( )。细胞用tofacitinib预处理(5μ米)1 h,然后用干扰素刺激-γ、il - 22生成或TNF -α48 h。正如之前报道的(13,17),干扰素-γ减少扩散角化细胞文化而il - 22生成增强通过抑制终端分化等过程。tofacitinib coadministered时,这些细胞因子在角化细胞增殖的影响完全恢复(图3(一个))。同样,tofacitinib可能大大废除IL-22-induced抑制分化,以及干扰素-γ全身的细胞凋亡的角化细胞(数字3 (b)和3 (c))。相比之下,TNF - tofacitinib没有影响γ全身的过程在角质细胞,特别是细胞凋亡,如图3 (c)。
(一)
(b)
(c)
3.4。监管Psoriasis-Related炎症分子的表达Tofacitinib角质细胞
然后我们评估tofacitinib能否影响角化细胞干扰素引起的炎症基因的表达γ或通过JAK / STAT通路il - 22生成。为此,各种分子的表达参与皮肤炎症的感应和控制研究了cytofluorimetry, bioplex多元分析和实时PCR分析银屑病角化细胞的文化用tofacitinib预处理,然后与rh il - 22生成或干扰素刺激γ。我们发现tofacitinib大大降低干扰素-γ全身ICAM-1, HLA-DR膜分子MHC类,和大量的炎症介质,包括CX3CL1,处于受控,CXCL8, CXCL10, CCL1, CCL2, CCL5, MIF趋化因子,il - 6, SOCS3 mRNA(表1)。同样,tofacitinib可能下调IL-22-induced CX3CL1, CXCL8, CXCL12, CCL2趋化因子,以及IL-20 SOCS3的角化细胞文化(表2)。引起的炎症分子TNF -α或IL-17不能受tofacitinib(数据没有显示)。因此,tofacitinib治疗可能会影响基因的表达,STAT-dependent调控在转录水平。
3.5。分析Tofacitinib对牛皮癣的IMQ-Induced小鼠模型的影响
IMQ-induced皮炎小鼠可以作为一个模型分析的致病机制参与银屑病(28]。在这个模型中,一个主要的角色IL-23 IL-17 / il - 22生成轴已经证明,与IL-22-deficient IMQ引起的小鼠抗银屑病发展(29日]。因此,tofacitinib的影响,研究了在这个模型中,与药物一起服用IMQ 5天,在两个不同浓度(0.5和10毫米)。如图4,tofacitinib大大恢复IMQ-treated psoriasiform显形的老鼠(图4(一)),即使在低剂量,减少psoriasiform迹象,包括厚度、表皮和规模的量化评估这些参数对图像的平均值)的皮肤部分染色(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。Tofacitinib真皮也减少了广泛的炎性浸润,与控制(数字4 (b)和4 (e))。此外,tofacitinib管理导致剂量依赖性降低CD3的数量+T淋巴细胞,Ly6G+中性粒细胞,CD11c+树突细胞,CD11b+巨噬细胞浸润真皮,角化细胞的增殖标记Ki67(图5)。相反,compartimentalization和表达分化的标志,如KRT10,而弱IMQ-treated suprabasal层表皮的老鼠,被药物治疗(图恢复5)。值得注意的是,tofacitinib大幅减少phospho-STAT3和phospho-STAT1小鼠皮肤表皮细胞的细胞核中存在剂量依赖的相关性(图6(一)),药物浓度越高责任phospho-STAT3几乎完全消失+还原(~ 80%)和STAT1+还原细胞(~ 95%)IMQ-treated老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
(C)
自IL-17——IL-22-producing白细胞的致病过程中涉及相关IMQ-induced psoriasiform反应(28 - 30),这些细胞和角化细胞积极参与招聘lesional皮肤,我们调查tofacitinib影响IL-17——和IL-22-producing细胞成老鼠的存在皮肤和趋化因子的表达可能参与招聘。免疫组织化学和实时PCR IL-17A和il - 22生成时,连同干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α信使rna分析(图6 (b)),表明tofacitinib IL-17的数量减少+或il - 22生成+细胞IMQ-treated肌肤,持续显著减少IL-17和il - 22生成mRNA水平。相比之下,无论是干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α信使rna表达可以明显影响tofacitinib应用程序(图6 (b))。值得注意的是,这两个IL-17+和il - 22生成+细胞群主要是巨噬细胞和树突细胞样的形态,类似于CD11c CD11b-stained细胞(图5)。最后,我们分析了在小鼠皮肤活检keratinocyte-derived趋化因子的表达实时PCR分析。趋化因子的显著减少,如CCL2, CXCL16, CCL20, il - 6,后被发现的应用tofacitinib(图6 (c))。tofacitinib的影响没有对CXCL10或其他角化细胞趋化因子的表达是严格依赖于干扰素-γ(图6 (c)和数据未显示)。
tofacitinib巧克力摄入量有关(数据的影响4- - - - - -6),并没有改变所有的标记分析观察到治疗小鼠皮肤光靠tofacitinib(没有显示)。
3.6。Tofacitinib SOCS1或SOCS3损害相同的分子途径干扰素-γ——或者IL-22-Activated角质细胞
在银屑病角质细胞,SOCS1 SOCS3分子作为内源性细胞因子信号抑制因子和功能通过直接抑制JAK1和JAK2蛋白质,从而阻碍统计激活(13,16]。这部分的研究调查了tofacitinib能否抑制相同的分子途径抑制SOCS1和SOCS3的角质细胞。为此,比较主要的分子途径激活干扰素-γ和il - 22生成在角化细胞进行overexpressing SOCS1或SOCS3 tofacitinib-treated模拟克隆。SOCS2克隆被用作消极的控制,在这些细胞中,干扰素-γ或il - 22生成信号不受SOCS2转基因存在(13]。稳定的角化细胞克隆表达soc以前生成的在我们的实验室,如前所述[6,13- - - - - -15]。SOCS3 SOCS1, SOCS2克隆( 为每个)检测转基因内容和水平,然后,激活干扰素-γ或il - 22生成(图7(一))。同时,模拟克隆( )一起服用tofacitinib干扰素-γ或il - 22生成。STAT3磷酸化STAT1的表达模式,和ERK1/2干扰素-γ——或者IL-22-treated模仿克隆在银屑病角质细胞与诱导,tofacitinib有效地抑制这些信号转导途径(数字7 (b)和7 (c))。类似tofacitinib, SOCS1或SOCS3转基因决定STAT1的障碍和STAT3激活干扰素-γ分别在il - 22生成反应,STAT3(数字7 (b)和7 (c))。最后,发现phospho-ERK1/2被有效地抑制在模拟克隆tofacitinib符合其upregulation IFN -的缺失γ——或者IL-22-treated SOCS1和SOCS3克隆(数字7 (b)和7 (c))。正如所料,SOCS2不能调节分子途径引发的干扰素-γ在角化细胞克隆和il - 22生成。
(一)
(b)
(c)
作为一个整体,这些数据表明tofacitinib类似SOCS1 SOCS3,针对木菠萝,可以损害相同的角化细胞胞内cytokine-dependent通路。
4所示。讨论
越来越多的证据表明,木菠萝蛋白质是一个潜在的目标免疫抑制药物对牛皮癣和其他免疫介导性皮肤疾病,特别是那些引起表皮角化细胞暴露于大量的促炎细胞因子,包括干扰素-γ和il - 22生成15,16,30.]。近年来,小分子激酶抑制剂已经开发和广泛调查的不同病理条件下(22,24,30.]。其中,激酶抑制剂tofacitinib显示改善临床结果是严重银屑病患者(19,21,24]。最近的一项研究对其影响银屑病患者显示一个戏剧性的和快速关闭phospho-STAT1 phospho-STAT3 downstream-regulated基因表皮和减少病理lesional皮肤t细胞和树突状细胞数量,以及表达IL-17, il - 22生成和干扰素-γ(24]。
本研究旨在了解炎症分子通路(s)激活可以通过tofacitinib专门抑制银屑病角质细胞。我们发现这种药物完全废除JAK / STAT通路激活干扰素-γ在实验和il - 22生成时,评估在体外和在活的有机体内牛皮癣的模型。这些研究结果非常重要,因为干扰素-γ和炎性细胞因子il - 22生成深入参与银屑病的发病机制,当他们刺激角化细胞增殖,损害他们的分化,促进炎症反应“前馈”。Tofacitinib抑制是施加特别JAK1和JAK2 TYK2但不,,作为结果,干扰素-γ和il - 22生成受体磷酸化,以及近端细胞因子信号导致STAT1和STAT3磷酸化,受损。这些影响具体的干扰素-γ在TNF和il - 22生成时无法观察到α或IL-17信号。这并不令人感到意外,因为TNF -α和IL-17不通过JAK / STAT信号细胞,激活分子途径涉及TRAF2 TRADD / NF -κB或TRAF2 TRADD / MAPK和Act1 / TRAF6 / NF -κB (11,12]。相比之下,我们发现TNF -α诱导STAT3在角化细胞激活,由tofacitinib部分抑制产生影响。这个结果可以解释为直接行动的tofacitinib JAK-dependent信号激活TNF -α全身的细胞因子(例如il - 6),这可能反过来激活STAT3自分泌环。有趣的是,tofacitinib也抑制磷酸化ERK1/2诱导干扰素-γ或il - 22生成,但并不是说提升TNF -α。这种二分法可以依赖的事实ERK1/2激活干扰素-γ或il - 22生成由木菠萝,而TNF -α借磷酸化的ERK1/2下游TRAF2 / TRADD [12]。
发现了一些不正常的细胞内信号通路在银屑病角质细胞除了STAT1和STAT3,包括NF -κp38 AP-1 B -————, ERK1/2 kinase-activated通路(4]。额外的分析细胞内激酶分子和信号节点表明tofacitinib也降低了干扰素-γ端依赖upregulation Akt, AMPKα,PARP p38和半胱天冬酶3 IL-22-dependent Akt, AMPKα,HSP27 mTOR p38和物。然而,tofacitinib抑制对这些分子途径的影响最小,如果相比观察STAT1和STAT3指示木菠萝的辅助行动或间接移植这样的途径。再次,肿瘤坏死因子-α全身的细胞内激酶模式不能受到tofacitinib,除了这些途径依赖木菠萝而不是TRAF2 / TRADD。
另一部分的研究旨在评估tofacitinib这些生物过程的影响,在银屑病表皮(即发生了深刻的变化。、增殖、分化和凋亡)由于干扰素的有害影响γ和il - 22生成6,17]。在这种背景下,我们证明了tofacitinib减少核扩散和去分化促进角质细胞il - 22生成。这些研究结果证实在IMQ在活的有机体内小鼠银屑病模型,表皮增生、分化、改变和炎症主要是il - 22生成/ STAT3-dependent [29日]。并发tofacitinib治疗导致的表皮STAT3的表达,减少扩散标记,并增加生产分化的标志。有趣的是,tofacitinib还中和细胞抑制剂和proapoptotic干扰素——的影响γ角化细胞,可能通过STAT1的抑制,调节这些影响。然而,抑制干扰素-γ端依赖抗增殖影响角质细胞可能不是战略hyperproliferative障碍,如牛皮癣,虽然干扰素-γ可以诱发大规模的银屑病干细胞增殖,其注入prelesional银屑病皮肤导致表皮增生和斑块发展(31日,32]。干扰素-γ信号和1型t细胞被证明psoriasiform表型的表达参与IMQ老鼠只是部分(28]。尽管如此,我们发现phospho-STAT1 IMQ-treated皮肤的局部表皮角化细胞的细胞核,tofacitinib完全抑制其表达。,这是合理的抑制STAT1和STAT3,间接负责减少炎性浸润,由于减少STAT1 -和/或STAT3-dependent基因表达角质细胞的趋化因子如CXCL10,处于受控,CXCL8, CCL2, CCL5,和免疫调节分子,包括ICAM-1和MHC I和II类。因此,t细胞,中性粒细胞,树突细胞,巨噬细胞亚群可以不再积累在皮肤IMQ-treated tofacitinib的存在。干扰素-γ全身的,但不是IL-22-induced il - 6和IL-20 psoriasis-related细胞因子被这种药物抑制。值得注意的是绝大多数的炎症分子诱导il - 22生成的角化细胞不能被tofacitinib表达下调,除了CX3CL1 CXCL8趋化因子。同时,IL-22-dependent抗菌分子不能影响。相比之下,SOCS3 mRNA表达被tofacitinib完全废除,因此与我们先前的调查结果,STAT3-silenced角质细胞无法移植SOCS3回应il - 22生成(17]。
重要的是,IL-17——IL-22-producing细胞强烈降低木菠萝封锁在IMQ-treated皮肤,同样观察到人类牛皮癣,改善临床和组织学的迹象tofacitinib IL-17基因表达的抑制和IL-23 / Th17途径[24]。相比之下,无论是干扰素-γ和肿瘤坏死因子-αtofacitinib mRNA表达的影响。免疫组织化学分析也表明,IL-17+和il - 22生成+细胞在老鼠的皮肤主要是巨噬细胞和树突细胞样的形态,因此最近的发现显示的存在和致病性IL-23-bearing和IL-17 / IL-22-producing IMQ模型中的巨噬细胞和树突状细胞亚群(33]。并行,tofacitinib决定强烈减少keratinocyte-derived致病性白细胞的趋化因子参与招聘数量通过CCR2或CCR6 CCL2和CCL20等。尽管tofacitinib强有力地表达下调在角化细胞趋化因子表达,反过来,白细胞招募到老鼠的皮肤,其效果很可能可以直接说清楚在17到22型t细胞分化,通过干扰IL-23R信号和随后IL-17 / il - 22生成感应[23]。然而,重要的是要突出IL-17的有限的存在,与T-cell-like IL-22-producing细胞形态学在小鼠皮肤IMQ应用程序的5天。
最后,我们证明了tofacitinib soc,特别是SOCS1 SOCS3,针对相同的信号分子,或JAK1和JAK2,可以在角化细胞损害相同的细胞内途径。事实上,STAT1, STAT3和ERK1/2没有调节角化细胞克隆overexpressing SOCS1或SOCS3干扰素-的反应γ,也不是STAT3和ERK1/2 il - 22生成时,同样废除细胞因子诱导的STAT1 tofacitinib, STAT3和ERK1/2控制克隆。这些结果都是因为tofacitinib和SOCS1/3法案与高度的木菠萝激酶组选择性和显示相同的木菠萝最后生化影响失活。事实上,tofacitinib以及SOCS1/3阻碍汽车转磷酸的木菠萝,JAK1-2-3第一阻塞ATP结合位点和与ATP(竞争34],SOCS1/3 -GQM-amino酸性残基的相互作用木菠萝,行列式为其绑定到基板(35]。重要的是,尽管tofacitinib与木菠萝但不是TYK2, SOCS1 SOCS3可以绑定和灭活JAK1, JAK2和TYK2但不是JAK3。证据表明tofacitinib SOCS1/3可以有相同的角化细胞的抗炎作用也来自我们的最近的研究表现和两个小肽模仿SOCS1 SOCS3和分享激酶抑制的关键区域JAK1和JAK2失活。tofacitinib相似,这两个peptido-mimetics能够关掉干扰素-γ——IL-22-dependent炎症/免疫反应的角质细胞在皮肤疾病环境中以干扰素-的存在γ释放Th1和IL-22-releasing Th22渗透,分别如银屑病、皮肤鳞状细胞癌(15,16]。
5。结论
作为一个整体,我们的研究证明了tofacitinib的选择性和特异性抑制作用在细胞内的分子途径依赖干扰素-γ并在角化细胞il - 22生成。干扰素-的封锁γ/ JAK1 JAK2 / STAT1 / STAT3和il - 22生成/ JAK1 / STAT3通路有重要的结果抑制许多干扰素的表达γ端依赖炎性基因,以及恢复增殖和分化程序改变银屑病角质细胞il - 22生成。考虑到表皮角化细胞最外层的皮肤组件,tofacitinib有强大的抑制作用由这些细胞所引起的炎症反应,它可以包含在配方的局部治疗牛皮癣。激酶抑制剂的应用可能是有用的疾病,特别是在chronicization干扰素-γ端依赖t细胞反应占主导地位。事实上,局部治疗的疗效tofacitinib牛皮癣和其他激酶抑制剂已被广泛证明(36),也被认为是治疗其他的炎症性皮肤病,其特征是木菠萝hyperactivation、扁平苔癣、皮炎等(37]。
重要的是,tofacitinib抑制活动也可以直接阐述类型17和1型t细胞,阻碍他们的分化和扩张。事实上,Th17细胞分化是废除STAT3的缺席,而过度的一种持续活跃的STAT3的结果在IL-17-producing细胞数量大大增加38,39]。同样,STAT1十分Th1细胞激活,主要是为了应对干扰素-γ,这是关键的生成和维护Th1免疫(23]。
由于异质性的致病机制操作在牛皮癣,和各种各样的分子级联潜在的促炎细胞因子激活、木菠萝抑制剂和TNF -α或者IL-17阻滞剂可能引起更有利和有效的牛皮癣患者的治疗效果,通过拦截和阻断炎症反应在多个水平。
最后,局部或全身性JAK / STAT tofacitinib抑制的关键发展的优化也疗法治疗皮肤肿瘤的特点是异常的il - 22生成信号和STAT3在角化细胞活化。后者包括basalioma和鳞状细胞癌,IL-22-producing T细胞激活肿瘤生长和异常上皮癌形成通过STAT3 (16)。
数据可用性
所有的数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章中,除了数据(1)tofacitinib影响IL-17培养角质细胞信号转导;(2)tofacitinib影响phospho-STAT1表达式,发现通过使用phospho-kinase阵列设备;(3)tofacitinib影响tnf -或者IL-17-induced由角化细胞炎性分子的表达;(4)对CD11c tofacitinib影响+树突细胞浸润IMQ-treated小鼠皮肤的真皮。后者数据可从相应的作者。
的利益冲突
克里斯蒂娜Albanesi赢得了炎症Aspire 2015个研究奖,一项竞争性赠款项目由辉瑞公司调查人员在欧洲。所有其他作者宣称他们没有利益冲突。
确认
这项工作是由炎症Aspire 2015年研究奖授予由辉瑞和意大利卫生部。设施的技术支持对于复杂的蛋白质混合物(CPM)分析ISS(意大利罗马)是和善的承认。我们感谢博士Saveria帕斯托雷的批判阅读手稿。